生物选修3浙科版汇编Word文档格式.docx

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就是将目的基因与载体DNA连接在一起。

通常是用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），就会在目的基因和载体DNA的两端形成相同的黏性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。

4、将重组DNA分子导入受体细胞

用适当的方法将形成的重组DNA分子转移到合适的受体细胞中。

常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。

如用质粒作载体，宿主细胞应选择大肠杆菌，用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入大肠杆菌宿主细胞。

5、筛选含有目的基因的受体细胞：

并不是所有细胞都接纳了重组DNA分子，因此需要筛选含有目的基因的受体细胞。

采用选择性培养基筛选。

6、目的基因的表达：

目的基因在宿主细胞中表达，能产生人们需要的功能物质。

第二章克隆技术

一、什么是克隆

1、繁殖的方式：

（1）有性繁殖：

经过异性生殖细胞的结合，产生合子，再由合子发育成下一代个体的繁殖方式。

（2）无性繁殖：

不经过异性生殖细胞的结合，直接由母体产生下一代个体的繁殖方式。

无限繁殖产生的个体保持了亲本的遗传性状，一次产生后代的数量可以很大，可以迅速扩大其种群的数量。

3、克隆技术：

是指才众多的基因或细胞群体中通过无性繁殖和选择获得目的基因或特定类型细胞的操作技术。

在分子水平上，基因克隆是指某种目的基因的复制、分离的过程；

在细胞水平上，细胞克隆技术在利用杂交瘤制备单克隆抗体的技术中得到应用；

在个体水平上，克隆技术就是一种通过单个细胞，特别是来自特定活体的单个体细胞进行无性繁殖从而产生新个体的过程或技术。

基因克隆和细胞克隆是现代生物技术中的关键技术。

从理论上说，由于细胞核具有基因组合全套遗传信息，生物的体细胞有潜力直接发育成胚胎和形成与核供体完全相同的个体克隆。

二、植物的克隆：

1、细胞全能性

（1）植物细胞全能性：

指植物体的每个活细胞都具有遗传上的全能性，因而都具有发育成完整植株的潜能。

（2）植物细胞全能性的体现：

全能性表达的难易程度：

受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；

植物细胞＞动物细胞

①植物细胞全能性表达能力强：

实践表明，植物体的几乎所有组织（如根、茎、叶、花药、子房及幼胚等组织）的细胞，通过诱导都可再生新植株。

即植物体的每个活细胞，即使是已经高度成熟和分化的细胞，都保持了恢复到分生状态的能力，都具有遗传上的全能性。

所以植物的组织培养比动物更方便。

②不同植物或同种植物不同基因型个体的细胞全能性有差异：

由于不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间遗传性的差异，细胞全能性的表达程度大不相同。

如拟南芥、烟草和番茄等能在多个世代中保持细胞全能性的表达；

而小麦、要么和水稻等在多次继代培养后会丧失细胞全能性的表达能力。

③长期培养中，细胞全能性表达能力下降的原因：

1）遗传物质不可逆改变：

染色体畸变、细胞核变异或非整倍体产生，且其结果不可逆；

2）生长发育条件变化：

细胞或组织中激素平衡被打破，或细胞对外源生长物质的敏感性发生改变；

3）由于其他原因产生了缺乏成胚性的细胞系。

④植物克隆成功所需的条件：

1）深入探讨特定植物细胞全能性的表达条件（激素配比）；

2）在植物克隆实验中，选择性状优良、细胞全能性表达充分的基因型。

2.植物组织培养程序

（1）概念：

植物组织培养就是在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、生芽，最终形成完整的植株。

（2）培养过程：

离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体

愈伤组织：

一种相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的新生组织。

（细胞排列疏松、无规则）

脱分化：

已经高度分化的植物细胞，经过诱导重新恢复了分裂能力，产生愈伤组织的过程，又称去分化。

再分化：

脱分化产生的愈伤组织经培养，重新分化根或芽等器官的过程。

组织培养具体过程：

1配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的半固体培养基（灭菌）；

②从消毒的根、茎或叶上切取一些小组织块；

③将组织块放在培养基上培养，获得愈伤组织；

（无需光）

植物组织切口处的细胞在创伤的刺激下发生脱分化称为分裂的细胞，不断进行分裂增殖，在创伤表面形成一种由相对没有分化的活的的薄壁细胞团组成的新生组织，即愈伤组织。

④以适当配比的营养物质和生长调节剂诱导愈伤组织，直到再生出新植株。

（需要光）

（3）培养基的营养成分：

无机营养成分：

水、矿质元素（全部），如硝酸盐、铵盐

有机营养成分：

1）碳源：

蔗糖

2）含N物质：

氨基酸、维生素

3）琼脂：

0.7%—1%，起支持作用

植物生长调节剂：

细胞分裂素、生长素

PH值：

5.0－6.0

3、植物的克隆：

（1）理论基础：

植物细胞的全能性

（2）技术基础：

植物组织培养

（3）主要技术：

植物细胞培养；

植物器官培养；

原生质体培养

4、植物细胞培养

（1）概念：

指以单个游离细胞为外植体的离体无菌培养。

其目的是通过大规模的细胞培养以获得人类所需的细胞次级代谢产物。

（2）采用技术：

悬浮细胞培养：

通过液体悬浮培养使愈伤组织分散成单细胞，经适宜培养基中成分的诱导，可从单细胞依次到细胞团、球形胚、心形胚和胚状体，最后而形成新植株。

5、器官培养：

指以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的离体无菌培养。

（2）如何实现器官发生和形态建成：

主要通过平衡的植物激素配比进行调控。

1）诱导芽的分化：

细胞分裂素＞生长素（激动素）

2）诱导根的分化：

生长素（IAA（吲哚乙酸）＞细胞分裂素

（3）细胞培养和器官培养的意义：

细胞培养和器官培养时，植物克隆的结果，不一定是植物，也可以是器官，甚至是细胞群（愈伤组织）。

人们要的可以是植物，也可以是细胞或者是细胞代谢产物。

6、原生质体培养：

用纤维素酶或果胶酶水解细胞壁，获得球形的植物细胞原生质体（细胞中有代谢活性的原生质部分，包括质膜、细胞质和细胞核），用适当方法进行原生质体培养，也可获得新植株。

（2）植物原生质体的获得方法：

在0.5—0.6mol/L的甘露醇溶液环境（较高渗透压）下用纤维素酶和果胶酶混合液处理根尖、叶片、愈伤组织或悬浮培养细胞，将细胞壁消化除去，获得球形的原生质体。

问题：

为什么要加较高渗透压的甘露醇？

原因：

防止原生质体吸水胀破。

7、植物体细胞杂交技术

在原生质体培养成功的基础上，形成了体细胞杂交技术（原生质体融合）。

植物体细胞杂交是指将来自两个不同植物的体细胞融合成一个杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的方法。

（2）过程：

（3）诱导融合的方法：

物理法包括离心、振动、电刺激等。

化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

（4）融合完成的标志：

新细胞壁的形成。

（5）意义：

克服了远缘杂交不亲和的障碍。

8、植物细胞工程：

培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体）中或通过细胞融合、显微注射等将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。

9、植物组织培养的应用：

试管苗的快速繁殖、无病毒植物的培育、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产、转基因植物的培育等。

三、动物的克隆

1、动物细胞、组织培养

（1）动物细胞培养：

就是从动物机体中取出相关的组织，经过机械消化或胰酶消化，使其分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生存、生长和繁殖。

在某种程度上像体内一样呈现一定的组织特性。

（2）动物组织培养：

体外培养动物组织，使其维持生活状态或生长特性。

可以伴随组织分化，但最终成为细胞培养。

2、动物细胞培养过程：

（1）培养条件：

①无菌、无毒的环境：

培养液应进行无菌处理。

通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。

此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：

合成培养基成分：

糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。

通常需加入血清（能促进细胞的生长、增殖和贴附）、血浆等天然成分。

③温度：

适宜温度：

哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；

pH：

7.2～7.4。

④气体环境：

95%空气＋5%CO2。

O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。

（2）动物细胞培养的过程：

取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（3）培养过程中的几点说明：

①用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞：

动物组织细胞间隙中含有一定量的胶原纤维蛋白质，将细胞网络形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。

用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。

②原代培养和传代培养需要在CO2保养箱中保温培养：

通过在培养箱内模拟形成一个类似细胞或组织在生物体内的生长环境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、稳定的温度（37°

C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞或组织进行体外培养的一种装置。

③原代培养：

从机体取出后立即进行的细胞、组织培养。

④传代培养：

将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。

⑤传代培养的原因：

如果不进行传代培养，就会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。

（4）离体动物细胞的生长特性：

①细胞贴壁：

悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。

②接触抑制：

当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂。

③正常的生命活动：

生长、分裂、有规律的衰老、死亡等现象，但不分化。

（5）动物细胞培养技术的应用：

制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。

3、细胞系、细胞株：

条件适合时，可以由传代细胞建成细胞系或细胞株。

（1）细胞系：

指可连续传代的细胞。

原代培养物在首次传代时就成为细胞系。

连续细胞系：

遗传物质改变，不死性

有的连续细胞系是恶性细胞系，具有异体致瘤性；

有的连续细胞系获得了不死性，但保留接触抑制现象，不致癌。

（2）细胞株：

通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞系。

如：

单抗细胞株

细胞株一般具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和生化特性等。

遗传物质未改变。

细胞系泛指可传代的细胞，细胞株指具有特殊性质的细胞系。

4.克隆培养法（细胞克隆）：

把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术，叫克隆培养法或细胞克隆。

（2）特点：

遗传性状均一、表现的性状相似，便于研究

（3）细胞克隆的最基本要求：

保证所建成的克隆来源于单个细胞

（4）适合于克隆的细胞：

对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞

群体细胞＞单细胞

无限细胞系、转化或肿瘤细胞系＞原代细胞、有限细胞系

（5）提高细胞克隆形成率的措施：

•选择适宜的培养基

•添加血清（胎牛血清）（能促进细胞的生长、增殖和贴附）

•以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞）

•激素刺激（胰岛素等）

•使用CO2培养箱，调节PH

（6）细胞克隆的主要途径

从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。

用于研究细胞的遗传规律和生理特性。

5、细胞融合与细胞杂交：

（1）细胞融合：

指用自然或人工方法,使两个或多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。

（2）诱导融合的方法：

1）生物法：

灭活的仙台病毒诱导融合，是动物细胞融合所特有的

2）化学法：

聚乙二醇诱导融合

3）物理法：

电融合技术：

效率很高

（3）细胞杂交：

基因型不同的细胞间的融合称为细胞杂交。

（4）动物细胞融合技术的应用

由于细胞杂交中染色体容易丢失，因此利用杂交细胞检测特定染色体丢失与特定基因产物减少的对应关系，可以进行基因定位。

（5）动物细胞融合的意义：

克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。

（6）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

比较项目

细胞融合的原理

细胞融合的方法

诱导手段

用途

植物体细胞杂交

细胞膜的流动性

去除细胞壁后诱导原生质体融合

离心、电刺激、振动，聚乙二醇等试剂诱导

克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株

动物细胞融合

使细胞分散后诱导细胞融合

除应用植物细胞杂交手段外，再加灭活的病毒诱导

制备单克隆抗体的技术之一

6、杂交瘤技术和单克隆抗体制备：

（1）杂交瘤技术：

将抗体生成细胞同瘤细胞进行杂交的技术。

该技术解决了抗血清的异质性问题。

（2）杂交瘤技术制备单抗体：

①抗体：

一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。

从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

2杂交瘤技术制备单抗体的基本方法：

1）用外界抗原刺激动物（如小鼠），使其发生免疫反应，使B淋巴细胞产生抗体；

2）利用仙台病毒或聚乙二醇等作介导，使经免疫的动物的脾细胞与可以无限传代的骨髓瘤细胞融合；

3）经过筛选、克隆培养，获得来自单一细胞的既能产生特异抗体、又能无限增殖的杂交瘤细胞克隆。

3单克隆抗体的制备过程：

④制备过程中的相关问题：

1）单克隆抗体的制备运用了哪些动物细胞工程技术？

答：

动物细胞培养、动物细胞融合

2）制备过程中进行了几次筛选？

每次筛选的目的是什么？

答：

两次筛选：

在细胞融合后选出杂交瘤细胞；

对杂交瘤细胞进行培养后选出能产生特定抗体的细胞群，继续培养。

（3）杂交瘤细胞的特点：

既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

（4）杂交瘤技术制备单克隆抗体的优点：

可以从特异抗原成分比例极少的抗原混合物中获得单抗。

特异性强，灵敏度高。

（5）单克隆抗体的作用：

①作为诊断试剂：

准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。

②用于治疗疾病和运载药物：

主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。

7、动物细胞全能性的表现程度：

受精卵→二分裂球→四分裂球→八分裂球→桑椹胚→囊胚→原肠胚→组织、器官→幼体

①动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个细胞具有全能性。

②随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出各种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞。

③有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能干细胞。

在动物体内，已经分化的细胞不再分化为其他细胞，甚至终生不再分裂，如高度分化的神经细胞

④动物细胞全能性的表现程度

受精卵＞胚胎干细胞＞多能干细胞＞单能干细胞＞体细胞

低等动物细胞：

全能性一般容易体现。

癌细胞：

仍能逆转为正常细胞。

无论分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可以保留。

8、动物难以克隆的根本原因：

基因的选择性表达（差异表达），使得细胞中合成了专一的蛋白质，即动物细胞已经发生了分化。

分化的细胞，其细胞核中物种的基因组完整，具有全能性，但其基因组中的基因不同时进行活动，有的基因开放，有的基因关闭（如哺乳动物的红细胞），不能像受精卵那样发挥细胞的全能性，以此为起点进行细胞克隆，难度很大。

9、细胞核移植实验和动物的克隆繁殖：

（1）核移植概念：

就是利用一个细胞的细胞核（核供体）来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”。

（2）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。

（3）选用去核卵（母）细胞的原因：

卵（母）细胞比较大，容易操作；

卵（母）细胞细胞质多，营养丰富。

（4）体细胞核移植的大致过程是：

核移植

胚胎移植

（5）多莉的培育用到了哪些技术？

答：

核移植、动物细胞培养、胚胎移植

（6）体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？

1）高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。

2）在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。

（7）体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理有哪些？

1）重组卵细胞最初分裂时虽然复制了DNA，但转录并未开始

2）重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细胞的阻止核基因表达的调节蛋白。

3）重组卵细胞开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因，进而调控胚在代孕母亲子宫中的进一步发育。

。

4）核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术，有利于核的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。

（8）体细胞核移植技术的应用：

①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；

②保护濒危物种，增大存活数量；

③生产珍贵的医用蛋白；

④作为异种移植的供体；

⑤用于组织器官的移植等。

（9）体细胞核移植技术存在的问题：

克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

（10）动物克隆成功的条件：

1）具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞。

如：

乳腺上皮细胞；

2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质。

去核卵的细胞质；

3）完成胚胎发育的必要的环境条件。

诱导重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境

10、练习：

（1）用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）

A、容易产生各种变异B、具有更强的全能性

C、取材十分方便　　D、分裂增殖的能力强

（2）下列为有关动物细胞培养的叙述，其中不正确的是（）

A．用于培养的细胞大都取自胚胎或幼龄动物的器官或组织

B．将所取的组织先用胰蛋白酶等进行处理使其分散成单个细胞

C．在培养瓶中要定期用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离，制成悬浮液

D．动物细胞培养只能传50代左右，所培养的细胞全部衰老死亡

（3）用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（）

A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基

C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性

（4）动物细胞克隆是指（）

A．一个单细胞培养成一个新的细胞群的技术

B．一个重组细胞经分裂、分化发育成一个动物个体的技术

C．几个同种动物的细胞培养成一个新的细胞群的技术

D．一个卵裂球经胚胎分割发育成四个细胞群的技术

（5）某研究小组为测定药物对体外培养细胞的毒性，准备对某种动物的肝肿瘤细胞（甲）和正常肝细胞（乙）进行动物细胞培养。

下列说法正确的是（）

A.在利用两种肝组织块制备肝细胞悬液时，也可用胃蛋白酶处理

B.细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是刺激细胞的呼吸

C.甲、乙细胞在持续的原代培养过程中，乙会出现停止增殖的现象

D.仅用该培养液也能用来培养乙肝病毒

（6）下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是（）

A.培养中的人效应T细胞能产生单克隆抗体

B.培养中的人B细胞能够无限地增殖

C.人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株

D.用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞

（7）世界上第一只克隆绵羊“多莉”的培育等程序如图所示。

请仔细看右图后回答问题：

1）图中ａ过程为__________。

通过ａ过程形成的重组细胞核遗传物质与质遗传物质各来自哪里？

__________

2）实施ａ时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是：

__________。

3）b过程细胞分裂的方式是__________，此过程是否进行细胞分化？

__________（答“有”或“无”）

4）图中c所指过程为__________，图中d指的是克隆绵羊“多莉”经过在母体子宫内__________后__________。

5）“多莉”面部的毛色和性别与__________绵羊相同，请根据遗传学原理说明判断依据：

__________。

6）若不考虑环境因素影响，多莉的性状是否全部像以上绵羊？

为什么？

7）植物组织培养之后，克隆绵羊培育成功，证明动物__________。

8）图中技术具有多种用途，但是不能（）

A.有选择地繁殖某一性别的家畜B.繁殖家畜中的优良个体

C.用于保存物种D.改变动物的核基因

（9）在现有技术条件下，还不能将从动物体内分离出来的成熟的体细胞直接培养成一个新个体，而是必须将体细胞的细胞核移植到去核的卵细胞中才能发育成新个体，你认为原因最可能是（）

A.卵细胞大，便于操作B.卵细胞含有的营养物质多

C.卵细胞的细胞质可使体细胞核全能性得到表达D.重组细胞才具有全能性

答案：

（1）D；

（2）D（3）A（4）A（5）C（6）D

（7）：

1）细胞核移植；

2）具有调控细胞核发育的细胞质物质；

3）有丝分裂；

有；

4）胚胎移植；

妊娠；

出生；

5）白面；

“多莉”绵羊的核基因和性染色体全部来自白面绵羊；

6）卵细胞细胞质的遗传物质也能控制某些性状；

7）细胞核也具有全能性；

8）D；

（9）C

第三章胚胎工程

一、