分子生物学考试附答案版Word文件下载.docx
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要点:
原则:
正向引物照抄反向则反向互补数量15~25不等,但保证tm值均在55度左右
近似公式:
tm=4*(G+C)+2*(A+T)
我在primerpremier中设计的引物如下供参考
f:
GCGCCAGTCCTCCGAtm:
55.3
r:
CTAACTAGTACCGACGCAGGtm:
55
另外还需考虑因素:
引物与基因组其他基因是否有同源性?
引物自身及互相会不会有错配会不会形成二级结构会不会形成错配
是否需要在5’端设计酶切位点及保护碱基
⑵.请给出三个提高PCR特异性的方法。
1热启动
2Touchdown
3巢式PCR(nest)
4适当提高退火温度控制延伸时间控制循环数控制酶、引物、Mg2+等相对用量
二.要用RT-PCR扩增一段mRNA,请设计一种用于RT-PCR的引物来避免基因组DNA的污染,并简要说明原理。
该段序列的基因组DNA序列的结构如下:
内含子
外显子
要点:
上下游引物跨越内含子其他同一般引物设计原则
因为基因组DNA由于含有内含子扩增出来的片段会大于直接用cDNA扩增出的片段,抑或是由于片段太大,延伸时间不够无法扩增出来。
附:
其他减少DNA污染的方法
1.使用无污染技术减少污染如用Trizol提取RNA扩增级DNaseⅠ处理RNA
2.使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染
三.下图给出了一段DNA序列和其酶切位点:
BamHISalIMspI
5’-ATCGGGATCCACTTGTCGACACCAAGCCCGG-3’
3’-TAGCCCTAGGTGAACAGCTGTGGTTCGGGCC-5’
请设计两种实验方法用放射性核素标记该段序列的上游末端。
(1、简要说明原理。
2、说明所用的酶。
3、说明所用的放射性标记的位置。
EnzymeFreqPosition(s)
BamHI1:
5
v:
GGATCC:
CCTAGG:
^:
MspI1:
28
CCGG:
GGCC:
SalI1:
15
GTCGAC:
CAGCTG:
1碱性磷酸酶处理T4多聚核苷酸激酶+γ-32p-ATP标记5’末端
2.酶切Klenow+dNTP(-α~32P-dNTP)标记3’末端
四.请简要说明定位克隆和同一酶切克隆有什么不同?
方向性问题双酶切位点设计自身环化问题
五.现有一个pCAT质粒和一段带有p21Promotor的DNA序列。
请设计一个试验来证明P53蛋白是否能够通过与P21的启动子作用来调节P21的表达。
简要地写出操作步骤和原理。
将p21Promotor克隆至pCAT中将此p21的reporter同克隆有p53的质粒共同转染细胞,通过测量CAT的表达水平,探究P53蛋白是否能够通过与P21的启动子作用来调节P21的表达
将reporter与不含p53的空载体质粒转染细胞作为对照。
注意:
转染适应选用合适的内参(如renilla)。
细胞系可以选择p53野生型或突变型。
可考虑做剂量依赖实验。
六.写出用COBRA和MSP来检测甲基化状态的原理。
COBRA主要用于检测目的DNA序列中含有的特殊酶切位点的甲基化状态。
其基本原理是亚硫酸氢钠处理后,某些碱基序列的改变可以产生新的限制性内切酶图谱,即新的限制性内切酶作用位点出现或者消失(由C-T转换所致)。
这种新的图谱可以通过PCR扩增,然后用特定限制性内切酶的消化处理而显示出来。
与对照组相比较,发生变化的条带即可能为甲基化发生的区域。
这种方法的工作量和耗费相对较小,但只能获得特殊酶切位点的甲基化状态的信息,因而检测的阴性结果不能完全排除样本DNA中发生甲基化的可能性。
MSP:
七.北京大学蛋白质研究中心发现了一种新基因,设计实验研究该基因的功能。
1.生物信息学分析如对同源基因比对,结构,功能越分析预测新基因功能
2.检测基因的表达谱(如不同时空表达情况,microarray,ChIP-on-chip)
3.检测基因的定位情况
4.GainofFunction在细胞/组织/个体水平引入表达/过表达未知基因,检测其生物学效应如转基因,knock-in,转染细胞。
但由于未知基因在细胞中表达依然足够,过表达可能不能观测出显著效应,可能出现假阴性及假阳性结果,
5.LossofFunction如RNAiKnock-out抑制活性
6.上游事件
7.下游作用如对信号通路基因转录等的作用必要时研究下作用机制
八.有学者发现了Onc-1和Onc-2两种蛋白,经过酵母双杂交试验发现两种蛋白质能够相互作用。
Onc-1能够调节基因FAF的表达,促进细胞增值。
故而该学者推断Onc-1能够促进细胞增值,通过与Onc-2的作用调节FAF的表达。
请设计实验证实该假设。
A
通过1.confocal检测两蛋白是否存在时空共定位此法直观但假阴假阳性大
2.CoIP检测在过表达/未过表达情况下两蛋白是否能相互作用。
此法可反映生理状况下蛋白是否能相互作用,但此相互作用可以是直接也可以是间接作用
3.GSTpull-down实验,可以在体外反映蛋白是否可以直接相互作用
4.亲和纯化法体外验证两蛋白可否直接或间接相互作用
以此验证Onc-1与Onc-2可以相互作用
B
1.通过ChIP检测Onc-1与Onc-2是否可以与FAFpromoter结合
2.分别单独过表达Onc-1与Onc-2以及同时过表达Onc-1与Onc-2,反转录mRNAreal-time检测FAFmRNA水平以及用Westernbloting检测FAF表达水平
3.分别silenceOnc-1与Onc-2以及同时silenceOnc-1与Onc-2反转录mRNAreal-time检测FAFmRNA水平以及用Westernbloting检测FAF表达水平
4.Luciferase法检测Onc-1与Onc-2对FAFpromoter的作用
以此验证Onc-1与Onc-2共同调节FAF表达
C
1.检测在不同的细胞周期Onc-1与Onc-2的表达水平以及FAF的水平判断是否呈现细胞周期依赖性
2.分别单独过表达Onc-1与Onc-2以及同时过表达Onc-1与Onc-2。
用流式细胞术检测而蛋白对细胞周期的影响
3.分别silenceOnc-1与Onc-2以及同时silenceOnc-1与Onc-2用流式细胞术检测而蛋白对细胞周期的影响
当然也可以用BrdU掺入法以及其他增殖标志物检测来评估二蛋白对细胞增殖的影响
九.请简要综述基因在肝脏和大脑中组织差异性表达的关键原因。
涉及表观遗传学的概念,即在基因水平不变的情况下出现可遗传的表型变异。
机制主要有:
1.DNA修饰(主要是CpG岛的甲基化)
2.组蛋白共价修饰(如甲基化乙酰化磷酸化泛素化SUMO化糖基化核糖基化)
3.染色质重塑(如依赖ATP的染色体修饰及依赖共价结合反应的化学修饰)基因组印记
4.Non-codingRNA
毛:
考试题
1.如何设计引物?
2.如?
何提高PCR特异性
3.RT-PCR原理?
4.5'
3'
RACE原理?
5.PCR在基因表达调控中的作用
朱:
1克隆
2基因表达
3DNA甲基化
尚:
1新基因功能分析
2基因芯片
3基因表达的组织特异性原理
毛1PCR引物设计
!
下游引物需颠倒碱基。
颠倒顺序。
上游引物5‘gccagtcctccgattgactgagtc3‘
下游引物5‘aactagtaccgacgcaggcgcataaaatc3‘
毛2提高PCR特异性
•
•1.热启动(hot-start)
•比如
(1)将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开
•
(2)利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。
•2.Touchdown
•先在高于退火温度下进行几轮PCR循环,然后再在退火温度下进行大量扩增。
•3.NestedPCR
•先在要扩增片断的外侧设计一对引物,进行PCR,然后以此PCR产物为模板,再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断
•4.SuppressionPCR
•原理
RT—PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法,主要用于对表达信息进行检测或定量分析,还可以用来检测基因表达差异而不必构建cDNA文库克隆cDNA。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。
逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。
毛45'
RACE原理
RNA反转录5’末端交换机制(SwitchingMechanismAt5'
endoftheRNATranscript,SMART)技术的出现是一个新的里程碑。
其原理如下:
在合成cDNA的反应中,事先加入的5'
末端带Oligo(dT)的SMART引物(如5'
–(T)25N-1N–3'
,N=A,C,G或T;
N-1=A,G或C),由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA,在到达mRNA的5'
末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”,即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个(dC),SMART引物的Oligo dG(5'
–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG–3'
)与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板,逆转录酶会自动转换模板,以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端,这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列,另一端有已知的SMART引物序列(5'
–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACG–3'
),合成第二链后可以利用通用引物(UPM(UniversalPrimerMix,Long:
0.2mM, 5'
–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'
,Short:
1mM,5'
–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'
)与NUP(NestedUniversalPrimer,10mM, 5'
–AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT–3'
)进行扩增。
由于有5'
帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA,因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。
这个方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性,一步即可完成,不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀,或者额外的酶反应,只需要少至25ng的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA,更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度,可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、利用部分已知序列克隆全长cDNA,和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等
另:
5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下,反转录合成标准第一链cDNA。
利用该反转录酶具有的末端转移酶活性,在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基,退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure2)。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为上游引物,用一个基因特异引物2(GSP2genespecificprimer,GSP)作为下游引物,以SMART第一链cDNA为模板,进行PCR循环,把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。
最终,从2个有相互重叠序列的3'
/5‘-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列,合成相应引物扩增出全长cDNA。
3‘-RACE的原理是:
利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以连有SMART寡核营酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作为上游引物,用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作为下游引物,以cDNA第一链为模板,进行PCR循环,把目的基因3‘末端的。
DNA片段扩增出来
朱1DNA克隆:
应用酶学的方法,在体外将各种来源的目的DNA与载体DNA结合成具有自我复制能力的
DNA分子,继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子。
又称基因克隆或重组DNA。
1目的基因的选择与处理(CDNA文库或基因组文库)限制性内切酶
2载体的选择与处理限制性内切酶
3质粒的构建DNA连接酶
4转染细菌让质粒扩增
5筛选出插入成功的克隆(蓝白斑筛选)
6再将筛选出的细菌大量扩增
7提取DNA
朱3DNA甲基化
尽管DNA甲基化对细胞的生物活性有重要的影响,但是对它的检测要比检测DNA的碱基序列相对困难。
这主要是由于甲基化的胞嘧啶并不影响C:
G核苷酸的配对,而且在PCR过程中,胞嘧啶上的甲基通常会被丢失。
常用的方法是将目的序列中甲基化状态的胞嘧啶转化为DNA序列碱基组成的变化,其基本做法包括两种,一种是依赖亚硫酸氢钠(SodiumBisulfite)对甲基化和非甲基化的胞嘧啶的化学活性不同把两者区分开来(原理见下面所述)。
另一种则依赖于5’-甲基化的胞嘧啶和非甲基化的胞嘧啶对特定的酶切处理的不同反应而实现的。
1SodiumBisulfite处理
2MS-PCR(methylationspecificPCR)
设计甲基化和非甲基化状态的两种引物
3处理加酶切甲基化的可以切。
非甲基化的相当于突变所以切不动
尚1新基因功能分析包括几方面:
A序列和结构分析:
是否保守(不同物种间比较)是否与其他基因同源(不同基因比较)是否有同源的DOMAIN或MOTIF
B表达谱(用基因芯片探测其在什么组织表达。
与什么蛋白质同表达。
然后辅以生物信息学手段归纳出其大致的信号传导路径和与什么样的生物功能相关)
C亚细胞定位(某基因表达产物在细胞分裂的时相位于哪里,这些信息有助于分析其功能)
DGainoffunction(overexpression)
使某基因表达增加的方式有两种1从无到有INTRODUCTIONOFEXPRESSION
2从少到多OVER-EXPRESSION
或者在动物水平上敲除或转入某基因。
以观察其对整体生命活动的影响
Elossoffunction(knock-downknock-out)
抑制性药物作用的两种方式:
1INHIBITIONOFACTING
2INHIBITIONOFEXPRESSION
1实体动物水平的KNOCKOUT
2ANTI-SENSE
3RNAi
FUpstreamcues(上游调控)
Gdownstreameffects(下游效应)
尚2基因芯片
1)当克隆出一未知功能的基因作为研究对象时
2)看某一未知基因与哪些已知基因的表达相关联。
例如:
当细胞受刺激时未知基因的表达会增高。
通过芯片技术分析,有另外12个已知基因表达同时增高,伴随21个基因表达下降。
通过分析这些已知基因的功能相关性,总结出可能有关的信号转导通路。
我们的未知基因有可能就与该通路有关。
3)进而,可以设计实验验证我们的假设
尚3
A排除genome的影响:
不同个体间同一个体间不同组织的DNA序列都相同。
故表达特异性与DNA序列无关
B染色质松紧状态不同,是否有转录因子结合的机会
影响因素:
1)DNA修饰(甲基化)
2)HISTONE修饰(甲基化。
乙酰化。
磷酸化组成了HISTONECODE)
3)引发不同修饰所需的酶不同
三因素整合后。
引起不同染色质重塑效应。
C结合TF转录因子不同(另有COACTIVATOR和MEDIATOR的影响)
同一基因在不同时期不同组织所结合的很多的TF形成了相对特异的复合物,进而解释了转录产物不同的原因
此外,TF的结合是整合了细胞内外环境变化后做出的反应。
不同细胞所处的为环境不同。
激发的信号转导通路不同。
产生的生物学效应也不同
08-09年第一学期分生工作基础重点
1、PCR引物的设计(给序列设计,主要是方向问题)
5’端开始写就OK
2、怎样提高PCR特异性
热启动(hot-start):
比如
(1)将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开
(2)利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。
Touchdown:
先在高于退火温度下进行几轮PCR循环,然后再在退火温度下进行大量扩增。
NestedPCR:
先在要扩增片断的外侧设计一对引物,进行PCR,然后以此PCR产物为模板,再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的片断。
3、末端标记方法(给试剂,怎么标记)
DNA聚合酶I(Klenow片段):
随机寡核苷酸引物介导的DNA标记
T4DNA聚合酶:
(1)放射性标记DNA片段的3‘末端
(2)选择性及无选择标记线性化双链DNA分子的3‘末端,
即所谓的“置换合成”
T7DNA聚合酶:
用于标记5‘末端突出的DNA的3’末端。
由于它会在3‘端留下一个额外的碱基,因此不能应用于将粘性DNA末端转变成平端
反转录酶:
对具有5‘突出端DNA片段的3’端进行填补和标记。
碱性磷酸酶:
去除DNA和RNA的5‘端磷酸基,而后在T4多聚核苷酸激酶催化下,用[-32P]ATP在5‘端进行标记,以便进行序列分析。
T4多聚核苷激酶:
单双链核酸分子5‘末端的同位素标记
T4RNA连接酶:
RNA3’末端的放射性标记
脱氧核糖核酸酶I(DNaseI):
切口平移标记探针
1、单末端标记
用NheI切割
Klenow酶,dNTP(-α~32P-dNTP)
2、双末端标记
3、利用T4核苷酸激酶进行末端标记
碱性磷酸酶
T4核苷酸激酶,γ-32p-ATP
应用:
DNaseIFootprint实验和Gelshift实验
4、RT-PCR,如何避免基因组DNA污染
RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。
使用较好的RNA分离方法,如TrizolReagent,会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。
为了避免产生于基因组DNA的产物,可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。
将样品在2.0mMEDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。
EDTA可以螯合镁离子,防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。
为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开,可以设计分别同分开的外显子退火的引物。
来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。
另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验,以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。
在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。
5、粘性末端DNA片段的克隆(相同酶切,stickyends)
目的基因和载体DNA分子用同一种酶切除得到相同的粘性末端。
开环线状质粒与DNA之间产生非共价的杂交分子,在复性时,载体和目的DNA片段上的5’-磷酸基和3’-羟基紧密接触,DNA连接酶就催化两分子间形成磷酸二酯键。
开环线状质粒与DNA之间产生非共价的杂交分子时,需要高浓度的DNA。
0.25-0.5µ
gvector+0.5-1.0µ
gDNA。
如质粒浓度明显高于DNA时,会产生空质粒,但质粒DNA被一种酶切产生的粘端易自身环化,需要选用磷酸酶去磷酸化。
除出5‘端磷酸基团从而使其不能自身环化。
而未经处理的目的基因DNA的3-OH和5-Ppi在连接酶作用下可发生共价连接。
这样,一条链的连接为正常连接,另一条链由于失去磷酸基团而不能连接,留下3-OH和5-PPI的缺口,但在宿主细胞中被修复带有5‘磷酸基的外源DNA片段
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