核酸电泳相关试剂缓冲液配制方法Word格式.docx
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溶液见光或高温灭菌后会变黄。
变黄时也可使用,但变黑时不要使用。
溴乙锭(10mg/ml)
组份浓度10mg/ml溴乙锭
配制量100ml
配制方法1.称量1g溴乙锭,加入到100ml容器中。
2.加入去离子水100ml,充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。
3.将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存。
4.溴乙锭的工作浓度为0.5g/ml。
注意:
溴乙锭是一种致癌物质,必须小心操作。
Agarose凝胶
配制方法1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5×
TBE或1×
TAE)。
2.根椐制胶量及凝胶浓度,准确称量琼脂糖粉,加入适当的锥形瓶中。
3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。
注:
用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。
4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜,并在膜上扎些小孔,然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。
加热过程中,当溶液沸腾后,请戴上防热手套。
小心摇动锥形瓶。
使琼脂糖充分均匀熔化。
此操作重复数次,直至琼脂糖完全熔化。
必须注意,在微波炉中加热时间不宜过长,每次当溶液起泡沸腾时停止加热,否则会引起溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会损坏微波炉。
熔化琼脂糖时,必须保证琼脂糖充分完全熔化,否则,会造成电泳图像模糊不清。
5.使溶液冷却至60℃左右,如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5µ
g/ml)。
并充分混匀。
溴乙锭是一种致癌物质。
使用含有溴乙锭的溶液时,请戴好手套。
6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在适当位置处插上梳子。
凝胶厚度一般在3~5min之间。
7.在室温下使胶凝固(大约30min~1h),然后放置于电泳槽中进行电泳。
凝胶不立即使用时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天。
琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围
琼脂糖浓度
最佳线形DNA分辨范围(bp)
0.5%
0.7%
1.0%
1.2%
1.5%
2.0%
1,000~30,000
800~12,000
500~10,000
400~7,000
200~3,000
50~2,000
6×
LoadingBuffer(DNA电泳用)
组份浓度
30mM
EDTA
36%(V/V)
Glycerol
0.05%(W/V)
XyleneCyanolFF
BromophenolBlue
配制量500ml
配制方法1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中。
4.4g
250mg
2.向烧杯中加入约200ml的去离子水后,加热搅拌充分溶解。
3.加入180ml的甘油(Glycerol)后,使用2NNaOH调节pH值至7.0。
4.用去离子水定容至500ml后,室温保存。
10×
LoadlngBuffer(RNA电泳用)
组份浓度
10mM
50%(V/V)
0.25%(W/V)
配制置10ml
配制方法1.称量下列试剂,置于10ml离心管中。
0.5MEDTA(pH8.0)
200µ
l
25mg
2.向离心管中加入约4ml的DEPC处理水后,充分搅拌溶解。
3.加入5ml的甘油(Glycerol)后,充分混匀。
4.用DEPC处理水定容至10ml后,室温保存。
四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法
20×
SSC
组份浓度3.0MNaCl,0.3MNa3citrate·
2H2O(柠檬酸钠)
配制方法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中。
NaCl
175.3g
Na3citrate·
88.2g
3滴加14NHCl,调节pH值至7.0后,加去离子水将溶液定容至1L。
4.高温高压灭菌后,室温保存。
SSPEBuffer
组份浓度3.0MNaCl,0.2MNaH2PO4,0.02MEDTA
配制量1.L
NaH2PO4·
H2O
27.6g
7.4g
3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5ml的10NNaOH)。
4.加去离子水将溶液定容至lL。
5.高温高压灭菌后,室温保存。
50XDenhardt’S溶液
1%(W/V)
Ficoll400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)
Polyvinylpyrrolidone
(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)
BSA
配制量500ml
配制方法1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中。
Flcoll400
5g
PoLyvlnylpyrrolldone
2.加去离子水约400ml,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至500ml。
4.用0.45µ
m滤膜过滤后,分装成每份25ml。
5.-20℃保存。
0.5M磷酸盐Buffer
组份浓度0.5MNa2HPO4。
配制量lL
配制方法1.称量134gNa2HPO4·
7H2O置于lL烧杯中。
2.加入约800ml的去离子水充分搅拌溶解。
3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。
4.加去离子水定容至1L。
SalmonDNA(鲑鱼精DNA)
组份浓度10mg/mlSalmonDNA
配制量约100ml
配制方法1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中,加入约200ml的TEBuffer。
2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,溶解后加入4ml的5MNaCl,使其终浓度为0.1M。
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。
4.回收水相溶液后,使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以切断DNA。
5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。
6.离心回收DNA后,溶解于100ml的去离子水中。
测定溶液的OD260值。
7.计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10mg/ml。
8.煮沸10min后,分装成小份(1ml/份)。
-20℃保存。
9.使用前在沸水浴中加热5min后,迅速冰浴冷却。
DNA变性缓冲液
组份浓度1.5MNaCl,0.5MNaOH
配制方法1.称量下列试剂,置于lL烧杯中。
87.7g
NaOH
20g
预杂交液/杂交液(DNA杂交用)
6×
SSC(或SSPE)
5×
Denhardt’s
0.5%(W/V)
SDS
100µ
g/ml
SalmonDNA
配制置100ml
配制方法1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中。
30ml
10ml
10%SDS
5ml
10mg/mlSalmonDNA
1ml
dH2O
54ml
2.充分混匀后,使用0.45µ
m滤膜滤去杂质后使用。
预杂交液/杂交液(RNA杂交用)
Denhardt‘s
100g/ml
Formamlde
配制量100mL
配制方法1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中。
Formamide(甲酰胺)
50ml
4ml
2.充分混匀后,使用0.45µ
膜转移缓冲液(Western杂交用)
组份浓度39mMGlycine,48mMTris,0.037%(W/V)SDS,20%(V/V)甲醇
Glycine
2.9g
5.8g
0.37g
2.向烧杯中加入约600ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定溶至800ml后,加入200ml的甲醇。
4.室温保存。
TBSTBuffer(Western杂交膜清洗液)
组份浓度20mMTris-HCl,150mMNaCl,0.05%(V/V)Tween20
8.8g
1MTris-HCl(pH8.0)
3.加入0.5mlTween20后充分混匀。
4.加去离子水将溶液定容至lL后,4℃保存。
封闭缓冲液(Western杂交用)
组份浓度5%(W/V)脱脂奶粉/TBSTBuffer
配制方法1.称5g脱脂奶粉加入到100mlTBSTBuffer中,充分搅拌溶解。
2.4℃保存待用(本封闭液应该现配现用)。
五、实验室常用培养基的配制方法
Ampicillin(氨卡青霉素)(100mg/ml)
组份浓度100mg/mlAmpicillin
配制量50ml
配制方法1.称量5gAmpicillin置于50ml离心管中。
2.加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml。
3.用0.22µ
m过滤膜过滤除菌。
4.小份分装(1ml/份)后,-20℃保存。
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24mg/ml)
组份浓度24mg/mLIPTG
配制量50mL
配制方法1.称1.2gIPTG置于50ml离心管中。
3.用022µ
4小份分装(1ml,份)后,-20℃保存。
X-Gal(20mg/ml)
组份浓度20mg/mlX-Gal
配制方法1.称量lgX-Gal置于50ml离心管中。
2.加入40mlDMF(二甲基甲酰胺),充分混合溶解后,定容至50ml。
3.小份分装(1ml/份)后,-20℃避光保存。
LB培养基
组份浓度1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨),0.5%(W/V)YeastExtract(酵母提取物),1%(W/V)NaCl
配制方法1.称取下列试剂,置于lL烧杯中。
Tryptone
10g
YeastExtract
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
3.滴加5NNaOH(约0.2m1),调节pH值至7.0。
4.加去离子水将培养基定容至1L。
5高温高压灭菌后,4。
C保存。
LB/Amp培养基
0.1mg/ml
Ampicillin
3.滴加5NNaOH(约0.2mL)。
调节pH值至7.0。
5.高温高压灭菌后,冷却至室温。
6.加入1mlAmpicillin(100mg/ml)后均匀混合。
7.4℃保存。
1.2%(W/V)
2.4%(W/V)
0.4%(V/V)
17mM
KH2PO4
72mM
K2HPOa
TB培养基
配制方法1.配制磷酸盐缓;
中液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml。
溶解2.31gKH2PO4和l2.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌。
2.称取下列试剂,置于lL烧杯中。
12g
24g
4m
3.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
4.加去离子水将培养基定容至1L后,高温高压灭菌。
5.待溶液冷却至60℃以下时,;
加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。
6.4℃保存。
TB/Amp培养基
17mM
72mM
K2HPO4
配制方法1.配制磷酸盐缓冲液(0.17MKH2PO4,0.72MK2HPO4)100ml。
溶解2.31gKH2PO4,和12.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌。
4.加去离子水将培养基定容至lL后,高温高压灭菌。
5.待溶液冷却至60℃以下时,加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。
6.均匀混合后4℃保存。
SOB培养基
2%(W/V)
2.5mM
KCl
MgCl2
配制方法1.配制250mMKCl溶液。
在90ml的去离子水中溶解l.86gKCl后,定容至100ml。
2.配制2MMgCl2溶液。
在90ml去离子水中溶解19gMgCl2后,定容至100ml,高温高压灭菌。
3.称取下列试剂,置于lL烧杯中。
0.5g
4.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解。
5.量取10m1250mMKCl溶液,加入到烧杯中。
6.滴加5NNaOH溶液(约0.2m1),调节pH值至7.0。
7.加入去离子水将培养基定容至lL。
8.高温高压灭菌后,4℃保存。
9.使用前加入5ml灭菌的2MMgCl2溶液。
SOC培养基
2.5mM
20mM
Glucose
配制方法1.配制lMGlucose溶液。
将18gGlucose溶于90ml去离子水中,充分溶解后定容至100ml。
用0.22µ
m滤膜过滤除菌。
2.向l00mlSOB培养基中加入除菌的1MGlucose溶液2ml,均匀混合。
3.4℃保存。
2×
YT培养基
组份浓度1.6%(WV)Tryptone,1%(W/V)YeastExtract,0.5%(W/V)NaCl
16g
3.滴加5NNaOH,调节pH值至7.0。
5.高温高压灭菌后,4℃保存。
Фb×
broth
组份浓度2%(W/V)Tryptone,0.5%(W/V)YeastExtract,o5%(W/V)MgSO4·
7H2O
MgSO4·
7H2O
3.滴加1NKOH。
调节pH值至7.5。
NZCYM培养基
0.5%(WV)
0.1%(WV)
CasaminoAcid(酪蛋白氨基酸)
1%(WV)
NZ胺
0.2%(WV)
7HO
配制方法1.称取下列试剂。
置于lL烧杯中。
CasaminoAcid
1g
2g
NZYM培养基
配制方法NZYM培养基除不含CasaminoAcid外,其他成份与NZCYM培养基相同。
NZM培养基
配制方法NZM培养基除不含YeastExtract(酵母提取物)外,其他成份与NZYM培养基相同。
一般固体培养基的配制
配制方法1.按照液体培养基配方准备好液体培养基,在高温高压灭菌前,加入下列试剂中的一种。
Agar(琼脂;
铺制平板用)
15g/L
配制顶层琼脂用)
7g/L
Agarose(琼脂糖;
2.高温高压灭菌后,戴上手套取出培养基,摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀(此时培养基温度很高,小心烫伤)。
3.待培养基冷却至50~60℃时,加入热不稳定物质(如抗生素等),摇动容器充分混匀。
4.铺制平板(30~35ml培养基/90mm培养皿)。
LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基
0.024mg/ml
IPTG
0.04mg/ml
X-GaL
1.5%(W/V)
Agar
3.滴加5NNaOH(约0.2mL),调节pH值至7.0。
4.加去离子水将培养基定容至1L后,加入15gAgar。
5.高温高压灭菌后,冷却至60℃左右。
6.加入1mlAmpicillin(100mg/ml)、1mlIPTG(24mg/ml)、2mlX-Gal(20mg/mL)后均匀混合。
7.铺制平板(30~35ml培养基/90mm培养皿)。
8.4℃避光保存。
TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基
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