物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响Word格式文档下载.docx

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（2011BiologicalEngineering,DepartmentofBiologyandChemistryEngineering,Shaoyang

Abstract

Objective:

TofindoutthebestmaterialpretreatmentextractiontechnologymakestheGLPextractionyieldashighaspossiblebystudyingontheextractionandpurificationofGanodermalucidumpolysaccharides（GLP）fromGanodermalucidum.Methods:

Toinvestigatethebakingtemperature,materialsizeandUVprocessingtimeofmaterialpre-treatmentconditionsonextractionofGLPinfluencebasedonsinglefactorexperiment,usingenzymaticextractionmethodandtakingGLP’syieldastheindex.TooptimizetheoptimumconditionsofextractingGLPfromGanodermalucidumpowderbytheorthogonaltest,whichapplyultravioletandvisiblespectrophotometry（UV-vis）todeterminethecontentofGLP.Results:

TheresultsoforthogonaltestshowthatthemainfactorswhichinfluenceGLP’syieldinenzymatictextractionwiththematerialpreprocessingareasfollows:

BorC>

A（Aisthebakingtemperaturet,Bisthematerialsize,CisUVprocessingtime）,andthebestparametercombinationisB2C2A1.Thatistosay,Theoptimumconditionsinultrasonicenzymatictextractionwiththematerialpreprocessingarethatthematerialsizeis80mesh,bakingtemperatureis75℃,uvprocessingtimeis35min,andGLP’syieldisupto1.55%.Conclusion:

basedonthematerialpretreatmentcanbefoundthatcomparedwiththeextractionofrawmaterialpretreatment,ganodermalucidumpolysaccharidesextractionyieldwassignificantlyimproved.

Keywords:

Pretreatment;

Ganodermalucidumpolysaccharide（GLP）;

Enzymaticmethod；

Uv-visspectrophotometry

目录

摘要Ⅰ

AbstractⅡ

1绪论1

1.1课题研究的背景和意义1

1.2灵芝多糖研究的现状及水平1

1.3本论文研究的主要内容4

1.4灵芝多糖的提取4

2材料与方法6

2.1实验试剂与材料6

2.2主要仪器与设备6

2.3研究方法7

2.4检测方法8

3结果与分析10

3.1葡萄糖标准曲线的绘制10

3.2单因素试验结果与分析10

3.3正交试验结果与分析13

4结论16

5展望17

参考文献18

致谢20

1绪论

1.1课题研究的背景和意义

灵芝一般用于医学，是非常珍贵的中国传统医学药物，含有大量的药物的有效成分，包括从灵芝中提取的灵芝多糖。

灵芝多糖是一种具有抗衰老、抗肿瘤以及清除自由基功能的一种非特异性免疫刺激剂[1]。

由此对灵芝中有效成分的提取即成为一项具有重大意义的工程，目前社会上新出行的高效降压茶其有效成分即为灵芝中的灵芝多糖，目前实际生产中，溶剂提取法是提取灵芝多糖的最普遍且常用的方法，此种方法主要是用水、稀碱、二甲基亚砜等有机溶剂进行提取。

但是此类法成本太高，并且工艺技术很繁复，工作量非常庞大，生产过程不容易操控，不稳定因素很多，而且此类方法对有效成分的损耗很大，不利于生产成本的降低[2]。

尤其是工艺废料较难处理，会对环境造成严重污染，并对人体健康有一定的损害，不利于当前社会倡导的可持续发展。

因为灵芝多糖的提取率非常之低，所以灵芝多糖的价格非常的昂贵，所以为了加大高效降压茶的有效成分灵芝多糖的产量，满足社会群众的需要，最大限度的对灵芝多糖的提取，要改善灵芝多糖的提取工艺，观察不同的单因素实验对灵芝多糖提取率有何影响，并且能够最大限度的增加灵芝多糖提取率就成为了一门尤为重要的工艺[3~4]。

本实验研究主要是以灵芝子实体为原料，以灵芝多糖提取率为参考目标，采用紫外-可见分光光度法测定OD值并计算得到多糖的得率，然后针对酶法提取灵芝多糖的预处理因素进行试验研究，采用正交实验得出单因素处理对酶法提取灵芝多糖的影响，为灵芝子实体更进一步的开发研究提供了理论基础[5]。

1.2灵芝多糖研究的现状和水平

1.2.1灵芝多糖常规介绍

（1）灵芝多糖的简介

因为灵芝多糖有许多有利于健康的原因,经常用于人的身心发展,而且具有很高的药用价值，高血压、高胆固醇、糖尿病患者需要的健康的灵芝类食品。

灵芝多糖可以用于加入固体食物中,如茶,咖啡,啤酒等饮料不改变原有的独特风味而且具有药用价值,这些都是最具功能性发展前景的食品。

根据《美国中成药药典与治疗概要》对灵芝的记录的纲要，同样表明了国际医学界和药学界非常重视灵芝多糖的研发及应用[6]。

灵芝多糖具有许多特点,如明确的疗效,没有副作用,作为辅助药物在肿瘤的临床治疗[7]。

（2）抗氧化作用

根据目前的研究成果表明，灵芝多糖具有一定的抗氧化功能，安全有效的天然抗氧化剂的发展提供一定的理论依据。

游育红等通过研究得出，灵芝多糖可以保护细胞器免受氧自由基的损伤，可以提高细胞的存活率，证明了灵芝多糖具有保护细胞和抗氧化的功能[8]。

胡太平等最先证明灵芝多糖可以拮抗NHDPH氧化酶酶系列的酶的活性，而此种酶系能够促进血管壁中O2-·

的产生[9]。

（3）降血脂、血糖功效

随着人们的生活质量日渐提高，高血糖、高血脂的发病率在全球范围内都呈现出逐年上升的趋势现象。

解跃华等通过研究证明灵芝多糖能够降低血液中脂质的分子含量[10]。

实验先建立大鼠脂质代谢的紊乱模型和预防模型，并且以血液样品中的TG、HDL-C、TC的分子含量和大鼠体内脂肪的沉积情况为参考目标。

糖尿病在临床方面主要表现为血糖浓度非常高。

黄智璇等通过注射去甲肾上腺素导致小鼠产生高血糖症状，通过灵芝多糖对小鼠喂养实验,实验结果表明,灵芝多糖具有降低血糖的作用[11]。

（4）免疫调节功能

徐晋等将用于结合的灵芝多糖和5-氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡的实验结果可以得出,该种组合可以加速并且提高肝癌细胞凋亡率[12~13]。

因此,生物体的主要免疫调节机制可能是通过激活免疫反应,增强宿主免疫能力，从而实现免疫调节功能。

（5）其它保健功能

吴京燕等研究表明复合灵芝多糖能非常显著的提高辐照的小鼠体液中的白细胞及SOD活性，表明灵芝多糖具有拮抗辐射[14]的功能。

此外还有研究表明，灵芝多糖还能抵抗衰老、抵抗疲劳、改善微循环、有效抑制肿瘤、促进蛋白质和核酸的合成等多种药理功效[15]。

1.2.2灵芝多糖的提取的研究现状

传统的提取方法耗时较长、并且耗用溶剂量大、温度过高，容易使多糖发生分解[16]。

近年来,超声波、微波和酶技术,在生物活性成分的提取的应用逐渐增加,超临界流体萃取、超滤等高新技术的发展也提供了高效、快速和更多的新技术提取灵芝多糖。

酶法提取：

沈爱英等通过提取姬松茸子实体多糖的提取实验，多糖的提取率高达1.5167%，并且所需要的时间的只需要热水提取时间的一半,萃取率显著高于水萃取,也较高于酸、碱提取[17]。

用复杂酶方法可以保持产品的天然形态,不会破坏它的原有的生物活性。

也有一部分专家学者[5]研究了银耳多糖的多种提取工艺，研究实验表明,酶的提取效果最好,碱法提取排到第二，酶法提取非常显著的缩短了提取的时间,使用复合酶水解与热水提取法结合,提取香菇多糖，萃取时间明显减少一半,而且萃取率增加[18~19]。

　近年来，一些人提出的“仿生提取”。

它基本上是建立模型，模拟胃和小肠的身体内部工作环境，提出了人工胃液和人工肠液提取中药（TCM）在低温和酶催化的引入人体，使药物进入人体易于综合利用活动的混合物。

目前，主要实验室研究采用的酶类有纤维素酶和果胶酶，除此之外也有中性蛋白酶等[20~21]。

超声波提取：

可以促使溶剂渗透快速进入细胞,大大缩短提取时间,显著提高提取率[22~23]。

超声提取是由超声波辅助溶剂萃取,其特点是超声波产生高速,强烈的空化效应和混合功能损伤的细胞,能够缩短提取的时间。

超声波提取优点：

1、萃取效率高；

2、提取时间非常短；

3、提取温度非常低；

4、适应性广；

5、提取液中杂质很少，有效成分比较容易分离和提纯；

6、提取的过程中操作成本非常低，综合经济效益显著提高。

超滤法：

超滤是一种膜分离的技术，在多糖的提取过程中，使用超滤膜可以孤立于水或其他液体分子量不同的胶体和高分子材料。

动植物多糖的超滤技术可以将多糖进行有效的分级，具有非常高的收率、重复性也比较好好、能源消耗低、设备比较简单、没有污染、并且不会破坏多糖的生物活性等优点。

和超滤膜的情况下连续使用了很长一段时间也可以维持一个恒定的输出和分离效果[24~25]。

1.2.3灵芝多糖的开发和利用现状

自1960年代以来,研究表明,某些真菌多糖的药用价值显著,没有细胞毒性,应用前景非常广阔。

测定多糖的多糖在药物质量控制有着非常重要的作用,但多糖的研究开始得较晚，所以其测定方法以及提取过程中存在的影响因素目前还存在着很大的不足。

近年来郭利平[26]，陈超琴[27]，范晓良[28]等，这些学者在多糖的研究方面都做出了很大的贡献，但是他们的研究主要关注多糖的提取工艺,故本实验从老师所给的几点影响因素入手，参考近五年的有关多糖提取方面的文献，结合不同学者多年来从不同方面对多糖测定方法的研究,预处理在几个对酶法提取灵芝多糖的影响,并提出自己的看法不同的问题，以期为工业上预处理对酶法提取灵芝多糖的影响因素的选择提供依据。

1.3本论文研究的主要内容

这部分研究灵芝子实体为原料，通过不同因素的预处理，然后利用酶法提取灵芝子实体的灵芝多糖，最后利用紫外分光光度法测定灵芝多糖的含量。

本次的实验目的主要是为了考查不同的单因素的物料预处理对酶法提取灵芝多糖的影响，然后在单因素实验的基础上，用灵芝中灵芝多糖的提取率为参考目标，对烘烤温度、紫外线的照射时间、物料粒度等因素进行正交设计试验研究。

1.4研究方案和采取的措施

1.4.1灵芝子实体的预处理

灵芝多糖存在于子实体细胞内壁，提取较为困难，因此采用粒度处理、烘烤处理、紫外处理三种预处理方式，由于灵芝原材料不易加工，所以实验前要对原材料进行挑选、清洗、干燥、粉碎等几个预处理工艺。

粉碎是为了增加在萃取过程中反应的接触面积，用以获得到较高的提取率。

1.4.2灵芝多糖的提取

近年来很多学者在灵芝多糖的提取上做了大量的研究，由曹泽虹[16]等做的酶法提取灵芝多糖的工艺研究实验可知：

纤维素酶的酶量为0.5%，纤维素酶的降解温度为55℃，时间80分钟，pH5.0；

果胶酶的酶含量为0.5%，用果胶酶酶解温度为40℃，果胶酶的降解时间为80分钟，pH4.5；

植物蛋白水解酶的酶量为1.0%，植物蛋白酶的降解时间为60分钟，酶降解温度55℃，pH4.5。

三种酶相比,纤维素酶提取灵芝多糖的效果最好,多糖提取容量高达197.49毫克/100mL.果胶酶,酒精、纤维素酶+酒精下沉的方法来比较三种方法提取灵芝多糖含量、纤维素酶水解+酒精下沉方法提取效果是最好的,多糖含量高达211.21毫克/100毫升,故本实验采取纤维素酶法+醇沉法提取，探究物料粒度、烘烤温度以及紫外照射时间与（酶法提取）灵芝多糖提取率之间的相关关系。

1.4.3灵芝多糖的测定

灵芝多糖在浓硫酸的作用下能够水解成单糖,然后单糖之间能够快速脱水形成醛衍生品,最后与酚结合，反应生成有色的化合物。

最后可以用紫外可见分光光度计测定其OD值，并且通过计算可以得到灵芝多糖的获得率。

2材料与方法

2.1实验试剂与材料

试剂与材料可以见表2.1。

表2.1试验所用试剂与材料

药品名称

级别

生产厂家

浓度

无水酒精

AR

东莞市建润化工有限公

100%

C6H12O6

北京化工厂

坏水

淄博建龙化工有限公司

95%

枸橼酸钠

石碳酸

济南世纪通达化工厂

芝草

市售

戴家平老百姓大药房

2.2主要仪器与设备

仪器与设备归纳表2.2。

表2.2试验用主要仪器

名字

规格

产地

紫外-可见光分光光度计

GS-53

上海天呈医流科技股份有限公司

标准筛

JK-WQ61M/SZZ

北京中科路达试验仪器有限公司

电子天平

AR5120

上海台之衡工贸有限公司

生物安全柜

81M/AC2-4S1

广州安邦生物科技有限公司

高速冷冻离心机

EvolutionRC

美国ThermoScientific公司

电热鼓风干燥箱

DHG-91401

北京中西远大科技有限公司

真空干燥箱

DZF-6051

上海垒固仪器有限公司

中药粉碎机

TT30,FW177

2.3研究方法

2.3.1灵芝多糖提取工艺流程

（1）灵芝子实体的预处理

灵芝子实体→挑选、清洗→烘干至恒重→粉碎→过筛→紫外线照射一定时间→预处理的灵芝粉

（2）灵芝多糖的提取工艺流程

准确称取2.0g灵芝粉→单因素处理（烘烤温度，物料粒度，紫外线照射）→加入一定量的pH（pH=5.0）的缓冲液（料液比=1:

15）→加入0.5%的纤维素酶（调pH，酶解8分钟）→离心分离（3000r/min，15min）→取上层离心液→酶解法除蛋白→透析→加热灭酶（10min）→过滤除酶→滤液经旋转蒸发仪进行浓缩→沉淀→离心取沉淀→丙酮洗涤→烘干→粗多糖

2.3.2单因素的预处理对酶法提取灵芝多糖的影响的实验

（1）烘烤温度对（酶法提取）灵芝多糖的提取率之间的关系[29]

精确称取灵芝粉2.0g，将其置于250mL锥形瓶中，然后将盛有物料的锥形瓶放入烘箱设备中烘烤温度（70℃、75℃、80℃、85℃、90℃）一定时间，取出锥形瓶，处理后的灵芝粉降至室温时，将称取好的灵芝粉过80目筛，紫外照射35min，按料液比1:

15加入适量的缓冲液（pH=5.0），0.5%的纤维素酶，纤维素酶降解80分钟，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，考察烘烤温度与灵芝多糖提取率之间的关系。

（2）物料粒度对（酶法提取）灵芝多糖提取率之间的关系[30~31]

精确称量干燥的灵芝粉2.0g，将其置于250mL锥形瓶中，然后将盛有物料的锥形瓶放入烘箱设备中适当的温度烘烤一定时间，取出锥形瓶，处理后的灵芝粉降至室温时，将称取好的灵芝粉分别通过（50目，60目，80目，100目，150目）的目筛，紫外线下照射35min，然后将通过不同大小目筛的灵芝粉分别用标记好的锥形瓶装按料液比1:

15加入适量的缓冲液（pH=5.0），0.5%的纤维素酶，纤维素酶降解80分钟，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，探究物料粒度对灵芝多糖的提取率的影响。

（3）紫外线的照射时间与（酶法提取）灵芝多糖提取率之间的关系

精确称量干燥的灵芝粉2.0g，将其置于250mL锥形瓶中，然后将盛有物料的锥形瓶放入烘箱设备中适当的温度烘烤一定时间，取出锥形瓶，将处理后的盛有灵芝粉的锥形瓶降至室温，然后将处理后的并称取好的灵芝粉过最佳的目筛，将锥形瓶放于紫外线下照射（25min，30min，35min，40min，45min），然后将样品取出，按料液比1:

15加入适量的缓冲液（pH=5.0），0.5%的纤维素酶，纤维素酶降解80分钟，然后按照上述提取工艺流程得到灵芝粗多糖，计算得率，探究紫外照射时间与灵芝多糖的提取率之间的关系。

2.3.3正交试验方案设计

以单因素试验结果为基础，以灵芝多糖提取率为主要考察目标,以烘烤温度、物料粒度、紫外线照射时间作为考察的3个因素，设计正交试验。

2.4检测方法

2.4.1绘制葡萄糖标准曲线的方法

（1）配制葡萄糖的标准溶液

精确数量的葡萄糖25毫克,添加一定量的水溶解,然后到250毫升容量瓶,如果水在容量瓶没有达到容量大小规模滴水,摇匀配成标准储备溶液。

与液体移动移动0.5、1、3、5、7毫升葡萄糖标准储备溶液分别在10毫升容量瓶和扩展能力,配水,葡萄糖含量为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7毫克/毫升的标准使用液。

配制5%的苯酚溶液

精确称量5g苯酚，用容量刻度为100ml的移液管（或滴定管）量取95mL的水加入苯酚中，均匀连续的搅拌，使苯酚完全溶解后，将配置好的溶液转入棕色细口瓶中，放到冰箱备用。

（2）绘制标准曲线

准确测量2.00毫升蒸馏水和2.00毫升葡萄糖标准溶液,然后干把它插到试管中,加入1.00毫升,5%的苯酚溶液,摇匀,然后把它放在冰水,然后立即加入5.00毫升浓H2SO4,完全动摇,将其放置在室温下15分钟后在100℃沸水,让水浴加热15分钟,然后拿出来放在冰水15分钟,为排除干扰，根据需要设置一个空白试验。

最后绘图计算可以得到线性方程。

2.4.2灵芝多糖的含量的测定

（1）换算因数测定

准确称量灵芝多糖50毫克完全溶解于一定量的水,体积100毫升容量瓶定容至100毫升,得到样液。

用移液器移取1.0mL灵芝多糖试液，然后遵循葡萄糖标准曲线的绘制步骤进行显色反应，用紫外分光光度计测其在490nm处的OD值，并且从葡萄糖标准曲线的图中求出供试液的葡萄糖质量M2，换算因素公式f=M1/M2（M1为供试液中多糖的实际质量50mg，M2为测量出的供试液的葡萄糖质量）[25]。

据《中华人民共和国药典》f=2.0428。

（2）灵芝多糖含量的测定

首先提取粗多糖与纯净水反复溶解并定容至100毫升,然后稀释到一定浓度,取稀释后的葡萄糖标准溶液1毫升,用于颜色反应、OD值在490nm。

通过标准曲线回归方程来计算样本液体葡萄糖,葡萄糖（ug）,然后通过公式计算灵芝多糖的含量。

计算见公式2.1。

M——葡萄糖的质量；

f——换算因素（2.0428）；

A——稀释倍数；

100——样液的体积（mL）；

10－6——ug换算成g；

m——灵芝粉的质量（g）。

3结果与分析

3.1葡萄糖标准曲线的绘制

图3.1葡萄糖标准曲线

用苯酚-硫酸法测定葡萄糖标准溶液的吸光度值（OD值），并用其在490nm处测得的吸光度值（OD值）为纵坐标，用葡萄糖的质量数为横坐标，利用EXCEL绘制葡萄糖的标准曲线图（图3.1）。

从图中得出标准曲线的回归方程是Y=0.0077X+0.0005（R2=1）。

分析图可以得出结果，在20～160ug范围内，葡萄糖的质量与灵芝多糖的吸光度值具有一定的相关线性关系。

3.2单因素试验结果

3.2.1烘烤温度与灵芝多糖提取率之间的关系

表3.1烘烤温度与灵芝多糖提取率关系表

烘烤温度（℃）

70

75

80

85

90

A1

0.172

0.198

0.278

0.252

0.241

A2

0.173

0.197

0.275

0.249

0.242

A3

0.108

OD平均值

0.276

0.251

灵芝多糖得率（%）

0.46

0.52

0.73

0.66

0.64

图3.2烘烤温度与灵芝多糖提取率关系图

根据测量的结果可以得到表3.1，以灵芝多糖的提取率为纵坐标，用预处理因素烘烤温度为横坐标画出相应的曲线分析图（图3.2）。

观察分析（图3.2）曲线图得知：

多糖得率随烘烤温度的上升存在一个最大值80℃。

烘烤温度的变化能够改变物料的细胞结构，让物料的内部有效成分的扩散路径发生变化，变得更加畅通，有利于有效成分的提取。

但是不断提高的的烘烤温度没有利于灵芝多糖的溶出，反而具有一定的抑制作用，而且，烘烤温度不断增大则对灵芝多糖的生理活性有非常不利的影响，可能还会溶出其他与试验无关成分，增加后续分离操作的难度，因此，最佳烘烤温度应该选择80℃较好。

3.2.2物料粒度与灵芝多糖提取率之间的关系

表3.2物料粒度与灵芝多糖得率关系表

物料粒度（目）

50

60

100

150

0.263

0.378

0.434

0.384

0.375

0.379

0.435

0.385

0.374