生物发光共振能量转移Word文件下载.docx
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3、BRET实验;
4、实验结果分析及提交实验报告
客户提供
1、目的基因cDNA(也可由我公司提供基因克隆)
2、用于实验细胞(如果我公司细胞库有可不需提供)
公司提供
详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。
服务周期和价格
具体咨询本公司
荧光共振能量转移(FRET)
荧光共振能量转移-FRET(FluorescentResonanceEnergyTransfer)
指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移。
(1)FRET发生条件:
能量匹配:
供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。
供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠(>
30%);
作用距离:
供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm;
FRET效率公式:
用于计算分子/基团间作用距离R
偶极-偶极作用:
供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。
(2)FRET的应用:
通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息(作用距离、作用方向、能量传递效率)。
常用于解决如下问题:
蛋白分子的共定位;
蛋白分子聚合体;
转录机制;
转化途径;
分子运动;
蛋白折叠等生物学问题。
(3)FRET常见的供体-受体荧光分子对:
荧光蛋白类:
染料类:
FRET检测HIV附属蛋白与细胞膜CD分子相互作用
摘自:
AFlowCytometry-BasedFRETAssaytoIdentifyandAnalyseProtein-ProteinInteractionsinLivingCells
CarinaBanning,Jo¨
rgVotteler,etal.
图释:
流式细胞仪FACSAria检测FRET信号。
(a)活的293T细胞分别单独转入CFP、YFP、CFP/YFP、CFP/YFP融合蛋白作为对照,确定最好的圈门方式为CFP/FRET。
(b)293T细胞经过2%PFA处理后,YFP荧光强度出现明显下降。
筛选有相互作用的未知蛋白质的流程
流式细胞仪FACSAria进行FACS-FRET高通量筛选感兴趣蛋白相互作用的未知蛋白。
(a)FACS-FRET筛选流程。
(b)在活的293T细胞中转入Vpu-YFP作为诱饵,与等量的CFP融合蛋白(蛋白的cDNA库)相互作用36小时后,分选FERT+细胞。
FRET研究蛋白酶功能
DetectionofInfectivePoliovirusbyaSimple,Rapid,andSensitiveFlowCytometryMethodBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferTechnology
JasonL.Cantera
etal.Appliedandenvironmental
microbiology,Jan.2010,p.584-588
流式细胞仪FACSAria检测脊髓灰质炎病毒(PV1)10倍感染BGM-PV细胞,8小时后上机检测。
A~C病毒浓度分别为0.4~0.004,D为阴性对照。
双分子荧光互补技术BiFC(BimolecularFluorescenceComplementation)
是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段,分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合,只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下,两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白,发出荧光。
活细胞收集后,在流式细胞仪中的检测是实时进行的,只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号,因此,不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。
双分子荧光互补技术原理示意图
(a)诱饵和捕获蛋白分别携带CYFP和NYFP两段YFP荧光蛋白片段(b)诱饵和捕获蛋白结合同时CYFP与NYFP形成YFP(c)形成的YFP发出荧光
(1)BiFC检测的特点:
活细胞分析;
可以用于研究2种或2种以上的启动子调控之下的蛋白质相互作用;
具有很高的信噪比,弱蛋白相互作用也可以检测到(>
7nm)。
(2)可用于BiFC的荧光蛋白:
GFP、BFP、CFP、YFP,生理条件可用的黄色的Venus和citrine,青色的cerulean;
红色系统:
mRFP2Q66T、mCherry;
Venus(EYFP的变体)是目前用于BiFC分析最多的荧光蛋白,因为其荧光强且背景敏感度降低,是BiFC分析理想的荧光蛋白。
常见的用于双分子荧光互补技术的荧光蛋白
BiFC研究复合体中亚基间的相互作用
DetectionandCharacterizationofInfluenzaAVirusPA-PB2InteractionthroughaBimolecularFluorescenceComplementationAssay
JosephN.Hemerka,DanWang,etal.JOURNALOFVIROLOGY,Apr.2009,p.3944-3955
流式细胞仪FACSCalibur检测流感病毒复合体中亚基PA-PB2间的相互作用。
(B)流式检测同时转入PA/PB2的COS-1细胞及单转入PA-VC的细胞的Venus荧光信号,显示转入24小时后的荧光强度。
(C)萤火虫荧光蛋白酶显示,转入单或双质粒的细胞,萤火虫荧光蛋白酶活性一致。
BiFC研究信号传导通路中蛋白质间的相互作用
Characterizationofthelatentmembraneprotein1signalingcomplexofEpstein-Barrvirusinthemembraneofmammaliancellswithbimolecularfluorescencecomplementation
PoojaTalaty,AmandaEmery,etal.VirologyJournal2011,8:
414
流式细胞仪FACSLSRII检测BiFC信号。
LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突变体分别与CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3转入细胞内,检测其相互作用。
曲线蓝色部分为出现YFP的荧光阳性表达,表明LMP1与CYFP、CYFP均存在相互作用。
科普一下SCI
《科学引文索引》(ScienceCitationIndex,简称SCI)于1957年由美国科学信息研究所(InstituteforScientificInformation,简称ISI)在美国费城创办,是由美国科学信息研究所(ISI)1961年创办出版的引文数据库。
SCI(科学引文索引)、EI(工程索引)、ISTP(科技会议录索引)是世界著名的三大科技文献检索系统,是国际公认的进行科学统计与科学评价的主要检索工具。
1976年,ISI在SCI基础上引出期刊引用报告(journalcitationreport,JCR),提供了一套统计数据,展示科学期刊被引用情况、发表论文数量以及论文的平均被引用情况。
在JCR中可以计算出每种期刊的影响因子(ImpactFactor,IF)。
影响因子的高低,在一定程度上可以反应一个期刊的影响力。
(XX百科)
期刊的影响因子(Impactfactor;
IF)计算方式:
IF2014=(该杂志2012-2013年发表文章在2014年被引用的次数/
(该杂志2012-2013年发表文章的总数)
附件是最近两年的SCI期刊列表,2014年植物学类我红色标注了部分,不过期刊名都是缩写,2013年的是全称期刊名。
影响因子从高到低排列,大体代表了期刊的水平档次。
三大国际顶尖期刊CNS,指CELL,NATURE,SCIENCE。
国际植物学专业期刊中,最好的研究论文期刊是PlantCell(IF2004=9.338),当然今年新创刊的NATUREPLANTS估计不久的将来会后来居上。
最好的3本综述类期刊是AnnualReviewofPlantBiology,TRENDSINPLANTSCIENCE和CURRENTOPINIONINPLANTBIOLOGY。
中国主办的期刊中,生物类最高的是CELLRESEARCH(CELLRES,IF2004=12.413),植物类最高的是MolecularPlant(MOLPLANT,IF2014=6.337)。
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- 生物 发光 共振 能量 转移