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调节菌丝球的疏密程度:
1 使菌丝球变得密实:
过程添加易利用的碳源(如葡萄糖),搅拌加快,供氧改善
2 反之:
用乳糖,搅拌缓慢,供氧跟不上
2.微生物生长的测量
●细胞数目的测定(直接显微镜计数、平板活菌计数(稀释培养法)、自动细胞计数和分
检法)。
优点,缺点,适用范围(P6表1-1)
●细胞总量的测量
直接细胞总量测定(细胞干重测量法(DCW)、比浊法、离心压缩细胞体积法(PCV))
间接细胞总量测定(营养物质消耗的测定、测量产物的形成、发酵热、测定细胞组分)
代谢产物:
1.细胞组分在胞内浓度应相当一致;
2.在定量萃取与分析方面应当相当精确;
3.非细胞固体中是否也含有同样的组分,细胞中此组分的含量与细胞量的关联。
营养消耗:
1.细胞的率是否稳定(高低)2.养分测量方法准确性3.是否存在干扰分析的物质,量有多少。
Monod方程:
μ=μmS/(ks+S)用来描述生长速率与基质浓度S之间的关系。
Monod方程是由实验得出的经验公式。
Ks营养物质的饱和系数,为μ=0.5μm时的营养物质浓度
Ks的生理意义:
衡量微生物对某种限制性营养物质亲和力的大小。
Ks越小,说明微生
物对该种营养物质的亲和力越大。
Ks=100~300mg/L(被动扩散,异化扩散);
Ks=1~100mg/L(载体介入,主动运输)
S:
营养物质的浓度
细胞组分:
1.非细胞性固体中是否含有此组分如果有,就不能用此组分与细胞的生长相
关联2.细胞中的该组分与细胞量之间是否存在定量关系、这种定量关系是否恒定
●微生物生长与环境的关系
1)温度
a.菌在低于最适宜生长温度的温度范围内比在高温度范围内有更强的适应力。
b.一种对生长必需的酶的改变会使生长对热变性比野生型更为敏感。
c.随着温度的升高,死亡速率的增加远大于低活化能的生长速率的增加。
d.温度降低细胞脂肪酸不饱和程度增加。
与其细胞膜结构的物理化学特性有密切关系
与其细胞内某些关键酶的活性有密切关系
温度影响微生物比生长速率
影响生物合成的方向
温度影响碳源的基质得率
2)水活度
水对细胞细胞的影响常用水的活度Aw表示:
Aw=ps/pw
ps和pw分别为溶液和纯水在同一温度下的蒸汽压;
Aw相当于相对湿度。
在同一温度下纯
水的Aw=1。
(细菌比霉菌对水活度更敏感;
G+比G-更能耐受低水活度。
3)PH值的影响
PH是微生物生长和产物合成的重要的状态参数。
PH上升超过最适值,意味着菌处在饥饿状态,可加糖调节。
直接影响细胞本身
PH影响细胞膜电荷状况,引起膜渗透性改变,影响对物质的吸收和分泌
影响营养物质的溶解度
4)基质
基质抑制:
所有的营养物质都存在一个上限浓度,超过这一上限浓度,浓度继续增加,
会引起生长速率下降,这种效应就称为基质抑制作用。
抑制是由于渗透压所致。
溶质浓度的增加到一定程度会引起细胞脱水,进而降低生长速
率。
3.生长效率
●得率系数
生长得率系数的概念是假定所利用的基质与生成的细胞之间的固定化学计量关系。
●表示生长得率的方法
1 分子得率系数
表示每消耗1mol的基质所生成的细胞量。
适用于比较不同基质的转化率。
2 碳转化率
指基质中的碳有多少转化为细胞的碳。
碳转化率(CC)=Y×
(DCW中的碳含量/基质的碳含量100%)。
只适用于基质为唯一碳源的情况。
3 基于热产生的得率Ykcal
单位释放的热所产生的细胞量。
Ykcal=产生的细胞量/释放的热。
4 基于ATP消耗的得率YATP
YATP=生成的细胞/消耗单位摩尔的ATP。
可用来区分葡萄糖代谢主要途径(适用厌氧微
生物)。
●决定生长得率的因素
微生物的遗传性质;
基质的性质;
基质的分解代谢途径;
菌的生理状态
●维持能
是指分解代谢产生的用于非生长活动的那部分能量。
微生物的生长环境越是远离其最适的生长条件,微生物的维持能就越大。
第二章微生物的基础代谢
在代谢过程中凡是能释放能量的物质的分解过程都被称为分解代谢;
吸收能量的物质的合成都被称为组成(合成)代谢。
这两种代谢合称新陈代谢(基础代谢)。
1.能量代谢原理
光养菌:
直接从光能获得营养
化能营养菌:
利用光养生物已合成德富能化合物
异养菌:
有机碳作为碳源
自养菌:
细胞中的碳大多来自于CO2的固定。
营养缺陷型:
培养基中需加入它们不能自己合成的有机化合物才能生长的菌
●能量的产生:
氧化还原反应。
能量通过一些高能化合物以高能键的形式储存起来,这些化合物又称为能量载体。
●能量偶合:
一种能量上可行的反应推动另一种在能量上不可行反应进行的过程。
分为两种:
有能量转移、无能量转移。
1 单酶催化单一反应
2 多酶反应
3 无能量转移偶合反应
●三种磷酸化方式:
基质水平磷酸化(可溶性酶酶催化基团转移);
电子输送磷酸化(膜酶催化氧化还原);
光和磷酸化(膜酶催化光能转换)
●能荷:
能荷=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)
作用:
有助于检测一已知细胞生长期间的能量变化以及酶活的相应变化。
细胞停止生长则能荷达到最高!
2.微生物分解葡萄糖的途径
●糖酵解途径(EMP)
一分子葡萄糖净生成两分子ATP+两分子NADH;
葡萄糖活化需消耗一分子ATP,一磷酸
果糖生成二磷酸果糖需消耗一分子ATP;
磷酸丙糖氧化生成一分子NADH,丙酮酸生成
一分子NADH。
关键酶:
6-磷酸果糖激酶
最终产物:
丙酮酸
●己糖单磷酸支路(HMS)(存在于哺乳动物、酵母、细菌中)
一分子葡萄糖消耗一分子ATP生成两分子NADPH。
三磷酸甘油醛
5-磷酸核糖——合成嘌呤、嘧啶核苷酸
4-磷酸赤藓糖——合成芳香族氨基酸前体
6-磷酸葡糖酸脱氢酶
三磷酸甘油醛,6-磷酸果糖
HSM途径的重要性在于它能提供合成核酸和吡啶核苷酸等1所需的戊糖和合成芳香氨
基酸和维生素所需的前体以及许多合成反应所需的(NADPH+H+)。
●恩特纳-多多罗夫途径(ED)(严格需氧菌,除运动发酵单胞菌)
关键酶:
2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)醛缩酶
丙酮酸,三磷酸甘油醛
●磷酸解酮酶(PK)途径(只存在于少数种类细菌中,厌氧条件下)
每分子葡萄糖净得一分子ATP。
磷酸解酮酶
乙醇or乙酸(ADPATP)
磷酸己糖解酮糖酶途径(HPK)
●三羧酸(TCA)循环(柠檬酸循环orKrebsCycle)
此循环将丙酮酸完全氧化为CO2和水,脱氢反应中从基质取得的电子被送到呼吸链中
去,在那里产生所需的ATP。
TCA循环对生物合成极其重要,它提供一些氨基酸生物合成的前体;
如α-酮戊二酸和草
酰乙酸分别为谷氨酸和天冬氨酸的前体。
●三羧酸循环补给反应系统
因TCA循环所有反应过程均需同时进行,要从TCA循环中抽出一些前体就必须及时补充
抽走的中间体,循环才能继续运行。
1
丙酮酸+CO2+ATP草酰乙酸+ADP+Pi(丙酮酸羧化酶+生物素)
2
PEP+CO2草酰乙酸+Pi(PEP羧化酶)
3
PEP+CO2+ADP+Pi草酰乙酸+ATP(PEP羧化激酶)
4
PEP+CO2+Pi草酰乙酸+ATP(PEP转羧磷酸化酶)
5
丙酮酸+CO2+NADPH+H+苹果酸+NADP+(苹果酸氧化脱羧酶)
不是所有这些反应都存在于同一微生物中,PEP羧化酶广泛分布于细菌中,而丙酮酸羧化酶分布于酵母中。
TCA循环因而有无定向功能循环之称。
●乙醛酸循环
TCA循环增加异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶,补充C4-酸,避免生成CO2,丢失碳架。
碳源:
乙酸!
乙酸——>
乙酰CoA——>
苹果酸——>
草酰乙酸——>
PEP——>
6-P-果糖
3.氨基酸合成
●谷氨酸合成
合成一分子谷氨酸需要从TCA循环中抽出谷氨酸的碳架——α-酮戊二酸,然后通过补给
反应从丙酮酸羧化补充一分子草酰乙酸。
●天冬氨酸合成
天冬氨酸是通过转氨作用由草酰乙酸合成的,将天冬氨酸进一步氨化可得天冬氨酰胺。
●赖氨酸合成
所有原核生物,高等植物和菌类的赖氨酸生物合成途径称为二氨基庚二酸(DAP)途径。
真菌和一些眼虫藻的赖氨酸的生物合成途径称为α-氨基己二酸(AAA)途径。
原生动物
不能合成赖氨酸,需要从外界摄取。
DAP途径具有两个特殊功能的中间产物:
二氨基庚
二酸和双氢吡啶二羧酸。
前者是细胞壁的肽聚糖组分;
后者是吡啶二羧酸的直接前体,
它是内生孢子(芽孢)壁的主要化学成分,赋予芽孢热稳定性。
●芳香族氨基酸合成(莽草酸途径)
酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
它为叶酸和对氨苯甲酸与苯醌分别提供合成前体——分支
酸和对羧基苯甲酸。
4.微生物同化氨的三种方式
α-酮戊二酸+NH3+NADH++H+谷氨酸+NAD++H2O(谷氨酸脱氢酶)
谷氨酸+ATP+NH3谷氨酰胺+ADP+Pi(谷氨酰胺合成酶)
天冬氨酸+ATP+NH3天冬氨酰胺+AMP+ppi(天冬氨酰胺合成酶)
微生物同化氨的途径取决于胞内氨浓度以及其遗传特性。
5.腐胺(丁二胺)生理学意义
1、调节渗透压
2、保证微生物细胞内部的离子强度大致不变
细胞内腐胺浓度变化与培养基的渗透压成反比。
能耐渗透压越强的细菌,胞内的K+强度越大。
培养基的渗透压增加,胞内的渗透压也随
K+的吸收增加。
于是排出腐胺可维持大致恒定的胞内离子强度。
6.糖磷酸酯与糖核苷酸
糖核苷酸的功能:
1 作为某些单糖相互转换的机构
2 在多糖合成中作为糖基的给体
第3章代谢条件与代谢工程
微生物的生命活动是由产能与生物合成的各种代谢途径组成的网络互相协调来维持的。
●微生物的代谢网络是受到高度调节的
1)微生物生长在含有单一有机化合物为能源的合成培养基中,所有小分子单体的合成速率
同大分子细胞组成物质的合成速率是协调一致的。
2)只要细胞能从外部摄取某种单体,细胞内该单体的合成将自动中止,参与这些单体生成
的酶的合成也会停止。
3)只有当某些有机基质存在时,微生物才会合成异化这些基质的酶;
4)如存在两种有机基质,微生物会先合成能异化更易利用的基质的酶,易利用的基质耗竭
才开始诱导分解难利用基质的酶;
5)养分影响生长速率,从而相应改变细胞大分子的组成,如RNA的含量。
●代谢调控的机制
1 酶活性的调节(活化或钝化)
代谢调节---调节已有的酶活性通过中间代谢物或终产物对已有酶分子活性的激活或抑
制来控制代谢活动的速率。
(更快捷)
2 酶合成的调节(诱导或阻遏)
基因调节---调节的是酶分子的合成量通过酶量的变化来控制代谢的速率。
(更经济)
微生物调节基础代谢的三种方式:
酶活性调节、酶合成调节、遗传控制。
1.酶活性调节
代谢调节部位:
1 养分吸收分泌通道
2 限制基质与酶的接近
3 代谢途径通量的控制
微生物控制代谢物流的方法有两种:
调节现有酶量,可通过增加或减少途径中有关酶的合成或降解速率实现;
改变已有酶分子的活性。
●代谢途径通量
1)代谢流分析
是代谢分析的一个重要手段,它假定细胞内的物质、能量处于一拟稳态,通过测定胞外
物质浓度根据物料平衡计算细胞内的代谢流。
✧代谢流分析揭示了代谢的静态分布。
2)代谢控制分析
代谢控制分析则针对细胞内外环境的不稳定性,揭示细胞代谢的动态变化规律。
✧弹性系数和流量控制系数是代谢控制分析研究的两个主要指标。
3)弹性系数
揭示代谢物浓度变化对反应速率的影响程度。
流量控制系数
则为单位酶变化量引起的某分支稳态代谢流量的变化,用来衡量某一步酶反应对整个反
应体系的控制程度。
✧这两个系数相互关联,可直接或间接测定。
●酶活性调节方式
共价修饰
变构效应
缔合与离解
竞争性抑制
基因表达
1)共价修饰
这是蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开,使其活性改
变的作用。
用共价修饰方式可使酶钝化或活化。
1 可逆共价修饰
细胞中有些酶存在活性和非活性两种状态,它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而相互转换。
意义:
由于酶构型的改变是通过酶催化的,酶反应是快速的,所以可在短时间内改变酶的活性,有效控制细胞的生理代谢。
2 不可逆共价修饰
例如:
酶原的激活
2)变构控制
小分子物质与蛋白质发生可逆的相互作用,导致蛋白质的构象发生改变,从而改变这种
蛋白质与第三种分子的相互作用。
变构调节的特征
1 参与酶活性调节的变构因子是一类能与变构蛋白分子互补结合的小分子化合物,又
称为效应物或调节因子。
2 许多变构酶的反应动力学性质与一般的酶不同,以酶反应初速率与基质浓度作曲
线,得到的并不是典型的双曲线型,而是带点S型的曲线,(S型表示在低基质浓度
下随基质浓度的提高,酶反应速率的提高加快),这种现象称为正协同作用。
3 调节位点(副位点)与活性中心既独立又有联系,可同时被结合。
4 调节位点不一定是特异的,可结合不同的物质,产生不同的效应。
3)缔合与解离
能进行这种转变的蛋白质由多个亚基组成,蛋白质活化与钝化是通过组成它的亚单位的
缔合与解离实现的。
这类互相转变有时是由共价修饰或由若干配基的缔合启动的。
4)一些蛋白质的生物活性受代谢物的竞争性抑制。
2.酶合成的调节
●酶合成的调节方式
1 酶诱导
负向控制——β-半乳糖苷酶
正向控制——异化阿拉伯糖的酶
2 酶阻遏
分解代谢物阻遏(葡萄糖对半乳糖苷酶的阻遏)
终产物反馈调节(色氨酸对其自身合成所需酶的合成,嘧啶合成的反馈控制)
1)诱导作用
是指培养基中某种基质与微生物接触而增加(诱导)细胞中其相应酶的合成速率。
若酶
合成速率受基质浓度变化的影响很小,这种酶称为组成型。
能引起诱导作用的化合物称为诱导物:
基质、基质的衍生物、产物
安慰诱导物:
酶基质的结构类似物常是出色的诱导物,但它们不能作为基质被酶转化,
因此这类诱导物又被称为安慰诱导物。
诱导作用的分子水平机制如下图表示:
诱导调节作用的克服
1 如果要大量合成酶,就要设法绕过微生物的固有调节机制。
2 可采用诱变的方法,消除诱导酶的合成必需依赖诱导物这种障碍。
使调节基因编码合成的阻遏物无活性或操纵基因对活性阻遏物的亲和力衰退。
这种突变叫作调节型或组成型突变,具有这种特性的菌株称为组成型突变株。
组成型突变株的富集方法
Ø
在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选
将菌株轮番在有/无诱导物的培养基中培养
使用诱导性能很差的基质
使用阻碍作用的抑制剂
2)分解代谢物阻遏——营养阻遏
v当培养基中存在一种以上的基质时,微生物总是先分解那些最易利用的基质,只有在该
基质耗竭后才开始分解第二种基质。
v快速利用的基质的存在,阻遏了分解其他基质的酶系的合成。
✧某种C源在微生物中起分解代谢阻遏作用的效能取决于它作为C能源的效能,而不是它的
化学结构。
✧在一种微生物中起分解代谢物阻遏作用的化合物可能在另一种微生物中不起作用。
分解代谢物阻遏效应
✧将大肠杆菌培养在含有两种碳源(如葡萄糖与乳酸)的培养基上,便出现两次旺盛的生
长期,称为二次生长。
其特征是两个生长期间夹有一个停滞期。
(葡萄糖分解代谢物对乳糖利用的阻遏,cAMP-CRP(环腺苷酸接受蛋白)在promoter上
的结合是RNA聚合酶结合到P上所必须的,cAMP在胞内浓度的变化与ATP合成速率成反
比)。
PPT52页!
!
✧合成受阻遏速率与去阻遏速率之比为阻遏率。
●分解代谢物阻遏作用的克服
1)在培养基中不使用阻遏性碳源,有利于对分解代谢物阻遏敏感的酶的生产。
2)必须用阻遏性碳源时,可通过流加补料,限制生产菌的基质消耗速率,消除分解代谢阻
遏对酶生产的影响。
3)耐分解代谢物阻遏突变株的筛选。
3)反馈调节
氨基酸、嘌呤和嘧啶核苷酸生物合成的控制总是以反馈调节方式进行。
生理意义:
避
免物流浪费及不需要的酶的合成。
反馈调节分为:
反馈抑制、反馈阻遏。
反馈抑制:
终产物只阻遏途径中前几个(第一个酶)的合成,酶活性调节,迅速
反馈阻遏:
“所有”酶阻遏,酶合成速率。
●反馈调节作用的消除
1 改变培养环境来限制末端代谢产物在胞内的积累。
控制培养基的成分。
加入生物合成途径的抑制剂。
限制补给营养缺陷型突变株所需的生长因子。
采用末端代谢产物的衍生物,限量补给营养缺陷型突变株。
2 改造微生物,使其对末端代谢产物反馈调节不敏感。
获得耐末端代谢产物反馈调节的突变株
方法
诱变处理,将诱变处理过的菌株涂布在含有末端代谢产物结构类似物平板培养
长出的菌落是发生了抗性突变的菌株
或
先用诱变方法除去对末端代谢产物反馈阻遏敏感的酶。
为什么这样获得的菌株是发生了抗性突变的菌株?
a.细胞中过量末端代谢产物(如氨基酸A)会抑制和阻遏参与其生物合成途径的酶。
b.末端代谢产物结构类似物也会抑制或阻遏参与其生物合成的酶。
c.在含有过量末端代谢产物的培养条件下,野生型细菌不能正常生长。
发生抗性突变的原因可能是什么?
A.参与氨基酸合成的酶结构起了变化,对类似物A'
不敏感(抗反馈抑制的突变株)
B.编码参与氨基酸A合成酶的操纵子的控制基因发生了变化,编码出没有活性的调节蛋
白而对类似物A'
不敏感(抗反馈阻遏的突变株)
书上P122表3-9微生物代谢调节机制
分枝途径中的末端产物的反馈调节作用(书上P120——P121!
同工酶调节
协同反馈调节
积累反馈调节
增效反馈调节
顺序反馈调节
联合激活或抑制作用
3.糖代谢调节
巴斯德效应——
酵母在有氧条件下的细胞得率比厌氧下高(乙醇产量显著下降,单位时间内糖耗速率减
慢),氧抑制酵母糖发酵生成乙醇的这种作用称为巴斯德效应。
克列勃特里(Crabtree)效应——
在癌细胞中发现给予葡萄糖时不论供氧充足与否都呈现很强的酵解反应,而糖的有氧氧
化受抑制,称为Crabtree效应或反巴士德效应。
这种现象较普遍地存在于癌细胞中,此
外也存在于一些正常组织细胞如视网膜、睾丸、颗粒白细胞等。
(高浓度葡萄糖,高比
生长率)
PFK(磷酸果糖激酶)的变构调节参考PPT62——65
巴斯德效应机制:
由于O2的存在,使PFK活性下降,抑制葡萄糖发酵成乙醇
克列勃特里效应机制:
葡萄糖在某一浓度下抑制了Cell色素a的合成,呼吸链运转受到影响,导致(NADH+H+)
积累,抑制丙酮酸脱氢酶系统,影响TCA循环。
第4章微生物次级代谢与调节
●次级代谢产物的定义:
次级代谢产物是某些微生物在生命活动的某一阶段产生的物质,一般在生产菌生长后期
产生,对微生物生长无大的影响。
微生物次级代谢的特征:
1 次级代谢产物一般在产生菌的生长后期形成
2 种类繁多,含有不寻常的化学键
3 一种菌可以产生结构相近的一簇抗生素
4 一种微生物的不同菌株可以产生多种在分子结构上完全不同的代谢产物。
不同种类的微
●生物也能产生同一种次级代谢产物
5 次级代谢产物的合成对环境因素特别敏感,合成信息的表达受环境因素的调节。
6 微生物的次级代谢产物的合成过程是一类由多基因控制的代谢过程。
7 初级代谢与次级代谢途径相互连接
●初级代谢与次级代谢途径相互连接
初级代谢为次级代谢提供前体化合物
次级代谢物的合成受初级代谢的调节
●次级代谢产物的类型
抗生素
n激素
n生物碱
n毒素
n色素
n维生素
●前体的定义
能被微生物直接结合到产物分子中去,而自身结构无多大变化,且具有促进产物合成的
作用的化合物,称为前体。
●前体与诱导物的区别
发生作用的时间。
(诱导物—生长期;
前体—生产期)
如果是诱导物的话,能被其结构类似物所取代。
诱导物的另一个特征是其诱导系数特别高。
●前体的限制性
前体常常是次级代谢物生物合成的限制因素。
前体物资可能不能被细胞吸收。
不能被运送到次级代谢产物合成的部位。
添加的物质不是次级代谢产物合成过程起限定作用的物质。
✧前体合成的调节机制
当初级代谢和次级代谢均需要同一种必需的前体,则低浓度的前体需先满足生长需
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