高考生物一轮复习 选修1 第1讲 无菌操作技术实践学案 苏教版Word文档下载推荐.docx

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2．大肠杆菌的接种与分离培养

（1）配制牛肉膏蛋白胨培养基

其操作步骤：

配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。

（2）斜面接种和培养大肠杆菌

①主要目的：

菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。

②主要步骤：

准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37℃恒温箱中培养大肠杆菌24h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中（4℃）保存。

（3）平板划线分离和培养大肠杆菌

①平板的作用：

培养、分离细菌等微生物。

②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。

1．选择无菌技术的原则

（1）考虑无菌技术的效果：

灭菌的效果比消毒要好。

（2）考虑操作对象的承受能力：

活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。

2．微生物的培养基

（1）培养基的成分

营养要素

来源

功能

碳源

无机碳源

CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物

a.构成细胞物质和一些代谢产物

b.既是碳源又是能源（有机碳源）

有机碳源

糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等

氮源

无机氮源

无机氮：

NH3、铵盐、硝酸盐、N2等

合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物

有机氮源

牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸

生长因子

维生素、氨基酸、碱基

a.酶和核酸的组成成分

b.参与代谢过程中的酶促反应

水

培养基、大气、代谢产物

不仅是良好的溶剂，还是结构物质

无机盐

培养基、大气

细胞内的组成成分，生理调节物质；

某些化能自养型细菌的能源；

酶的激活剂

（2）根据理化性质对培养基的分类

种类

特点

应用

物理

性质

液体培养基

不加凝固剂

工业生产

固体培养基

加凝固剂

微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏

化学

成分

天然培养基

含化学成分不明的天然物质

合成培养基

培养基成分明确或用一定化学物质配制

分类、鉴定

（3）根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基

类型

实例

选择培养基

培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌

培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌

以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌

不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物

石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的

培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物

鉴别培养基

伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌（菌落呈黑色）

1．大肠杆菌纯化方法的比较

主要方法

平板划线法

稀释涂布平板法

纯化原理

通过接种环在琼脂固体培养基的表面连续划线操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面

将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释度足够高时，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞

主要步骤

平板划线操作

系列稀释操作和涂布平板操作

接种工具

接种环

涂布器

2．某同学在利用稀释涂布平板法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？

为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？

并说明理由。

[提示]　最可能的原因是菌液浓度过高（土壤溶液稀释不够）。

不可以，因为抗生素不但能杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。

考查无菌技术和培养基成分及分类

1．在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。

回答下列问题：

（1）在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________（填“可以”或“不可以”）放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

（2）牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_____________________。

（3）密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_________________，在照射前，适量喷洒__________，可强化消毒效果。

（4）水厂供应的自来水通常是经过________（填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”）消毒的。

（5）某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_____________。

[解析]　

（1）在实验室中，能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属材质的实验器具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。

（2）巴氏消毒法或高温瞬时消毒法与煮沸消毒法相比，其优点表现为在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。

（3）紫外线照射能消毒的原因是其能够破坏微生物细胞中的DNA分子。

在利用紫外线照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可强化消毒效果。

（4）自来水通常采用氯气消毒。

（5）采用高压蒸汽灭菌时，若压力达到设定要求，而温度未达到相应要求，最可能的原因是没有排尽高压蒸汽灭菌锅内的冷空气。

[答案]　

（1）可以　

（2）在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少　（3）破坏DNA结构　消毒液　（4）氯气　（5）未将锅内冷空气排尽

2．（2019·

江西赣中南五校第一次联考）下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。

蛋白胨

乳糖

蔗糖

K2HPO4

指示剂

琼脂

含量（g）

10.0

5.0

2.0

0.2

12.0

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL

（1）从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于__________。

（2）若根据用途划分，该培养基属于__________（填“选择”或“鉴别”）培养基。

若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？

________________，并用__________作为指示剂。

（3）在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行__________；

操作者的双手需要进行清洗和__________。

（4）图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：

______________和______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的__________。

图1　　　　　图2

[解析]　

（1）大肠杆菌只能从环境中摄取有机物，不能自己合成有机物，属于分解者。

（2）该培养基中含有指示剂，属于鉴别培养基。

尿素分解菌可以分解尿素，而其他微生物不能，因此可将培养基中的蛋白胨改为尿素用于筛选土壤中的尿素分解菌，并用酚红作为指示剂，尿素分解菌分解尿素产生了NH3可使酚红变红。

（3）培养微生物时，培养基和培养皿需要灭菌，操作者双手需要进行消毒。

（4）图1采用的是稀释涂布平板法，图2采用的是平板划线法。

单个微生物细胞繁殖所形成的细胞群叫菌落。

[答案]　

（1）分解者　

（2）鉴别　将蛋白胨改成尿素　酚红　（3）灭菌　消毒　（4）稀释涂布平板法　平板划线法　菌落

　消毒和灭菌

项目

条件

结果

常用方法

应用范围

消毒

较为温和的物理或化学方法

仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物

煮沸消毒法

日常用品

巴氏消毒法

不耐高温的液体

化学药剂消毒法　

用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源

灭菌

强烈的理化因素

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

灼烧灭菌法

干热灭菌法

玻璃器皿、金属工具

高压蒸汽灭菌法　

培养基及容器的灭菌　

考查微生物的纯化技术

3．（2019·

四川省资阳市高三诊断）土壤有“微生物的天然培养基”之称。

如图是某同学分离和培养土壤中微生物的部分操作步骤和实验结果示意图。

（1）利用固体培养基培养土壤中的微生物时，除考虑各种营养条件外，还需要控制的培养条件有____________________（至少写两点）等。

接种前应该先检测固体培养基是否被污染，检测的具体方法是_____________________________________________________。

（2）图示中用平板划线法接种的操作顺序是A→B→__________；

以上操作步骤中存在明显错误的是________（用字母表示），该操作的正确方法是________________________。

（3）实验室利用平板划线法来分离样品中的目的菌时，每次划线之前都要对接种环进行灭菌，目的是_______________。

在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是____________________________。

[解析]　

（1）若用该培养基培养土壤中的微生物，除考虑各种营养条件外，还要考虑温度、pH、氧气、无菌和渗透压等条件。

检测固体培养基是否被污染的方法是将未接种的培养基在适宜的环境中放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。

（2）图示是平板划线法接种操作示意图，由以上分析可知，其操作顺序是A→B→E→D→C→F；

为了防止杂菌污染，接种应该在酒精灯的火焰旁进行，因此以上操作中存在错误的步骤是C。

（3）平板划线法操作时，每次划线之前都要对接种环进行灭菌，目的是杀灭上次划线接种环上残留的菌种。

在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，能够使菌种的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能够得到单菌落。

[答案]　

（1）温度、pH、氧气、无菌　将未接种的培养基在适宜的环境中放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生　

（2）E→D→C→F　C　在酒精灯的火焰旁划线　（3）杀灭上次划线接种环上残留的菌种　使菌种的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终能够得到单菌落

4．（2019·

宜宾市高三月考）土壤中的苯酚（C6H5OH）对环境有极大的污染，实验室希望能从土壤中分离出能专一性降解苯酚的微生物，如图是部分实验过程。

（1）为了分离纯化目的菌种，①～④步骤的培养基中都加入了一定浓度的苯酚，该物质能为微生物提供________，除此而外，培养基中一般还需要水、______________________等营养物质。

（2）制备步骤④所需要的固体培养基的操作顺序：

计算→称量→________→________→倒平板。

为了在步骤⑤的平板上形成单个的菌落，涂布平板前，需要对培养液进行多次稀释，原因是_________________。

（3）研究人员想通过比较试管甲和乙中微生物的生长情况，来证明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源，若甲试管中的液体培养基中的唯一碳源是苯酚，那么，乙试管中培养基成分与甲相比，区别是___________________。

研究人员对甲、乙两支试管进行接种时，所选菌种都来自步骤⑤平板上的同一个单菌落，这样做的目的是_______________。

[解析]　

（1）为了分离能专一性降解苯酚的微生物，①～④步骤的培养基中需要加入苯酚作为唯一碳源，另外培养基中一般还需要水、氮源、无机盐等营养物质。

（2）制备培养基的操作顺序是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物易于分散成单个细胞，故涂布平板前，需要对培养液进行多次稀释。

（3）研究人员想通过比较试管甲和乙中微生物的生长情况，来证明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源，若甲试管中的液体培养基中的唯一碳源是苯酚，那么，乙试管中应该加入其他碳源，比较甲、乙试管中微生物的生长情况，若甲试管中微生物可以生长，乙试管中微生物不能生长，说明分离出来的微生物只能以苯酚作为碳源。

为了保证甲、乙两支试管中的微生物种类是相同的，对甲、乙两支试管进行接种时，所选菌种都来自步骤⑤平板上的同一个单菌落。

[答案]　

（1）碳源　氮源和无机盐　

（2）溶化　灭菌　在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物易于分散成单个细胞　（3）用其他碳源替代苯酚　保证甲、乙两支试管中的微生物种类是相同的

分离特定的微生物并测定其数量

1．分离特定微生物的知识准备

（1）区分涂布平板法和混合平板法

①区分两种平板法过程图

②结果不同

a．涂布平板法：

细菌菌落通常仅在平板表面生长。

b．混合平板法：

细菌菌落出现在平板表面及内部。

③目的相同：

分离各种目的微生物。

（2）选择培养分离

①原理：

不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。

②方法：

针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。

③用途：

从众多微生物中分离出特定的微生物。

（3）菌落

①概念：

单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。

②特征：

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。

2．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

（1）培养基

采用唯一氮源为尿素的培养基。

（2）统计菌落数目

统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

（3）实验流程

土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

3．纤维素分解菌的筛选

（1）原理

　　　　　　　　　　纤维素分解菌

　　　　　　　　　　　　↓

―→红色复合物

红色消失，出现透明圈。

（2）筛选方法：

刚果红染色法。

（3）培养基：

以纤维素为唯一碳源的选择培养基，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

（4）实验流程

：

富含纤维素的环境

　↓

用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

制备系列稀释液

将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

产生透明圈的菌落

4．显微镜直接计数法

（1）原理：

利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

（2）缺点：

不能区分死菌还是活菌。

（3）1mL培养液中菌体的总数换算公式为：

①16×

25型的血球计数板：

1mL悬液中待测标本（菌体）数＝

×

400×

104×

稀释倍数。

②25×

16型的血球计数板：

1．平板划线法在不同阶段灼烧接种环的目的

（1）第一次操作：

杀死接种环上原有的微生物。

（2）每次划线之前：

杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。

（3）划线结束后：

杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

2．稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。

这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。

3．平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

4．目的微生物选择的三种方法

（1）利用平板划线法或稀释涂布平板法接种在固体平板培养基上，根据目的微生物特定的菌落特征挑选目的微生物。

（2）利用选择培养基直接筛选目的微生物。

（3）利用鉴别培养基鉴别筛选目的微生物。

1．测定活菌的数量时不用平板划线法，请说出其中的原因。

[提示]　用平板划线法接种时，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个活菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个或多个活菌繁殖而成，还有一些不能形成菌落，而在计数时一个菌落对应着一个活菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌的数量。

2．研究人员用含有刚果红的培养基培养纤维素分解菌时，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图所示。

据图回答以下问题：

（1）简述透明圈的形成过程。

[提示]　刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，形成透明圈。

（2）推测与图中透明圈大小有关的因素主要是什么？

降解纤维素能力最强的菌种是哪种？

[提示]　纤维素酶的产量和活性。

菌落①所代表的菌种。

3．甲、乙同学测定泡菜滤液中微生物的浓度。

在对应稀释倍数为105的培养基中，得到以下两种统计结果：

甲同学在该浓度下涂布了平板，统计的菌落数为49；

乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为43、54、287，然后取其平均值128作为统计结果。

请评价这两位同学的实验结果的有效性，并说明理由。

[提示]　

（1）甲同学的实验结果是无效的，因为没有设置重复实验，结果不具有说服力。

（2）乙同学的实验结果是无效的，因为一个平板上的菌落计数结果与另外两个相差太大。

考查微生物的选择培养

1．（2019·

河南省天一大联考）某科研小组欲从兔粪中分离、筛选出分解纤维素能力强的菌种，为此开展了相关实验。

请回答下列问题：

（1）纤维素是由______________组成的大分子多糖，是构成植物_____________的主要成分。

（2）制备培养基：

分别称量羧甲基纤维素钠（CMCNa）5g、（NH4）SO42g、MgSO4·

7H2O0.25g、KH2PO40.5g，放入锥形瓶中，溶解后，加蒸馏水定容到500mL。

用锥形瓶塞塞紧，用报纸和橡皮筋包扎好，灭菌，然后倒平板。

根据用途划分，该培养基属于_____________培养基，若要利用此培养基分离并获得纤维素分解菌的菌落，还应在培养基中加入的物质是______________；

培养皿灭菌常采用的两种方法是________________________；

将新鲜的兔粪样品溶解于无菌水中，然后接种到培养基上，常用的接种方法是________________________________________。

（3）培养72小时后，采用________染色法进一步筛选分解纤维素能力强的菌株。

染色后，用游标卡尺测定____________直径（D）和菌落直径（d），选择D/d值较大的菌落进行后续研究。

（4）纤维素酶活性的测定方法一般是_____________。

[解析]　

（1）纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，其基本组成单位是葡萄糖。

（2）分离和纯化分解纤维素的菌株的培养基是选择培养基，分离并得到菌落要用固体培养基，需在培养基中加入琼脂；

培养皿灭菌可采用的方法有高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法。

（3）筛选纤维素分解菌可用刚果红染色法，D/d值较大的菌落，产纤维素酶的能力强。

（4）纤维素酶活性的测定方法一般是对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

[答案]　

（1）葡萄糖　细胞壁　

（2）选择　琼脂　高压蒸汽灭菌法和干热灭菌法　平板划线法或稀释涂布平板法　（3）刚果红　透明圈　（4）对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定

河北省衡水中学高三联考）某种产脂肪酶菌常被用作饲料添加剂。

下表是从土壤中初筛该菌的培养基配方，请回答下列问题：

（NH4）2SO4

NaCl

MgSO4·

7H2O

1%橄榄油

蒸馏水

pH

0.1g

0.05g

0.01g

10g

4mL

定容至100mL

7.0

（1）在上述培养基中，橄榄油能为产脂肪酶菌提供__________。

为增大产脂肪酶菌的浓度，需用该培养基进行富集培养，富集培养基宜选用液体培养基的原因是_____________________。

（2）用涂布平板法分离产脂肪酶菌时，在上述培养基的基础上，还应加入________和溴甲酚紫（在碱性条件下呈紫色，在酸性条件下呈黄色）。

在平板上产脂肪酶菌落的周围会出现黄色圈，原理是__________________________________________。

筛选时常选择菌落大、黄色圈直径大的菌落，二者分别说明_____________________。

（3）菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。

在平板上，有的菌落较小，呈乳白色，表面光滑，无丝状物，这些菌落可能为________（填“细菌”或“霉菌”）。

有的菌落连成一片，形成原因最可能是________________________。

（4）研究发现，在饲料中添加产脂肪酶菌剂后，动物的体重明显增加，这说明_____________________________。

[解析]　

（1）橄榄油是本培养基中的唯一碳源，能为产脂肪酶菌提供碳源。

由于液体培养基能增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间，所以进行富集培养时宜选用液体培养基。

（2）用涂布平板法分离产脂肪酶菌时所用的培养基为固体培养基，所以在上述培养基的基础上，还应加入琼脂等凝固剂。

脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸呈酸性，能使溴甲酚紫变为黄色，因此在平板上产脂肪酶菌落的周围会出现黄色圈。

菌落大，说明菌体繁殖能力强；

黄色圈直径大，说明所产脂肪酶的活性高或产脂肪酶能力强。

（3）菌落无丝状物，说明此菌落不是霉菌。

若接种菌液的浓度过高，则会导致菌落在平板上连成一片。

（4）在饲料中添加产脂肪酶菌剂后，因脂肪酶能催化脂肪水解，有利于脂肪的吸收，即脂肪酶菌剂能提高饲料转化率（利用率），导致动物的体重明显增加。

[答案]　

（1）碳源　液体培养基能增大菌体与培养基的接触面积，为菌株的生长和繁殖提供更多的营养和空间　

（2）琼脂　脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸使溴甲酚紫变为黄色　菌体繁殖能力强、脂肪酶活性高（产脂肪酶能力强）　（3）细菌　接种菌液的浓度过高

（4）脂肪酶菌剂能提高饲料转化率（利用率）

考查微生物的分离与计数

成都市高三诊断）将葡萄球菌在含卵黄的固体培养基上培养时，葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，形成的菌落周围会出现特有的乳白色乳浊环。

某兴趣小组欲通过实验室培养和计数来检测某果汁中的葡萄球菌密度。

（1）配制分离葡萄球菌的培养基时，在培养基中加入一定量的卵黄液，卵黄液除了能给微生物提供________、水和无机盐等营养物质外，还具有的作用是______________________________。

在配制培养基时若加入高浓度的Na