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重金属
Pb2++S2ˉ→PbS↓(黄-黑)均匀混悬液
醋酸缓冲液(pH3.5)
10~20/27ml(标准液1~2ml)
硝酸铅(10ugPb/ml)
砷盐
AsO33-+3Zn+9H+→AsH3↑
AsH3+2HgBr2(试纸)→砷斑
2ug/反应液中(标准砷液2ml)
三氧化二砷(1ugAs/ml)
三、氯化物、硫酸盐、铁、重金属中加酸的作用及干扰处理
加酸的作用
供试品不澄明
供试品有色
氯化物
加速AgCl↓,产生好的乳浊,避免Ag2CO3↓,Ag2O,Ag3PO4的形成
用含硝酸的水洗净滤纸中Clˉ后过滤供试液
内消色法或外消色法
硫酸盐
防止BaCO3↓,Ba3(PO4)2↓形成
用含盐酸的水洗净滤纸中SO42-后过滤供试液
铁盐
防止Fe3+水解。
Fe2+无反应,加过硫酸铵氧化Fe2+→Fe3+
标准液与样品液色调不一致,用正丁醇或异戊醇提取红色产物
PbS↓完全。
若酸度增大,呈色变浅,甚至不呈色。
加稀焦糖液或用内消色法
注:
重金属定义、ChP收载4种方法。
古蔡法和Ag(DDC)法检查砷盐的异同点.
四、有机溶剂残留量及干燥失重
中国药典采用GC法检查有机溶剂残留量,测定方法有直接进样法和顶空进样法。
干燥失重是指药物在规定条件下经干燥后所减失的重量(主要指水分,也包括其他挥发性物质)。
常用方法有:
常压恒温干燥法、干燥剂干燥法、减压干燥法,以及热分析法(TGA、DTA、DSC)。
五、特殊杂质检查方法
1、利用色、臭、溶解度、旋光性、紫外吸收、红外吸收等性质差异。
2、TLC法--杂质对照法、自身对照法、对照药物法、利用方法检测限。
3、HPLC或GC法--峰面积归一化法、不加校正因子的主成分自身对照法、加校正因子的主成分自身对照法、内标法、外标法。
内容
》药物的纯度要求
》杂质的来源和种类
》杂质的限量检查
》一般杂质检查
》特殊杂质检查
一、药物的纯度要求
药物的纯度——指药物的纯净程度
杂质检查——也称纯度检查
杂质(impurity)——无治疗作用,影响药物稳定性和疗效,对人体健康有害的物质。
注意:
药物纯度与化学纯度的区别
(一)、药物的杂质检查项下包括
1、杂质检查
2、有效性—指与药物疗效有关的一些指标。
如:
氢氧化铝的制酸力,药用碳的吸着力,含氟药物的含氟量等。
3、安全性—异常毒性,热原,降压物质,无菌试验等。
4、药物制剂要求—重量差异,崩解时限,含量均匀度等。
二、杂质的来源与种类
1、来源:
(1)、生产过程中引入:
原料,中间体,副产物;
试剂,溶剂,催化剂;
器皿、装置、管道等;
制剂过程中产生的杂质;
同分异构及同质异晶现象。
(2)、贮藏过程中产生:
保管不当、贮藏时间过长;
湿度、温度、光、空气影响;
微生物作用。
2、种类:
(1)、按来源分:
一般杂质和特殊杂质
(2)、按结构分:
无机杂质和有机杂质
(3)、按性质分:
信号杂质和有害杂质
无效、低效的异构体或晶型
1、光学异构体(左旋体,右旋体)
例肾上腺素为左旋体,其升压作用是右旋体的12倍,盐酸普萘洛尔左旋异构体的?
-受体阻断作用比右旋体大60倍。
2、几何异构体(顺式体,反式体)
例维生素A全反式的生物活性最高
3、多晶型(晶型不同,理化常数,溶解度,稳定性,体内吸收和疗效也不同)
例无味氯霉素有多晶现象,B晶型易被酯酶水解而吸收,为有效晶型,而A晶型则不易被酯酶水解,活性很低。
药典中规定的检查项目,是指正常生产和储存中可能产生并需控制的杂质。
药典中未规定的杂质,一般有以下几种情况:
1、指正常生产和储存中不可能引入;
2、含量甚微,对人体和药物质量无不良影响;
3、限量要求较宽,现有产品均能达到;
4、对杂质认识不足,有待于积累资料。
三、杂质的限量检查
1、限量检查(Limittest)
药物中的杂质在不影响疗效和不发生毒性的原则下允许有一定限量。
通常不测定其准确含量,只检查杂质的量是否超过限量,所以称为杂质的限量检查。
2、检查方法:
取一定量杂质对照品与一定量供试品在相同条件下处理后,比较结果,以确定杂质含量是否超过规定量。
杂质的限量是指药物中所含杂质的最大允许量,通常用%,ppm表示。
对人体有毒的杂质控制较严:
砷----不得过百万分之十
重金属-----不得过百万分之五十。
第三章药物的杂质检查
(2)
药物中杂质的限量除考虑杂质本身的性质外,还要结合实际的生产水平,参考各国药典的标准来制订。
药物中杂质的限量计算:
杂质限量(L)={杂质最大允许量/供试品量(S)}×
100%
式中:
杂质最大允许量=(浓度C×
体积V)标
所以:
L=C·
V/S×
100%
例1对乙酰氨基酚中检查氯化物。
取对乙酰氨基酚2.0g,加水100ml,加热溶解后冷却,滤过,取滤液25ml,依法检查氯化物,发生的浑浊与标准氯化钠溶液5.0ml(每1ml相当于10ug的Clˉ)制成的对照液比较,不得更浓。
问氯化物的限量是多少?
1、
例2葡萄糖中检查重金属。
取葡萄糖4.0g,加水23ml溶解后,加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml,依法检查重金属,含重金属不得过百万分之五。
问应取标准铅溶液多少ml(每1ml相当于10ug的Pb)?
例3溴化钠中砷盐检查,规定含砷量不得过0.0004%,药典规定,取标准砷液2.0ml(1ugAs/ml)。
应取供试品多少克?
例4磷酸可待因中检查吗啡。
取本品0.10g,加盐酸溶液(9→1000)使溶解成5ml,加亚硝酸钠试液2ml,放置15分钟,加氨试液3ml,所显颜色与吗啡溶液[取无水吗啡2.0mg,加盐酸溶液(9→1000)使溶解成100ml]5.0ml用同一方法制成的对照液比较,不得更深。
问限量为多少?
杂质检查也有采用供试品溶液中加入一定试剂后,在一定反应条件下观察有无正反应出现,即以该实验条件下的反应灵敏度来控制杂质限量。
还有采用以纯水为对照的。
例如NaCl中Ba、Ca、SO42-的检查,分别采用了上述三种检查方法。
1、Ba2-的检查:
2、Ca2-的检查:
NaCl+水+NH3·
H2O+(NH4)2C2O4→CaC2O4(5min内不应有沉淀产生)
3、SO42-的检查:
NaCl+水+Ba2-→BaSO4↓(浅)
标准SO42-+水+Ba2-→BaSO4↓(深)
四、一般杂质的检查方法
(一)、氯化物检查法
原理:
Cl-+Ag+→AgCl↓(白色)
加硝酸的作用:
1、加速AgCl↓生成,产生较好的乳浊;
2、避免Ag2CO3↓,Ag2O,Ag3PO4等的形成,消除这些阴离子的干扰。
Cl-的浓度:
50-80ug/50ml为宜。
相当于标准NaCl溶液(10ugCl-/ml)5.0-8.0ml
第三章药物的杂质检查(3)
供试品处理
1、供试品不澄明->
过滤
2、供试品有色
(1)、内消色法:
(2)、外消色法:
用含硝酸的蒸馏水洗净滤纸中Clˉ至洗液遇AgNO3不产生浑浊,再过滤供试液。
例KMnO4中Cl-的检查:
样品(紫色)+乙醇→颜色消退后再检查
Clˉ的存在状态
1、溶于水的药物——直接测定
2、不溶于水的药物:
加水振摇,过滤,取滤液检查。
若药物在稀乙醇或丙酮中有一定溶解度,可加稀乙醇或丙酮溶解后再检查。
也可采用超声,加热等方法,使Clˉ溶解,取滤液或上清夜进行检查。
有机氯——有机破坏
思考题:
如果供试品为溴化物、碘化物,怎样进行氯化物检查?
(二)、硫酸盐的检查
SO42-+Ba2+→BaSO4↓(白色)
酸及酸度:
加HCl使成酸性,可防止BaCO3↓,Ba3(PO4)2↓形成。
SO42-的浓度:
0.1-0.5mgSO42-/50ml为宜,相当于标准K2SO42-溶液(0.1mgSO42-/ml)1.0-5.0ml。
注意
溶液浑浊或有色:
处理方法与Clˉ检查法相似。
(三)、铁盐检查法
Fe3++6SCNˉ→[Fe(SCN)6]3-(红色)
反应在HCl酸性中进行,可防止Fe水解。
Fe3+的浓度:
10-50ugFe3+/50ml为宜,相当于标准硫酸铁铵[FeNH4(SO4)2·
12H2O]1.0-5.0ml(10ugFe3+/ml)
Fe的存在形式:
Fe2+无此反应,需加入氧化剂过硫酸氨或硝酸(需加热煮沸除去NO)氧化Fe2+→Fe3+
注意
1、标准硫酸铁铵配制时为防止水解,需加适量硫酸。
2、反应可逆,加过量试剂可提高反应灵敏度。
3、供试品与对照品色调不一致或呈色浅:
可加正丁醇或异戊醇提取。
4、一些阴离子(Cl-,PO43-,SO42-,枸橼酸根)能与Fe3+形成有色配位物干扰检查,可增加酸度和显色剂用量。
5、环状结构的有机药物:
需经炽灼破坏。
BP采用什么方法检查铁盐?
说明该法原理及注意事项。
(四)、重金属(HeavyMetals)检查法
定义——重金属是指在实验条件下能与S2-作用显色的金属杂质(Ag,Pb,Hg,Cu,Cd,Sn,Bi等),以铅为代表。
ChP收载4种方法
第一法直接测定法
CH3CSNH2+H2O→CH3CONH2+H2S
H2S=2H++S2-
Pb2++S2-→PbS↓(黄-黑色)
酸度:
本反应的pH对显色有很大影响,在PH3-3.5时,PbS↓较完全,酸度增大,呈色变浅,甚至不呈色。
第三章药物的杂质检查(4)
因此用强酸处理过的溶液必须先用NH3·
H2O调pH值至中性。
标准液配制与用量:
取Pb(NO3)2,先配成储备液(为防水解),临用时再稀释成10ugPb/ml。
用量以10-20ugPb/27ml为宜(相当于标准Pb溶液1-2ml)。
第二法炽灼破坏后测定法
应用范围:
适合于含芳环或杂环等能与重金属离子形成配位化合物的有机药物。
方法:
采用三酸处理,然后按第一法测定。
1、取炽灼残渣项下遗留的残渣(H2SO4处理)
2、残渣+HNO3→加热处理,蒸干→残渣
3、残渣+HCl→溶解→加热蒸干(除残留HCl)
4、残渣+水→溶解,调pH→转移至比色管中
5、按第一法检查
标准管同法处理
第三法在碱性条件下,以硫化钠为试液,适合于不溶于稀酸而溶于碱的药物。
取供试品适量+NaOH+H2O→溶解+Na2S试液,与一定量标准铅液同法处理后的颜色比较。
第四法微孔滤膜过滤法,适合于重金属含量低的药物(原理与一法同)。
显色后用50ml注射器转移至滤器中进行压滤,取下滤膜,干燥,比较生成的斑点颜色。
注意:
1、供试品溶液有色:
在对照管中加少量稀焦糖溶液,(也可加其他无干扰的指示剂等)使两管色调一致。
如果外消色法不能消除干扰,可采用内消色法。
2、供试品含有微量Fe3+:
会氧化H2S析出S↓,可加VitC0.5-1.0g,使Fe3+→Fe2+,同时在对照管中加等量的VitC,再依法测定。
3、供试品为Fe3+:
可利用Fe3+在比重1.103-1.105的HCl(9mlHCl+6ml水)中成为HFeCl62-,用乙醚提取,除去大部分Fe3+,再加KCN,将残留的Fe3+掩蔽起来。
4、药物本身能生成不溶性硫化物时,可加入适当掩蔽剂,如KCN,酒石酸等,使与药物形成稳定的络合物。
5、注意一、二、四法与三法所用显色剂和酸度的不同。
USP法
-供试品①
-对照品②→同法操作→①<②≦③
-监控管③(①+②)
BP法
-供试品12ml①
-对照品10ml②+2ml①→①﹤②﹥③
-水10ml③+2ml①
(空白管用来检查对照管的呈色是否正常)
JP法
-用硫化钠显色。
(五)、砷盐(Arsenic)检查法
第一法古蔡法
原理:
-AsO33-+3Zn+9H+→AsH3↑+Zn2+
-AsH3↑+2HgBr2(试纸)→砷斑
三章药物的杂质检查(5)
-与2ml标准砷溶液同法操作。
砷斑:
As(HgBr)3(黄色);
AsH(HgBr)2(棕色);
As2Hg3(棕黑色)
KI的作用:
-AsO43-+I-→AsO33-+I2
-4I-+Zn2+→ZnI42-
SnCl2的作用:
-I2+Sn2+→2I-+Sn4+
-AsO43-+Sn2+→AsO33-+Sn4+
-SnCl2+Zn→Zn-Sn齐
SnCl2和KI还可抑制SbH3的生成
醋酸铅棉花的作用:
Zn粒及供试品中可能含有少量S2-,在酸性条件下产生H2S↑,与HgBr2作用,生成HgS↓,干扰测定,故在测砷管中部,用Pb(Ac)2棉花填充,以消除干扰:
H2S↑+Pb(Ac)2→PbS↓沉积在棉花上。
标准砷液(As2O3溶液,1ugAs/ml)
药典规定为2ml。
1、供试品为硫化物:
(S2-,SO32-,S2O32-)+H+→H2S↑或SO2↑遇HgBr2试纸→HgS↓或Hg↓(干扰测定),可先加HNO3处理,使硫化物氧化成SO42-,以消除干扰。
例硫代硫酸钠。
2、供试品为铁盐:
消耗KI,SnCl2并氧化AsH3,可先加酸性SnCl2,使Fe3+→Fe2+,再检查。
例枸橼酸铁铵
3、环状药物:
须先进行有机破坏,常用方法有:
Ca(OH)2———例酚磺酞、呋塞米
无水Na2CO3—例苯甲酸钠
Br2水————例葡萄糖
第二法二乙基二硫代氨基甲酸银法[简称Ag(DDC)法]
AsH3↑+6Ag(DDC)+3吡啶→As(DDC)3+6Ag(红色胶态银)+3吡啶·
HDDC
于510nm波长处测定吸收度,以Ag(DDC)溶液为空白。
--本法灵敏度高(0.5ugAs/30ml),在1~10ugAs/40ml浓度范围内线性关系良好,呈色可稳定2h,重现性好,可采用标准对照法进行定量。
--本反应可逆,加入有机碱使与HDDC结合,有利于反应向右定量进行完全。
--有机碱:
吡啶(USP法)
三乙胺-氯仿溶液(ChP法)
三乙醇胺、麻黄碱等
第三章药物的杂质检查(6)
除上述两种测砷方法外还有什么方法可以检查砷盐?
(六)、炽灼残渣(Residueonignition)
炽灼残渣也称硫酸盐灰分---有机药物经炽灼炭化,加硫酸湿润,低温加热至硫酸蒸气除尽后,于高温(700~800℃)炽灼灰化逸出,残留下非挥发性无机杂质(金属氧化物或无机盐类)成为硫酸盐。
限量一般控制在0.1-0.2%,取样量为1-2g
遗留的炽灼残渣需留作重金属检查时,炽灼温度应控制在500-600°
C
-炽灼至恒重的第二次称重应在规定温度继续炽灼30分钟以上。
-恒重—连续二次称重重量差<0.3mg。
-含氟药物对磁坩埚有腐蚀,应采用铂坩埚。
(七)、干燥失重(Lossondrying)
是指药物在规定的条件下经干燥后所减失的重量。
主要指水分,也包括其他挥发性杂质。
测定方法有:
1、常压恒温干燥法(105℃):
适用于受热较稳定的药物。
将样品(研细)平铺于扁称量瓶中,厚度<5mm。
干燥时间一般在达到指定温度后干燥2-4h,称重,再干燥,直至恒重。
恒重操作:
在干燥至恒重的第二次及以后各次称重均应在规定温度下干燥1小时后进行。
含水量大且mp低的样品:
先在低温下除去大部分水,再升温至规定温度,干燥至恒重。
例Na2S2O3
2、干燥剂干燥法:
本法适用于受热易分解或易挥发的药物。
将样品置干燥器内干燥至恒重。
常用干燥剂有:
硅胶、硫酸、无水氯化钙、五氧化二磷等。
其中五氧化二磷吸水效力最强,但P2O5吸水后产生H3PO4,若样品对酸不稳定,可能会受影响。
3、减压干燥法:
适用于mp低,受热不稳定及难除去水分的药物。
减压干燥时可用减压干燥器或恒温干燥箱,一般压力﹤2.67KPa[20mmHg]。
●通常分析一个药物时,干燥失重与含量测定应同时进行,然后根据干燥失重%,将样品折算成干燥品,再计算含量。
4、热分析法(Thermalanalysis)
热分析是指在程序控制温度下,测量物质的物理、化学变化与温度关系的一类技术。
物质在加热(冷却)过程中,往往会脱水、挥发或发生相变(熔化、冷凝、升华、沸腾)及发生分解、氧化、还原等化学变化,热分析就是将这些变化作为温度的函数来进行研究和测定。
1、热重分析(Thermogravimetricanalysis,TGA)
—是测量物质在加热过程中的质量变化,并从这种变化来研究物质在加热过程中所产生的具有质量变化的反应。
—方法:
将样品置热天平中,按一定速度升温,记录样品重量随温度的变化,即热重曲线。
2、差示热分析法(Differentialthermalanalysis,DTA)
——基于药物在加热过程中,由于发生上述物理或化学变化,同时拌随着吸热或放热,势必影响温度,通过测定供试品与惰性参比物质之间温差随温度或时间的变化。
典型的差热曲线如下:
第三章药物的杂质检查(7)
在DTA曲线中,化学变化峰形较宽,物理变化峰形尖锐。
因此,根据峰形、峰数目及峰位置可对药物定性,估测纯度。
3、差示扫描热量法(differentialscanningcalorimetry,DSC)
—在分析过程中保持供试品与参比物的温度相同,测定维持在相同温度时所需的能量差随温度的变化。
—DSC是以热流率为纵座标,温度或时间为横座标,峰的位置、形状、数目与物质的性质有关,可用来鉴别物质,而峰的面积与反应热焓有关,可用来定量地估计参与反应的物质的量或测定热化学参数。
应用:
—供试品的熔点随着所含杂质量的增加而降低,DSC曲线也会发生响应变化,因此可用来药物的纯度检查。
例不同纯度苯甲酸的DSC曲线。
—不同晶型的物质,其熔点不同,熔化吸热峰的位置也就不同。
因此DSC也可用于药物中无效或低效晶型的检查。
例盐酸舍曲林两种晶型的DSC行为。
—DSC和DTA还可用于低共熔杂质(能与药物形成低共熔混合物的杂质)的分析。
※当药物中低共熔杂质量增加时,样品的熔点降低,当两者量达到一定比例时(即低共熔混合物组成),熔点最低。
加热该混合物到最低共熔点时,体系温度不变,继续加热至杂质完全熔出,温度升高。
杂质浓度与特定温度时已熔化供试品的分数成反比,因此,根据样品熔点的降低可以测定其中杂质的量。
(八)、有机溶剂残留量测定法
用以检查药物在合成过程中引入的有害有机溶剂。
ChP规定:
二氧六环
0.038%
吡啶
0.02%
苯
0.0002%
甲苯
0.089%
氯仿
0.006%
二氯甲烷
0.06%
环氧乙烷
0.001%
Ch.P对残留有机溶剂采用GC法测定
第一法---直接进样法
内标法—RSD<5%(n=5)
外标法---RSD<10%(n=5)
第二法---顶空进样法
可免去样品萃取、浓集等步骤,并可避免非挥发性组分对色谱柱的污染,但要求待测物有足够的挥发性。
顶空分析法(headspacechromatography)
也称液上气相色谱分析,是指用气相色谱法来分析封闭系统中与液体或固体样品相平衡的气体的一种方法。
第三章药物的杂质检查(8)
五、特殊杂质检查方法
(一)、利用药物和杂质在物理性质上的差异
1、臭味及挥发性、颜色、溶解行为的差异
例1黄凡士林中异性有机物检查(灼烧时有异味)
例2磺胺嘧啶中氧化产物偶氮苯的检查
取样品2.0g,加氢氧化钠试液10ml溶解,加水稀释至25ml,溶液应澄清无色,如显色,与黄色3号比色液比较,不得更深。
样品溶于5ml乙醚后,只许显极淡的红色。
比色液成分
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- 药物 杂质 检查