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一过式肝灌流可以立即检测流出液中化学物的瞬时转变和代谢物生成,减少代谢物积累;
可根据流出液中化学物质的变化评价灌流肝脏的活性、观察剂量-反应关系;
且易于改变受试物浓度等实验条件。
但一过式肝灌流需要大量的灌流液;
而且内源性物质不断被灌流液冲洗掉,如果某些代谢过于微弱,就不易检测出其变化。
肝萃取率高、代谢较快的药物宜用一过式肝灌流或增加循环式灌流中灌流液内药物的浓度,而肝萃取率低的药物宜进行循环式灌流。
正向灌流与反向灌流 根据灌流液流向不同灌流方法又有正向和反向之分。
绝大多数肝脏灌流采用正向设计,即灌流液经门静脉导入,由肝静脉导出。
而反向灌流由肝静脉导入,由门静脉或肝动脉导出。
Pang等[18]使用两个三通管可将正向灌流模型转换为反向灌流,并用于探测肝脏药物代谢酶的分布。
尽管认为长时间(3h)反向灌流会损害肝脏功能,但Pang等通过对钾离子、SGOT、SGPT、LDH的监测及电镜观察,发现短时间(50min)反向灌流对肝功能并无损害。
双重灌流肝脏有两条供血途径:
门经脉和肝动脉。
通常的离体肝灌流大多只经门静脉灌流而忽略了肝动脉的作用。
双重灌流既进行门经脉灌流亦进行肝动脉灌流,可更好地模拟肝脏生理体系。
但由于肝动脉太细且离门经脉太近,肝动脉不能直接插管;
通常是从腹腔动脉或大动脉或胃十二指肠动脉间接插管,实验操作难度较大。
器官灌流法在首过效应研究中的应用
在药物首过效应的研究中一过式灌流和循环式灌流应用广泛。
阮金秀等参照Pang[20]的方法做过T2毒素在灌流大鼠肠肝中的首过效应和代谢动力学的试验,大鼠用25%乌拉坦麻醉。
仰卧位固定,腹部作U字形切口,0.5×
2mm的塑管从右肾动脉插管,管尖穿过腹主动脉进入上肠系膜动脉作为灌流的入口,插管固定后立即开通灌流,随即打开胸腔,右心房上作一切口。
用塑管插入右心房,其尖端顺下腔静脉进入肝经脉作为灌流液出口。
分别采用一过式和循环式灌流进行采样检测。
一过式灌流测得T2毒素在门静脉流出液中的主要产物为HT2。
T2毒素的稳态肝,肠抽提率分别为0.978和0.454,T2在标本中的总有效清除率为7.91ml.min-1接近灌流速度,表明它在通过标本的同时即可被转化。
可知T2有明显的肝肠首过效应。
循环式灌流测得T2毒素的主要产物HT2,3’-OHHT-2和TEOL分别在30和90分钟达到高峰。
本试验的优点在于可以给标本应用体内实验不能承受的剂量,容易通过控制或改变实验条件来观察受试物在肠肝中的整个消除过程和影响因素;
由于取样容易和去除了其他器官的干扰,可以分别评价肝和肠的共同作用及各自作用,并可定量研究受试物及其代谢产物的消长动力学过程。
这一方面在药物毒物首过效应和代谢动力学的研究中有广阔的前景。
Platzer等[21]应用循环式离体大鼠肝脏灌流技术研究抗癌药喜树碱(Camptothecin,CPT)的肝脏代谢。
通过反相高效液相色谱法和质谱法检测胆汁及灌流流出液中的CPT及其代谢物,发现CPT在肝脏经羟化作用产生3个经胆汁排泄的代谢物,其中M1和M2为双羟衍生物,M3为单羟衍生物。
随后Platzer等[22]又应用该模型研究了抗癌新药羟喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)的代谢与胆汁排泄,结果显示HCPT经肝脏生物转化产生3个代谢物,M1为HCPT葡糖醛酸苷,M2为羟化HCPT葡糖醛酸苷,M3为羟化HCPT。
Salamon等[23]应用一过式离体大鼠肝脏灌流技术,对一种新型核苷酸还原酶抑制剂Amidox在肝脏的生物转化作了初步探讨。
一过式肝脏灌流还特别适用于肽类药物肝脏首过效应的研究。
大多数肽类药物进入系统循环之前经过了肝脏的首过代谢,所以口服后生物利用度很低;
分离肝细胞、肝匀浆、肝微粒体等体外方法可揭示肽类药物肝脏代谢的机制和相关代谢酶系,但不能提供关于体内首过代谢的程度的信息。
总的来说,肝脏灌流技术作为一种与在体肝脏最具可比性的体外系统,有其突出的优点[24]:
①可以在接近生理状况的条件下进行肝功能研究,因血流、血压或激素水平波动而引起的数据变动可降到最低限度;
②保持了完整的脏器和细胞结构、肝脏的生理生化特性以及位于不同亚细胞空间的代谢通路;
③排除了其他组织、脏器的干扰以及整体动物实验时的毒性问题;
④能够严格控制灌流液中受试物的浓度;
⑤易于采集血样或灌流液,可动态定量分析受试物及其代谢产物并进行结构鉴定。
肝灌流技术亦存在一定的缺陷:
如灌流实验只能在有限的时间内进行;
肝脏功能受多种因素和实验条件影响,可能有手术操作、灌流液组成、流速等;
手术及插管操作技术极复杂。
药物动力学模型法
在一些文献中已经报道了几种系统前代谢的药物动力学模型。
GibaldiandFeldman[25]介绍用三室模型来描述首过效应,之后,ColburnandGibaldi[26]提出了用药物动力学灌注法模型来描述药物的处置,适用于肝脏和肠壁的首过代谢。
以后又经过Rowland[27,28],WilkinsonandShand[29]等人的调查研究,为口服生物利用度的数学描述提供了理论依据。
尽管如此,用药动学模型研究肝脏的代谢很少用在描述口服后药物的处置的试验验证中。
在目前的研究中三点法(Three-PointsSamplinginPortalandHepaticVeinsandSystemicArtery)和利用药时曲线面积法逐渐被人们认可。
三点法[30,31]
在研究小肠药物吸收的活体试验中,有一种PS法,是利用门静脉和体动脉血药浓度的不同,来确定药物从肠进入门脉系统的吸收率和范围[32-35]。
这种方法为我们提供了药物从肠道进入门静脉系统的吸收率(Fa),局部平均吸收时间(ta)等药动学参数。
PS-DD[36-38]法是PS法的延伸,主要用来评估肠和肝的首过效应。
此法是在口服给药之后间隔很短的时间,进行动脉内给药,然后进行采样检测,计算出的药动学参数有口服生物利用度(F),平均吸收时间(MAT),药物从肠道进入门静脉系统的吸收率(Fa),局部平均吸收时间(ta),药物在肝脏中的回收率(Fh)等药动学参数。
PS-DD法是在假设吸收,代谢,消除都是线性的基础上来评估肝肠的首过效应,不适用于非线性首过效应的分析。
在当前的研究中,三点法是在PS-DD法的基础上发展起来的,优点是可以把局部吸收的动力学和肝脏的首过代谢分开来评价。
方法是分别在肝门静脉,肝静脉,股动脉进行插套管。
动脉给药之后,在规定时间进行股动脉和肝静脉采样。
90分钟之后进行口服给药,在规定时间进行股动脉和门静脉采样检测。
它的目的是通过构造米氏方程模型来澄清肝脏回收率和肝脏输入端血药浓度的关系。
5-氟脲嘧啶主要是在肝脏中代谢,是一种很好的模式药物[39,40]。
5-氟脲嘧啶仍然是结肠癌的首选药物,可以被二氢嘧啶脱氢酶(PDP)广泛代谢,此酶可以被索利夫定抑制。
通过肝脏输入和输出端血药浓度的不同,在非线性条件下来评价5-氟脲嘧啶在肠道的吸收和在肝脏中的代谢。
比较药时曲线下面积法[41,42]
比较各种给药途径的药时曲线下面积(AUC),在首过效应研究中被广泛应用。
已知药物在实验动物体内的口服生物利用度很低及在肠中的吸收率,分别评价肝脏和肠道的首过效应。
对肝脏的评价,首先在颈静脉,颈动脉和门静脉插管,然后通过颈静脉给药(iv)和门静脉给药(ip),从颈动脉采样检测,计算二者药时曲线下面积进行比较,确定肝脏首过效应的程度。
对小肠的评价,在颈动脉和门静脉进行插管,通过十二指肠滴入给药,其他方法与肝脏相同。
通过比较门静脉给药(ip)和十二指肠给药(id)药时曲线下面积也可以区分肝脏和小肠的首过效应的重要程度。
SooK.Bac等[43]人曾经做过奥替普拉(驱虫药)在大鼠肠和肝中的首过效应,首先知道以20mg/kg口服给药的生物利用度时41.8%,在肠中只有2.68%的口服药物未吸收。
以20mg/kg的剂量分别通过ig,id,iv,ip给药。
igAUC(213μmin/ml)与idAUC(212μmin/ml)相差很小,igAUC(213μmin/ml)和idAUC(212μmin/ml)与ipAUC(316μmin/ml)相差显著,得出胃内的首过效应(在大鼠胃内的吸收很少)可以忽略,肠中的首过效应显著(大约占口服剂量的32%)。
根据ipAUC(536μmin/ml)和ivAUC(319μmin/ml),得出大约有65%的口服药物进入肝脏中,有近25%的口服药物在肝脏中首过代谢。
可以断定奥替普拉的主要是在肝脏和小肠中首过代谢。
为了比较肠和肝的首过效应,也可以对十二指肠内给药和门静脉给药的进行比较。
EunJungKim[44]在布美他尼(利尿药)首过效应的研究中,用此种方法分别以10mg/kg和20mg/kg的剂量给药,得出胃中的首过效应可以忽略,首过效应主要发生在小肠中,大约有60.3%(以10mg/kg口服给药)和51.8%(以20mg/kg口服给药)的药物在小肠中被首过代谢。
检测肝脏的首过效应,通过颈静脉和幽门静脉进行静脉给药,然后通过颈动脉取样检测。
三点法和比较药时曲线面积法的共同特点是,插管技术复杂,给药技术难以把握,采血样的持续时间长,插管易脱落,所以掌握手术和插管技术是这两种方法的关键。
三点法只适用与在肝脏大量首过代谢的药物,不过可以用非线性分析。
比较药时曲线面积法,可以用来确定主要的首过代谢部位,并且可以区分它们的不同程度。
结合生理模型法
在首过代谢的研究中,运用生理模型也是一种重要的方法。
目前运用比较广泛的有两种生理模型,一种是Rowland[46,46]等在1973年提出的匀拌模型(‘well-stirred’model),另一种是Brauer[47]在1963年提出的管捆模型(‘paralleltube’model)。
这两种模型在肝脏研究中应用较多,用二者描述的生物利用度,都与肝脏酶的活性、肝静脉血流量、血浆蛋白结合率的改变有很大的关系。
在匀拌模型中,肝脏被认为是一个匀拌的容器。
肝静脉中非结合的药物才能被酶代谢。
在这个模型中,逃过肝脏首过代谢的药物的分数()[1]可表示为:
=
是肝脏的血流量;
是固有清除率,它与肝静脉中非结合药物浓度的代谢有关;
是血中非结合药物的分数。
在管捆模型中,肝脏认为是一组等效的平行管,在这些管上有酶附着并且酶活性是恒定的。
药物的浓度随着管的延伸逐渐降低。
在这个模型中没有被肝脏代谢的药物的分数()可表示为:
=EXP()
是固有清除率,它与管中非结合药物平均浓度的代谢率有关;
是血中非结合药物的分数;
当药物的生物利用度很大时,这两个模型的预言值相似;
当药物的生物利用度很小时,它们的预测值却有很大的差异。
记录表明,管捆模型计算的生物利用度的值要比匀拌模型大的多。
在两个模型的概述中,期望生物利用度与酶的活性的改变,血流量,蛋白结合率存在着关系。
这些关系可能很有用。
尽管如此,我们验证它们的有效性之后才能说明问题。
1983年Ahmad[48]已经比较了两个模型的不同。
Branch和Shand[49]曾经用匀拌模型描述过普萘洛尔在肝脏的消除,Pang等也用此模型检测过利多卡因的消除。
1978年Keiding[50]应用管捆模型描述过半乳糖在灌流猪肝中的消除。
从上述研究可以看出,应用生理模型法探讨药物的首过效应具有一定的局限性。
局限在于药物必须在肝脏首过代谢是大量的,在其他器官是少量;
药物的代谢消除是线性的。
所以,
当药物代谢是非线性的、肝脏血液是分流的、药物遭受肝肠循环、或者药物在其他器官首过消除时,这些模型不能够充分的预测药物在动物体内的生物利用度。
雷贝拉唑肝、肠首过效应研究
2方法
2.1肠道与门静脉血管通路模型(IVAP)的建立结合Kunta等建立的大白兔IVAP模型及Kim等建立的大鼠幽门静脉插管模型,首先建立大白兔IVAP模型。
手术后大白兔予以1wk的恢复期,待恢复至生理状态后行药代动力学试验。
2.2给药及取血方法雷贝拉唑粉针剂以无菌生理盐水溶解。
6只已建立IVAP模型的新西兰大白兔先行经十二指肠(duodenum,ID)给药,给药剂量分别为1.5、3、6mg·
kg~;
再行门静脉(portalvein,PV)给药,给药剂量分别为1.5、3mg·
kg~,药物从所置门静脉导管中5arin内匀速注入,给药后导管中再予以肝素钠生理盐水保留(125U·
ml。
‘);
最后行外周静脉(vein,V)给药,给药剂量分别为0.75、1.5、3mg·
kg~,药物从行耳动脉留置针保留对侧耳的耳缘静脉1arin匀速推入。
每次给药后清洗期为1wk。
给药后各时间点取血,采血方法为行耳动脉留置针保留。
外周V、PV给药取血时间点为0、5、10、l5、30、45min、1、1.5、2h;
ID给药取血时问点为0、1、3、6、10、15、30、45arin、1、1.5h。
每点取血2ml,4000r·
arin离心10min,精密取血浆1ml,并加人1%乙二胺溶液100wl,置于一80c【=保存。
2.3高效液相色谱(HPLC)检测雷贝拉唑动脉血
浆浓度
2.3.1标本处理将所取血浆全部转至试管中,加入1mlBritton.Robinson缓冲液,涡旋震荡1arin,稍静置,加入4ml乙酸乙酯,涡旋震荡5arin,4000r·
arin离心10arin,收集乙酸乙酯层,40~(2氮气吹干。
加入0.1%乙二胺乙腈溶液i00l溶解,混匀1arin,4000r·
arin离心10arin,10txl进样。
2.3.2检测条件Kromasil—C8(200millx4.6mm,
5txm)色谱柱,柱温40c(=,流动相为25nllYIO]·
L混合磷酸盐缓冲液/乙腈:
65/35(),流速1.0anl·
arin~,紫外检测波长288nan,以雷贝拉唑峰面积定量。
2.4数据分析雷贝拉唑药代动力学参数血浆药物浓度一时间曲线下面积(AUC)、半衰期()、清除率(CL)等由药理学DAS2.0软件分析。
达峰时间(T)、峰浓度(C)等采用实测值?
生物利用度(BA)、肝脏提取率(Eh)、肠道提取率(Ei)等由以下公式计算:
BA=(AUC,/dose,)/(AUC/dose,);
Eh=1一AUC、/AUC;
Ei:
1一AUC./AUC、。
所有测定数据均用±
S表示,采用SPSSI1.0统计软件进行统汁分析,采用t检验与方差分析进行统计处理。
口服天然黄体酮给药系统的设计
2.4PL首过效应测定
2.4.1尾静脉给药
随机取5只颈静脉插管术后状况良好!
己摘除卵巢的Wistar大鼠,按1sm叭g剂量尾静脉注射PL,分别于0!
10!
20而n和0.5!
l!
2!
3!
4!
6!
8!
12!
24h定时从导管取血0.5而,放置1一Zh后3000印n亡而n离心30min,分离血清,精密吸取50川测定血药浓度"
同时另取5只颈静脉术后状况良好的无卵巢Wistar大鼠,按同样剂量尾静脉注射QN,同法处理后测定大鼠体内血药浓度"
2.4.2肝门静脉给药
随机取6只颈静脉插管术后状况良好!
己摘除卵巢的Wistar大鼠,乙醚麻醉后,打开腹腔,于肝门静脉按18m叭g剂量缓缓注射PL,然后快速进行腹部缝合,随后保持动物清醒状态,同时分别于0!
ZOmin和0.5!
1!
12h定时从颈静脉导管取血0.sml,放置1一2h后3000rpn岁min离心30min,分离血清,精密吸取50川测定血药浓度"
2.4.3实验结果
2.43.1尾静脉给药
PL组和QN组血药浓度实测值和拟合值比较见Tab4一7,几b4一8,两组平均血药浓度经时曲线见Fig4一2所示,对血药浓度经时曲线进行模型拟合,以AIC最小和刃最大原则,确定PL与QN均符合二室模型,权重为l/CZ,对药动学参数进行提取,采用统计矩计算AUCO:
llifinite和MRT,结果见r几b4一9"
对药动学参数进行比较,结果PL组与QN组相比,Auc显著增加(p<
0.05),消除速率常数K,"
明显减小(P<
0.05),体内清除率CL明显减小(P<
0.05),表观分布容积v显著减小(尸<
0.05),表明PL与QN相比,能显著提高药物的生物利用度,减小药物在血液中的清除率,延长药物在血液中停留时间"
2.4.3.2肝门静脉给药
QN因内容物为油溶液,尽管用丙二醇提取出内容物,但仍存在少量油滴,所以导致肝门静脉给药后代谢减慢,体内过程误差较大,因此未进行QN的肝门静脉给药"
PL组平均血药浓度经时曲线见Fig4一3"
血药浓度减去零时值所得实测值和拟合值比较几b4一10"
对血药浓度经时曲线进行模型拟合,确定PL符合二室模型,权重为1/C2,对药动学参数进行提取,采用统计矩计算AUC和MRT,结果见几b4一11"
将肝门静脉药动学参数与大鼠尾静脉参数进行比较,结果发现,肝门静脉给药后,MRT与尾静脉相比,有统计学差异(P<
0.05),尾静脉给药后,药物的体内平均驻留时间两组均延长,这是因为据首过效应定义,口服药物在胃肠道吸收后,经门静脉到肝脏,有些药物在通过粘膜及肝脏时极易代谢灭活,在第一次通过肝脏时大部分被破坏,进入血液循环的有效药量减少,药效降低,这种现象称为首过效应"
因此经肝门静脉注射给药PL后,药物经门静脉到肝脏,存在首过效应,一部分药物被代谢,故药物在体内清除相对较快,因此其平均驻留时间较短;
而尾静脉注射给药后不存在首过效应,因此其平均驻留时间较长"
2.4.3.3不同给药途径的生物利用度比较
大鼠经灌胃!
肝门静脉及尾静脉给予PL和QN后,各给药途径的AUCO.lnfini*值及生物利用度计算结果见了1妞b4一12所示"
结果表明,大鼠灌胃PL后,绝对生物利用度F二24.51%,大鼠经肝门静脉注射给予PL后,生物利用度F二50.51%"
可见大鼠给予PL后,在实验条件下,约49.49%的PL于首过肝脏时被代谢,约26.00%的PL被胃肠道代谢"
对首过效应结果进行综合考虑,PL口服途径AuC较QN大,说明PL中的药物吸收入血的量较大;
而由肝门静脉给药的实验结果可知,PL肝脏代谢程度较大,因此说明口服途径下,即使PL存在着一定的肝脏首过效应,但由于PL促进了药物的胃肠道吸收,增加了药物的吸收程度,因此其Auc显著高于QN"
药物半衰期与给药方案
胃肠道吸收评价——药物活性评价:
代谢分析和晶型技术在药物发现中的应用研究,P120
药物排泄研究——四种新型18-甘草次酸和齐墩果酸修饰物成药性的初步评价
胃肠道吸收评价——基因多态性,溃疡的影响及雷贝拉错肝肠首过效应
2.2雷贝拉唑肝肠首过效应及抗生素对雷贝拉唑药代动力学影响的初步研究
2.2.1.实验动物
健康成年新西兰大白兔,体重2.5-3.5kg,雌雄不限,购于安徽长临河医药科技有限公司(许可证号:
SCXK(皖)2007-001)。
2.2.2实验仪器
高效液相色谱仪:
515型,美国Waters公司
2487型紫外检测器:
美国Waters公司
AT-130柱温控箱:
天津金洲科学仪器公司
HS色谱数据工作站:
V4.0+,杭州英谱科技开发有限公司
Kromasil-C8色谱柱:
200mm×
4.6mm,5um,大连依力特分析仪器有限公司
台式高速离心机(HemaTGL-16H):
珠海黑马医学仪器有限公司
DK-8D改进型电热恒温水槽:
上海顿克仪器科技有限公司
FA1104分析天平:
上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂
XW-80A型漩涡混合器:
上海医科大学仪器厂
PHs-3C型酸度计:
上海雷磁仪器厂
三洋立式医用低温保存箱:
日本三洋(SANYO)公司
定量移液器:
芬兰Biohit公司
光学显微镜:
镇江化学仪器厂
2.2.3材料与试剂
硬膜外导管(直径1mm):
购于凯思特精工塑料有限公司
动静脉留置针:
(型号22G1/0.9×
25mm),购于VasocanBraunule公司
乙腈:
色谱纯,美国TEDIA公司
甲醇:
色谱纯,上海医药化工集团
乙酸乙酯、乙二胺:
分析纯,上海试剂三厂
磷酸二氢钾、磷酸氢二钾:
广东金砂化工厂
3%戊巴比妥钠:
中国医药上海化学试剂公司
76%复方泛影葡胺:
上海旭东海普药业有限公司
肝素钠:
天津市生物化学制药厂
青霉素粉剂:
石药集团中诺药业有限公司
雷贝拉唑原料药:
由江苏奥赛康药业有限公司提供
雷贝拉唑粉针剂:
阿莫西林胶囊:
0.5g/粒,珠海联邦制药股份有限公司生产
克拉霉素:
0.25g/片,雅培制药股份有限公司提供
2.2.4实验方法
2.2.4.1实验设计
(1)肠道血管通路(IntestinalandVascularAccessPortIVAP)模型的建立:
16只大白兔经胃十二指肠静脉插管至门静脉,并行十二指肠置管,建立肠道血管通路动物模型。
(2)雷贝拉唑肝肠首过效应研究:
6只已建立IVAP模型的大白兔,依次行雷贝拉唑经十二指肠、门静脉及外周静脉不同剂量给药,给药后不同时间点取血,高效液相色谱法检测血药浓度,行药代动力学分析,计算肝脏、肠道提取率。
(3)抗生素对雷贝拉唑药代动力学影响的研究:
6只大白兔行十二指肠置管,恢复至生理状态后依次行雷贝拉唑,雷贝拉
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