实验设计及响应值Word格式文档下载.docx

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目前已报道[3，4，5]能较多地积累谷胱甘肽的菌株主要有酵母和大多数革兰氏阴性菌，采用的菌种选育方法主要是传统的化学诱变法（亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等）和物理诱变法（紫外线和X射线）相结合，得到的突变株以1，2，4—三唑和叠氮化钠抗性株、乙硫氨酸抗性株、甲硫氨酸敏感株、丙酮酸抗性株、二硫化四甲基秋蓝姆抗性株为主。

但是利用γ射线对谷胱甘肽产生菌株进行诱变，同时获得氯化锌抗性标记的高产菌在国内尚未见报道。

国内对菌体积累谷胱甘肽的培养条件报道往往是采用单因素多水平的优化，未考虑碳源、氮源、无机离子等多因素之间的协同作用[6]。

作者从实验室收集和保藏的200余株酵母中筛选到了一株具有一定谷胱甘肽生产能力的酿酒酵母，通过进一步紫外线和γ射线诱变，得到了抗氯化锌和乙硫氨酸的谷胱甘肽高产菌，同时应用Plackett-Burman实验设计和响应面分析方法对谷胱甘肽高产菌的培养条件进行了系统优化。

本文报道该菌种的筛选与选育及培养条件的优化，拟为工业化应用奠定基础。

1材料与方法

1.1菌种来源

酿酒酵母（S.cerevisiae），浙江工业大学微生物实验室收集和保藏。

1.2培养基及培养条件

1.2.1斜面培养基（完全培养基）及培养条件：

培养基：

酵母膏3.0g，麦芽汁3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，琼脂20.0g，定容至1L水中，pH自然，1.0×

105Pa灭菌20min。

培养条件：

28℃，培养1～2d。

1.2.2平板选择培养基及培养条件：

（1）ZnCl2选择培养基：

斜面培养基+1360.0mg/lZnCl2，pH自然，灭菌20min；

（2）乙硫氨酸选择培养基：

斜面培养基+600.0mg/l乙硫氨酸，pH自然，1.0×

28℃，培养5～7d。

1.2.3种子培养基及培养条件：

酵母膏3.0g，麦芽汁3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10.0g，定容至1L水中，pH自然，250mL三角瓶装30mL培养基，1.0×

28℃，摇床转速为200r/min，培养22h～23h。

1.2.4发酵培养基及培养条件：

葡萄糖1.95%，糖蜜1.95%，蛋白胨3.0%，Cys·

HCl9.8×

10-2%，MgSO4·

7H2O0.5%，甲硫氨酸4.8×

10-2%，生物素24.0μg，肌醇75.0mg，酵母膏0.5g，麦芽汁30mL，NH4H2PO45.5×

10-1g，VB10.8mg，（NH4）2SO412.4g，K2HPO43.0g，FeSO43.0×

10-3g，ZnSO43.0×

10-3g，CuSO40.5×

10-3g，定容至1L水中，pH5.0，250mL三角瓶装30mL培养基，0.7×

105Pa灭菌30min。

接种量为10%，28℃，摇床转速为200r/min，培养3d。

1.3诱变处理

1.3.1紫外线处理：

取培养1～2d的新鲜斜面，用无菌生理盐水洗下菌体制成菌悬液，经玻璃珠振荡打散和脱脂棉过滤后得单细胞悬浮液，调整菌悬液菌数108个/mL左右，取3mL菌悬液至无菌的小平皿中，在15W紫外灯（距离30cm）照射下，磁力搅拌30S，菌悬液在无菌室红灯下适当稀释后涂平板，平板倒置于28℃恒温培养箱中培养5～7d。

1.3.260Coγ射线辐照处理：

采用培养好的新鲜试管斜面直接进行辐照。

分别以0.5KGy、2.0KGy剂量对试管中菌体进行60Coγ射线辐照，用无菌生理盐水将经辐照处理后的斜面制成菌悬液，并经适当稀释后涂平板，平板倒置于28℃恒温箱中培养5～7d。

1.4菌种诱变程序

出发株→紫外线辐照→自然分离→60Coγ射线辐照→谷胱甘肽高产菌。

1.5分析方法

1.5.1胞内谷胱甘肽含量测定：

ALLOXAN试剂衍生法，见文献[7]。

1.5.2生物量测定：

取10mL发酵液，于4500r/min离心4min，收集菌体，经蒸馏水洗涤菌体两次，弃去上清液，湿菌体经105℃烘干至恒重后称重。

2结果

2.1诱变出发株的确定

经对本实验室收集和保藏的200余株酵母进行摇瓶初筛和复筛，其中ZG346号酿酒酵母谷胱甘肽产量和谷胱甘肽含量最高，其谷胱甘肽产量为36.9mg/l，谷胱甘肽含量为4.7mg/克干细胞，确定以ZG346菌株作为诱变育种的出发菌株。

2.2筛选平板中ZnCl2浓度的选择

Zn2+是多种脱氢酶、脱羧酶和肽酶的辅因子[8]，是酵母生长所需的微量元素。

在低浓度时有促进酵母生长的作用[9]，但高浓度的Zn2+对酵母有杀菌和抑菌作用。

ZnCl2浓度与致死率的关系如图1所示，由图可见，培养基中ZnCl2的浓度与实验菌株的致死率之间存在着明显的剂量效应关系，随着ZnCl2浓度的提高，致死率逐渐提高。

当ZnCl2浓度为680mg/l时致死率为80%，ZnCl2浓度超过2040mg/l时致死率100%，本文选取致死率为93.5%的ZnCl2浓度1360mg/l作为选择性平板所用剂量。

图1ZnCl2浓度与致死率的关系

Fig.1TherelationshipbetweenconcentrationofZincchlorideandlethality

2.3诱变处理

2.3.1紫外线诱变处理

对ZG346菌株采用紫外线诱变处理，将诱变处理后的菌悬液涂布于完全培养基和ZnCl2选择培养基上，培养后从平板上挑选生长快、菌落大的单菌落各20个接种斜面，将各突变株与出发株分别接种至种子培养基和发酵培养基，发酵结束后测定生物量和谷胱甘肽产量，突变株的平均产量、最高产量、正变率及致死率结果见表1，随机挑选的部分突变株的摇瓶发酵结果见表2。

表1紫外诱变及其ZnCl2处理对菌种GSH积累的影响

Table1TheeffectofUVandzincchlorideonglutathioneaccumulation

Strains

GSHcontent

（mgGSH/gdriedcell）

GSHyield

（mg/l）

PostiveMutantrate

（%）

Lethality

Average

Maximum

No.346

UVresistantmutant

UV-andZincchloride-mutant

4.7

6.0

7.1

9.6

11.4

36.9

45.1

53.4

78.1

92.2

—

52.3

63.8

78.6

92.5

表2部分突变株摇瓶发酵结果

Table2Theflaskcultureresultofanystrains

Strains

Biomass

（g/L）

GSHyield（mg/l）

Increaserate（%）

（mgGSH/gdriedcell）

Increaserate/（%）

346

UVZn10-3

UVZn10-5

UVZn10-11

UVZn10-17

UVZn10-22

UVZn10-25

UVZn10-29

7.8

8.1

11.9

7.4

9.3

8.2

36.0

61.9

44.8

44.0

56.3

67.9

150.0

-2.5

66.3

21.3

19.2

52.7

84.2

3.0

8.4

4.8

5.4

9.4

9.2

141.1

-36.0

77.3

1.9

22.4

98.9

94.5

表1结果可见，抗紫外线和ZnCl2的双抗突变株的谷胱甘肽平均含量、平均产量均高于出发株和抗紫外线单抗突变株，同时其正变率亦高于抗紫外线突变株，这表明应用ZnCl2作高产突变株的筛选剂筛选效果明显好于传统的随机筛选。

由表2可见：

（1）抗紫外线和ZnCl2突变株UVZn10-3谷胱甘肽含量和产量最高，每克干细胞内谷胱甘肽含量达11.4mg，较出发株提高141.1%，谷胱甘肽产量为92.2mg/l，较出发株提高150.0%；

（2）谷胱甘肽是胞内产物，一定的生物量是高产的前提。

UVZn10-3菌株谷胱甘肽产量达92.2mg/l，其生物量只有8.2g/L，而UVZn10-5菌株生物量达11.9g/L，但谷胱甘肽产量只有36.0mg/l，可见生物量与产量并不完全成正比。

因此在菌种筛选时应选择谷胱甘肽含量高的突变株，再通过培养条件优化提高其生物量，从而达到提高产量的目的。

为避免表型延迟现象引起的菌种不纯，进一步将紫外线、ZnCl2双抗突变株UVZn10-3进行自然分离，获得了谷胱甘肽产量比UVZn10-3菌株提高41.8%的纯化菌株H8。

2.3.260Coγ射线诱变处理

以H8为出发菌株，经剂量2.0KGy、0.5KGy的60Coγ射线辐照处理后，将诱变后菌悬液涂布于完全培养基、氯化锌选择培养基、乙硫氨酸选择培养基上，挑选生长快、菌落大的单菌落各20个接种斜面，经摇瓶二级发酵后测定生物量和谷胱甘肽含量，结果如图2所示。

图260Coγ射线剂量和筛选平板对菌体积累GSH的影响

Fig.2Theeffectof60Coγ-raydosageandscreeningflatonglutathioneaccumulation

AverageGSHyield，AverageGSHcontent，

MaximumGSHyield，MaximumGSHcontent

A0.5KGy60Coγ-rayirradiation,ethionineselectivemedium;

B2.0KGy60Coγ-rayirradiation,ethionineselectivemedium;

C0.5KGy60Coγ-rayirradiation,completemedium;

D2.0KGy60Coγ-rayirradiation,completemedium;

E0.5KGy60Coγ-rayirradiation,Zincchlorideselectivemedium;

F2.0KGy60Coγ-rayirradiation,Zincchlorideselectivemedium

由图2可见，在6组试验中，以0.5Kgyγ射线辐照后涂布于乙硫氨酸平板上筛选出来的菌株结果最好，不光正变幅度大，正变幅度率也高。

这是由于乙硫氨酸是谷胱甘肽的代谢类似物，抗乙硫氨酸突变株能有效解除菌体自身的反馈调节，因此，该筛选模式有利于选育正向突变株。

经0.5Kgyγ射线辐照后的突变株中，编号为0.5Eth400-5乙硫氨酸抗性突变株最优，该菌株谷胱甘肽产量为166.0mg/l，较原始菌株ZG346提高350.0%，每克干细胞内含谷胱甘肽19.8mg，较原始菌株ZG346提高318.6%。

2.3.3突变株稳定性考察

用群体连续传代及低温保藏定期传代的方法考察了0.5Eth400-5突变株高产基因的稳定性。

如表3所示，菌株0.5Eth400-5斜面连续传10代，谷胱甘肽产量下降10.7%，生物量下降2.4%。

同时将该菌株低温保藏于4℃冰箱中，每月传1代，共传4代，谷胱甘肽产量仅下降6.0%，说明该突变株具有良好的稳定性，但是对该菌株进行定期复壮也是很有必要的。

表3突变株稳定性考察结果

Table3Theresultsofthestabilityofthemutant

Timesofsubculture

（g/L）

Decreaserate（%）

（mg/L）

Decreaserate（%）

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

8.3

0.0

1.2

2.4

166.0

163.5

161.3

160.0

156.0

152.8

151.4

150.3

149.0

148.6

148.2

1.5

2.8

3.6

8.0

8.8

9.5

10.2

10.5

10.7

注：

表中数据均取自三个平行实验的平均值

2.4培养条件的优化

2.4.1种龄对菌体生长的影响

图3为菌种种子培养的生长曲线。

从图3可以看出种子培养到22h～23h时，菌种处于对数生长的后期，所以合适的种龄为20h-22h。

图3菌株0.5Eth400-5在种子培养基中的生长曲线

Fig.3Thegrowthcurveofstrain0.5Eth400-5intheseedmedium

2.4.2碳源对菌体积累谷胱甘肽的影响

改变发酵培养基中不同碳源，保持其他成分不变，在相同培养条件下摇瓶发酵，测定谷胱甘肽产量，结果见表4。

从表4可以看出有机复合碳源产谷胱甘肽的能力好于单一碳源，其中以1.5%糖蜜和1.5%葡萄糖复合的碳源最有利于菌体积累谷胱甘肽，此时谷胱甘肽产量为172.2mg/l，比单一葡萄糖高35.5%，比单一糖蜜高19.4%。

表4碳源对菌体积累谷胱甘肽的影响

Table4Effectofcarbonsourcesonglutathioneaccumulation

Carbonsources

GSHyield（mg/l）

Category

Concentration（%）

molasses

molasses+glucose

saccharose

glucose

glucose+saccharose

1.5+1.5

1.8+1.2

144.2

172.2

159.7

127.1

163.2

2.4.3氮源对菌体积累谷胱甘肽的影响

为了研究氮源对菌体积累谷胱甘肽的影响，分别选取了几种常用的无机和有机氮源进行研究，结果见表5。

由表可见，有机氮源蛋白胨产谷胱甘肽的能力明显好于无机氮源，以蛋白胨为氮源，谷胱甘肽产量达161.1mg/l，比（NH4）2SO4高10倍，比（NH4）2HPO4高2倍，比尿素高4.7倍。

表5氮源对菌体积累谷胱甘肽的影响

Table5effectofnitrogensourcesonglutathioneaccumulation

Nitrogensources

Peptone

（NH4）2SO4

NH4Cl

（NH4）2HPO4

urea

3.5

2.0

161.1

14.6

53.7

28.2

2.4.4培养基的初始pH对菌体积累谷胱甘肽的影响

将发酵培养基用1mol/LNaOH或1mol/LHCl溶液调成不同pH，分别对培养基pH4.5到pH7.0每隔0.5个单位进行初始pH对谷胱甘肽积累的影响试验。

结果（图4）表明，菌株积累谷胱甘肽的能力以酸性条件下为宜，在pH5.0条件下谷胱甘肽含量最高，含量达163.5mg/l。

图4培养基的初始pH对菌体积累谷胱甘肽的影响

Fig.4EffectofinitialpHonglutathioneaccumulation

图5培养温度对菌体积累谷胱甘肽的影响

Fig.5Effectoftemperatureonglutathioneaccumulation

2.4.5培养温度对菌体积累谷胱甘肽的影响

将发酵培养基pH值均调至5.0，分别从24℃到32℃每隔2℃进行了培养温度对谷胱甘肽积累的影响试验，试验结果如图5所示，在26℃-28℃之间，温度波动对菌体积累谷胱甘肽的影响小于5%，以28℃为该菌体积累谷胱甘肽的最适培养温度，谷胱甘肽含量为163.35mg/l，当温度超过30℃时谷胱甘肽含量明显下降，这可能与谷胱甘肽易在高温下被氧化的性质有关.

2.4.6接种量对菌体积累谷胱甘肽的影响

将新鲜培养20h-22h的种子液分别以6%，10%，14%，18%接种量接种于初始pH值为5.0的发酵培养基中，于28℃培养72h后测定谷胱甘肽的含量，结果表明（如图6所示），以10%的接种量最佳。

图6接种量对菌体积累谷胱甘肽的影响

Fig.6Effectofinoculumsizeonglutathioneaccumulation

2.4.7溶氧对菌体积累谷胱甘肽的影响

酵母产谷胱甘肽是一个需能耗氧过程，所以有必要考察通气量对菌体积累谷胱甘肽的影响。

在250mL三角瓶中分别装入20mL、30mL、40mL、50mL、60mL的发酵培养基，在其他条件一致的情况下进行发酵试验，结果如图7所示，菌体积累谷胱甘肽适宜的装量为250mL三角瓶中装30mL发酵培养基。

不同的摇床转速（140r/min、170r/min、200r/min、230r/min、260r/min）对菌体积累谷胱甘肽的影响如图8所示，以200r/min摇瓶发酵培养时，谷胱甘肽的含量最高（163.55mg/l）。

当转速过高，溶氧过剩的情况下谷胱甘肽易被氧化。

图7摇瓶装量对菌体积累谷胱甘肽的影响图8摇床转速对菌体积累谷胱甘肽的影响

Fig.7EffectofmediumvolumesonglutathioneFig.8Effectofrotatingspeedonglutathioneaccumulationaccumulatio