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加减三黄汤小鼠生化指标有显著的影响,能够促进机体免疫器官的发育,提高机体免疫力;
能显著降低血清中ALT、AST、GLU的含量,具有保肝利胆作用;
IgG、IgA和IgM的提高、恢复,不同程度的增加了免疫力。
可以显著提高血清及转化生长因子-α、IL-1β因子的含量影响肝脾的恢复。
结论:
加减三黄汤对人源多重耐药性大肠杆菌能起到一定的耐药逆转作用,对动物机体具有一定的免疫保护作用。
关键词:
人源耐药性大肠杆菌转化生长因子-αIL-1β
TheEffectsofTransformingGrowthFactor-αandIL-1βonResistanceE.colifromMicebyModifiedThreeYellowSoups
ZhangXuguang
(animalandplantquarantine,CollegeofAnimalScienceandTechnology)
instructor:
YinXiuling
Abstract:
Objective:
PleaseagentMTYSSoups(ModifiedThreeYellowMultidrug)ontheinfluenceofResistanceofe.Coliinfectedmiceimmuneindexeffects.Methods:
the2g/mlinoculumofmultipledrugresistanceto2952E.coliwasdeterminedandinoculatedby0.5ml(2.4×
109CFU)Invivotest.The3030-day-oldsmicefowlwererandomlyarrangedinto3groups,thepositivecontrolandexperimentgroupwereinoculatedwiththe0.5mlextractiveofMTYSeachdayforsevendays.Aftertheeightdays,somemicefowlwererandomlytakenfromeachgroupfordetectingbloodserumbiochemicalindicator,immuneorganindexandthecontentofSerumandorganizationofcytokinesIL-1β,transforminggrowthfactor-α(TGF-α).Results:
MTYShadveryobviouslyeffectonbiochemicalindicatoronmicefowlwhichwereartificalinfectedresistantE.coli.Itcouldpromotegrowthoftheimmuneorgans(thymusandbursaofFabricius)andimmunityinsilkyfowl;
reduceobviouslythecontentsofALT、ASTandGLUinblood-serum;
protectliverandcholereticeffect;
IgG,IgAandIgMimprovement,rehabilitation,varyingdegreesofincreaseinimmunity.cytokinesIL-1βandtransforminggrowthfactor-α;
contentwereincreasesignificantlyofserumandtissuefactor,theneffecttherecoveryoftheliverandspleen.Conclusions:
MTYShadobviouslyinhibitoryeffecttoresistantmultidrugandimmunoprotectiononcreature.
Keywords:
theresistantE.coliisolatedfromhumanIL-1βTGF-α
引言
大肠杆菌是畜禽和人类的重要致病菌,对畜牧业生产和人类健康都有着严重的影响。
在临床防治过程中,随着抗生素等抗菌药物的大量使用,大肠杆菌耐药菌株也在不断出新,耐药谱也在不断扩大,有的菌株甚至对临床上刚研制的新型抗生素也表现出极强的耐药[1],在养殖业和食品卫生中形成了严重的恶性循环。
随着大肠杆菌耐药株的不断增多,大肠杆菌感染及其食品污染有不断上升的趋势,尤其是人类食物中毒和胃肠炎的不断暴发已成为全球关注的焦点,因此,控制耐药菌的传播和防治细菌感染己成为一个世界性难题。
虽然人们不断开发出新的抗菌谱更广的药物,如头孢类、新喹诺酮类药物,在临床上也有非常理想的报道,但在若干年后仍然可能变得毫无用处。
据报道[2-3],经常食用含药物残留的动物性食品,动物体内的耐药菌株可通过动物性食品来传播给人类,给人类治疗疾病带来困难,特别是耐药性大肠杆菌的感染往往可以延误疾病的正常治疗。
目前对多重耐药性大肠杆菌抑制剂的研究已有很多报道,但对抗耐药性大肠杆菌中药抑制剂的研究报道较少。
我国有着得天独厚的中药资源,中药在治疗感染方面显示了独特的作用,同时中药具有资源丰富、作用靶位多、毒副作用较小、价格便宜及体内使用安全等优点。
中草药的活性成分可抑制耐药性大肠杆菌主动外输系统,使耐药性大肠杆菌消除其耐药性[4-5]。
本实验先通过在体外对人源大肠杆菌进行临床分离细菌鉴定、分离培养、血清型鉴定和耐药性检测,然后再将分离鉴定的菌株回归到动物体内,对鼠的免疫力和某些免疫因子进行检测,获取有效组方应用于临床,可为该病今后防治提供一定依据。
1材料与方法
1.1材料
试验药品
黄连、厚朴、苦参、大青叶、穿心莲、黄芩、黄柏、木香、甘草、黄芪、茯苓、均购自张家口医药公司。
营养肉汤北京海淀区微生物培养基制品厂生产
麦糠凯琼脂北京陆桥技术有限责任公司生产
试验菌株
经临床分离[5-6]生化鉴定的人源大肠杆菌进行血清型鉴定,获得致病性高度耐药的人源2952(O142+O26+O13)大肠杆菌[7]。
(北京天坛生物制品检定所鉴定,本室保存)。
仪器设备
旋转蒸发器、LDZX-40B1型不锈钢立式自动电热蒸汽压力灭菌器、SZX-01型超静工作台、SKP-01型电热恒温培养箱、电子天平、微量加样器、旋爱林牌WZRX1微量吸液器(苏州市东吴医用电子仪器厂)、Cap-Ria16GAMMACOUNTER(美国产)、FT-614混匀器(核工业部北京和仪器厂)、HH-W21-420BS电热很温水浴箱(上海跃进医用光学器械厂)、541-10000-00-0HEIDOLPH振荡器REAXtopGlasblasreei-Krankenhausbedarflaboreinrichtungen.HassaLaborbedarf
试验动物
30只30日龄小鼠购自河北北方学院附属实验牧场
试剂
碘﹝125I﹞白细胞介素1β放射免疫分析药盒,北京普尔伟业生物科技有限公司;
碘﹝125I﹞转化生长因子-α放射免疫分析药盒,北京普尔伟业生物科技有限公司。
1.2方法
试验菌液的制备
将分离并筛选2952(O142+O26+O13)菌株[8]进行复苏培养18h~24h。
在无菌操条件下,吸取20ul菌液,接种于含2.0ml营养肉汤培养基试管中,按10-1、10-2、10-3、……,十进位稀释,置37℃培养。
每种菌株做两个重复。
采用显微镜直接计数法进行活菌计数,配成约含菌量为109CFU/ml的菌悬液。
1.2.2抑制剂配方的制定及提取物的制备
根据传统中药理论和配伍原则及三黄汤配方进行加减,制成如下配方:
中药制剂(MTYS)黄芩12g、黄连12g、黄柏12g、穿心莲9g、苦参9g、金银花15g、大青叶15g、木香6g、甘草9g、厚朴9g、黄芪9g、茯苓9g。
1.2.3最小抑菌浓度(MIC)的测定
采用试管两倍稀释法,对所制备的中药MTYS提取物需先测定其对2952(O142+O26+O13)菌株的MIC值,细菌接种量约为109CFU/ML,同时做阴性、阳性对照,每一浓度药液做两个平行,以平均值为最终结果。
同时将各培养细菌划线接种于相同中药浓度营养琼脂培养基上,再次观察各菌株的药敏试验结果并记录。
判定标准为:
无大肠杆菌生长的最小药液浓度为该药物对该菌株的最小抑菌浓度(MIC)。
1.2.4药物敏感性的测定
采用打孔法测定中药MTYS对上述菌株的抑菌圈直径,受试菌株为2952(O142+O26+O13)菌株,在4mm厚的营养琼脂平板上打6mm的孔,每孔间距为30mm,将调制好的菌液(相当于109CFU/mL),用灭菌玻璃棒均匀涂抹在琼脂板上;
然后每孔加MTYS中药药液100μL(2g/ml),37℃培养20~24h,观察结果。
抑菌圈直径≥20mm高敏、抑菌圈直径10~19mm为中敏,抑菌圈直径<10mm为不敏感。
中药抑制剂与耐药性大肠杆菌使用量的确立
.1大肠杆菌生长强度的测定
采用平皿稀释法测定2952(O142+O26+O13)菌株在MTYS中药营养琼脂上的生长强度。
在无菌条件下,中药提取物和营养琼脂按1∶9的比例制作平板,冷却凝固15min,分别在平板上接种上述菌种菌液(相当于109CFU/ml),每个菌种3个重复,同时与无药琼脂作对照,37℃培养16~18h。
观察细菌生长情况,结果判定:
以对照琼脂的生长为4个“+”,生长强度越低“+”越少,无菌生长为“-”。
.2中药抑制剂在机体中使用剂量的确立
取30只体重均匀的30日龄小白鼠,随机分为6组,每组5只,各组小白鼠分别灌服不同计量的MTYS中药提取物,1次/d,用药期7d,停药2d,第40天称其体重,求其平均值。
每天观察每组鼠的采食、饮水、行为及死亡情况,并对精神沉郁鼠和死亡鼠进行剖检和细菌培养,以确定MTYS的用药量。
.3耐药大肠杆菌最佳攻毒量的确定
取20只体重均匀的7日龄小白鼠,随机分成4组,每组5只,按组分别腹腔注射不同剂量2952(O142+O26+O13)菌株菌液,每天观察每组小鼠的采食、饮水、行为及死亡情况,观察10d,死亡鼠作病理剖检和菌检,确定死亡原因,最后计算死亡率。
分组与模型制作
取初生小鼠30只,常规饲养30d后,随机分为3组:
健康组、阳性对照组、MTYS组、每只称重编号,分组饲养。
供给全价配合饲料,自由采食和饮水,每天观察小鼠的临床表现。
在攻毒前每组随机抽取2只,做剖检观察和细菌培养。
然后根据预试验的结果,阳性对照组、MTYS组每只小鼠腹腔注射试验菌液0.2ml,约含×
109CFU,健康组腹腔注射生理盐水0.2ml。
接种后8h出现典型症状时开始给药,治疗组以相当于生药2g/kgw灌服,连用7天,每日上午1次,常规饲喂,试验期为8d,每天观察小鼠的临床表现,试验第8d逐只进行称重并剖检。
相应测定体重变化脾、肝免疫指数攻毒喂药后第8d,分别从各组小鼠中空腹称重,统计MTYS对小白鼠增重的影响,然后屠宰,摘取肝、脾称重,计算其免疫器官指数(免疫器官重/宰前空腹活重×
100%),即以免疫器官的克数占千克体重的份额(g/kg)表示。
各组鸡在感染前和试验结束时分别称重1次,测定胸腺重,根据小鼠的体重变化,计算每组小鼠的平均体重和标准差。
血液采集与血清制备
在试验感染后第8d,每组随机抽取5只小鼠,禁食8~12h,心脏采血3ml,在37℃恒温水浴30min,3000r/min离心10min分离血清。
做血清因子检测。
用移液枪吸取血清,标号待测。
IgG、IgA、IgM的含量采用免疫比浊法,以上在日立7150型全自动生化分析仪上测定[9]。
均在河北北方学院一附院检验科测定。
组织匀浆制备,血清及组织匀浆因子检测转化生长因子—α、IL—1β试剂盒检测免疫力
按照说明书方法,鼠(Mice)IL—1β放射免疫试剂盒:
.1血清:
取静脉血2m1,注入试管待凝固后,4℃3000rpm离心,10min,分离血清。
放-20℃,样品可保存2个月,放-70℃以下可存放半年。
测定前使样本置于室温或冷水中复融,再次40℃3000rpm离心,5min,取上清测定。
.2组织:
取出活组织,吸去血迹,称重,尽快加入生理盐水1ml碾磨,制成匀浆,4℃3000rpm离心,15min,取上清,-20℃以下保存。
测定前最好做预实验确定样品稀释度。
取3-5份做小样,可将样品做原倍,1:
5,1:
20倍稀释,选择合适的稀释度。
另外,每种组织的样品非特异结合(U0)可能有些差异,每份标本最好申独做一个U0或每组做一个U0。
取组织的重量一般在300-400mg左右为好。
.3细胞培养液或其它体液:
如样品浓度高,可直接加样测定,如浓度低需将样品浓缩5-10倍,再加样测足,可取样品0.5ml,加入测量用的放免塑料管中再冷冻干燥机上冷冻抽干,用0.1ml生理盐水复融,做为样品管直接测定。
测定方法
本实验采用平衡法,取聚苯乙烯试管编号,按下表操作。
IL-1βRIA加样程序(μl)
试剂TNBSS0S1~S5样品U0
缓冲液—200100——100
标准液———100——
待测样品————100100
抗血清——100100100—
125I-IL-2100100100100100100
充分混匀4℃放置24小时
PR分离剂—500500500500500
充分混匀,室温放置20min,4℃3500rpm离心25min,吸弃上清,测个沉淀管,cpm数。
.4结果计算:
以B/Bo为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,在logit-log坐标纸卜绘制标准曲线,根据样品B/Bo%,从标准曲上查出样品的含量。
日前多用自动γ计数器预先编制好程序直接给出有过参数、标准曲线、样品浓度。
NSB%=(NSB管的cpm数÷
T管的cpm数)×
100%
Bo%=(Bo管的cpm数一NSB管的cpm数)÷
T管的cpm数×
100%
B/Bo%=(标准或样品管的cpm数-NSB管的cpm数÷
(Bo管的cpm数-NS管的cpm数)×
组织样品得出样品浓度后,再根据称取组织量,计算出每mg组织中的量。
尿液样品从每ml浓度再计算出每小时或每分钟排出量。
统计结果,确定中药组方疗效
所有实验数据均用t检验软件进行分析,计量资料以±
s表示,并进行t检验分析。
2结果
MTYS对2952(O142+O26+O13)菌株的MIC值为62.5g/L。
抑菌直径30.9mm为高敏,MTYS无细菌生长。
2.2中药抑制剂在机体中最佳使用剂量
为了在体内试验时,中药MTYS提取物的浓度能够在体内达到一定的药物浓度,又不影响机体的正常发育,中药MTYS的使用剂量,30日龄以每只为宜。
2.3耐药大肠杆菌最佳攻毒量
耐药性大肠杆菌2952(O142+O26+O13)菌株每只小鼠的接种量以原液的0.2mL(×
109CFU)为宜。
2.4实验期间各组死亡情况与疗效结果
自然死亡情况
在攻毒前对随机抽取的小白鼠在无菌条件下剖检观察和细菌培养,没有发现感染大肠杆菌。
说明,人工造模是在没有感染大肠杆菌的前提下进行的。
在人工病模试验,治疗组和细菌感染组鼠在攻毒后8小时,部分小白鼠出现不同程度的大肠杆菌临床症状,主要表现为精神不振,轻度腹泻、食欲减退,严重者食欲废绝等。
阳性对照和用药组均在感染18h后开始死亡,治疗后的第5天临床病症明显减轻,而阳性对照组从攻毒开始至第8天,临床症状严重者陆续死亡,到第9天存活鼠临床病症基本消失。
疗效
试验结束后增重情况从表1可以看出,阳性对照试验结束时增重最少为27.9%,阳性对照组和给药组差异显著(P<0.05);
给药组与健康组之间差异极显著(P<0.01)。
死亡率、有效率和治愈率,阳性对照组、实验组,从治疗开始到第10天结束时鼠只死亡率分别为50%和36%,健康组鼠的死亡率为0。
由此可见,鼠的死亡率,阳性对照与给药组之间有效率存在显著性差异(P<0.05)。
经过治愈阳性对照组和MTYS给药组、存在差异(P<0.05)。
表1各试验组鼠的疗效结果
组别
死亡率(%)
有效率(%)
治愈率(%)
试验开始
重(g)
期末重(g)
增重率(%)
健康组
-
±
2
2c
100d
阳性对照组
50*
50*#
30*#
a
攻毒治疗组
36
64
45a*
2a
b
注:
各观察纵项指标之间“*”表示差异显著(P<0.05);
“#”表示在不给药的情况下自己好转或自愈;
a与b、b与c、c与d之间表示差异显著(P<0.05),a与c,b与d表示差异极显著(P<0.01);
相同字母表示差异不显著(P>0.05);
“-”表示没有计算。
表2结果显示,用药后第8d试验组小白鼠肝指数及脾指数与阳性和健康组比较差异均极显著(P<0.01);
用药后第8d阳性和健康组差异不显著(P>0.05)。
证明MTYS能够提高小白鼠的免疫功能。
表2免疫器官指数结果(g/g)
脾指数
肝指数
02
.±
00
纵列“A”表示与阴性对照比较差异极显著(P﹤0.01);
“B”表示与阳性对照比较差异显著(P﹤0.01);
小写为差异显著
肝功能方面
肝脏是物质代谢最活跃的器官,酶的含量极为丰富。
肝细胞受损或肝功能障碍时,也可反映到血清中某些酶的改变,有的升高,有的降低。
临床上常利用血清中某些酶的变动来衡量肝脏功能。
大肠杆菌病可造成不同程度动物肝脏损伤,当肝脏发生病变时,细胞膜通透性增加,各种酶释放入血,导致酶的活性增高。
MTYS提取物能不能对耐药性大肠杆菌病引起的肝损伤起到保护作用,通过表3可以看出。
.1总蛋白(TP)
功毒治疗组显著低于健康组,说明机体处于高耗能状态,还没有完全恢复。
表3中药抑制剂对感染大肠杆菌鼠的某些生化指标影响
生化指标
CHO(mmol/L)
a
BUN(mmol/L)
GPT(U/L)
181±
101±
78±
GOT(U/L)
542±
ALP(U/L)
90±
f
TP(g/L)
IgG(g/L)
IgA(g/L)
IgM(g/L)
ab
LDH(U/L)
5736±
hemodiastase
3374±
CRE(μmol/L)
81±
CK(U/L)
urea(mmol/L)
纵列“a”表示与阴性对照比较差异极显著(P﹤0.01);
“b”表示与阳性对照比较差异显著(P﹤0.01);
小写为差异显著。
2.6.1.2谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)
由表3可以看出,ALT在血清中的含量,阳性对照组极显著高于阴性对照、试验组与阳性对照组比较差异显著(P<0.05)。
AST在血清中的含量,阳性对照组与其它各组比较均差异极显著(P<0.01)。
由于试验组中的ALT和AST含量均低于阳性对照组,说明MTYS具有抑制大肠杆菌对肝脏的损伤,对肝脏起保护作用[10]。
.3碱性磷酸酶(ALP)
正常动物血清ALP主要来自肝脏,测定血清中ALP的含量是了解肝脏损害程度的又一指标。
在正常情况下可经胆道排出,但当肝脏出现病变损害严重时,该酶从胆道排出受阻,同时合成减少,使血清中ALP的含量迅速下降。
由表3显示,阳性对照在感染后8d下降多,健康组和试验组血清中ALP的含量均比其它组高,且差异显著(P<0.05),同时看出,随着给药剂量的增加和治疗时间的延长,血清中ALP的含量也随着增加。
.4总胆固醇(CHO)
血脂是血液中各种脂类物质的总称,其中最重要的是胆固醇和甘油三脂。
肝脏合成胆固醇的能力很强,血浆胆固醇大部分来自肝脏,一部分来自食物,肝外组织合成的胆固醇一般很少进入血液。
肝功能不全时,胆固醇的形成、酯化、排泄发生障碍,引起血浆胆固醇含量减少。
8d血清中CHO的含量,健康组和试验组均比阳性对照组高,但差异不显著(P>0.05),TG的含量各组间没有明显变化,且差异不显著(P>0.05)。
从总体水平比较除健康组外处于下降趋势。
肾脏功能
.1尿素(UR)
在肾功能损害早期,尿素可在正常范围,由表3看出,不明显。
.2乳酸脱氢酶
它广泛存在于机体组织内,以心、肾、和骨骼肌最丰富,乳酸脱氢酶活性升高常见于急性心肌梗塞等病中。
本实验中差异不显著,说明没有危及心脏。
免疫
试验中IgG阳性对照和阴性对照差异极显著(P<0.01),和试验组差异显著。
血清型IgA可介导调理吞噬抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用;
由表3看出,在阳性对照组IgM的含量较低与其它组相比,差异显著(P<0.05),功毒组中抵抗力低下。
从三种免疫球蛋白结果观察,不同程度的增加了免疫力。
血淀粉酶(HD)
检查主要用于诊断胰腺炎,结果不显著。
2.7血清及组织细胞因子检测
转化生长因子—α对小白鼠免疫功能的影响
小鼠经人工感染耐药大肠杆菌后,血液中阳性对照组极显著低于治疗组和健康组,肝中阳性对照组和攻毒治疗组转化生长因子—α的水平显著高于健康组,脾中转化生长因子—α的水平阳性对照组极显著高于治疗组和健康组,说明感染耐药大肠杆菌后显著降低了血液中的转化生
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