生物化学与分子生物学实验Word格式文档下载.docx

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2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R250，过滤除去未溶物。

10、脱色液：

甲醇:

水:

冰乙酸=9:

2

[实验步骤]

1、准备步骤：

将凝胶板依次用水、SDS、水洗涤干净，并用沾有无水乙醇的棉花擦拭，然后使其自然风干或烘干。

试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。

2、组装电泳槽　　

1）将四只固定螺杆插进一只贮液框（半上槽）的相应孔洞中，然后将贮液框仰放在桌上。

　　2）左手拿凹型槽橡胶模框，右手的拇指与中指握住玻璃板的两侧边缘插到橡胶模框内（注意手指不能接触灌胶面的玻璃板）。

　　3）将带有玻璃的橡胶模框子放在仰放的贮液槽框架上，其下缘必须对齐贮液槽框下缘。

　　4）双手拿另一只贮液槽框与仰放在桌上的贮液槽框相合，并使橡胶框上的凸出线位于贮液槽有机玻璃框中央。

　　5）装上四只螺母，拧紧螺丝。

注意拧紧螺丝时用力应均匀，最好用双手按斜角位置双双逐渐拧紧。

　　6）将电泳槽垂直竖起，放在桌上，带短玻璃板的贮液槽称上槽（阴极端），带长玻璃板的贮液槽称为下槽（阳极端），在长玻璃板与橡胶框间有一缝隙。

此缝隙可用已熔化的10%琼脂沿长玻璃板下端灌入，为防止留存气泡，可稍抬起一端即可赶去气泡。

待琼脂完全凝固后才能灌胶。

或也可将槽垂直竖起，将带有玻璃的橡胶模框直接放入槽中，对称拧紧螺丝后，用琼脂封底边。

3、制备凝胶

1）配制10%的分离胶（20ml）：

依次将8ml蒸馏水，6.7ml30%丙烯酰胺贮存液，5ml1.5mol/LTris（pH8.8）溶液，0.2ml（200μl）10%SDS溶液，0.2ml10%过硫酸铵，0.008ml（8μl）TEMED混合，立即灌胶。

（过硫酸铵，TEMED最后加入，加入后搅拌）

2）迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。

小心在胶上覆盖一薄层正丁醇。

4）在分离胶聚合的过程（约40分钟）中，配制5%的积层胶（8ml）：

依次混合5.5ml蒸馏水，1.3ml30%丙烯酰胺贮存液，1.0ml1.0mol/LTris（pH6.8）溶液，0.08ml（80μl）10%SDS溶液，0.08ml（80μl）10%过硫酸铵，0.008ml（8μl）TEMED。

TEMED应在灌胶前才加入。

5）分离胶聚合完全后，倒去正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面数次，用滤纸吸干胶面上的残余水。

6）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。

7）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，用移液器吸取电极缓冲液清洗加样孔数次，以除去未聚合的丙烯酰胺。

8）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。

4、样品的制备

在蛋白溶液中加入等体积的2×

样品溶解液，使蛋白的终浓度为3-4mg/ml，混合液在沸水浴中加热3分钟，冷却后即可上样。

5、上样

用微量进样器（或移液枪）上样，每加入一种样品，应在下槽中洗涤加样器数次，最后在空白加样孔中加入等体积的SDS样品溶解液。

6、电泳

上贮液槽导线与电泳仪的负极相连，下贮液槽导线与电泳仪的正极相连。

打开电源，初始电压为100-120V，当染料进入分离胶（这段时间约为20min）后，将电压提高到200-220V，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。

7、后处理

1）电泳结束，旋松螺母，取出胶框，剥出玻璃板，在两块玻璃板下角空隙内，用刀片背面轻轻撬动，即可将胶面与一块玻璃板分开，将有胶板的玻璃板平放在桌上，双手轻轻沿凝胶底将胶片托起，放在大培养皿中。

2）染色：

迅速加入染色液（至少覆盖全部凝胶），60℃染色0.5小时，回收染色液。

3）脱色：

将凝胶浸泡于脱色液中，直至背景脱至无色，其间更换脱色液3-4次。

4）拍照：

将脱色完后，呈现出清晰蛋白条带的凝胶用数码相机拍照，附于实验报告中。

[实验结果]

绘制蛋白图谱，并对其进行必要说明。

[注意事项]

N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。

但其凝固后就变成无毒物质。

[思考题]

1.浓缩胶（积沉胶）和分离胶什么区别？

各自在电泳中的主要作用？

2.配胶时，为什么过硫酸铵和TEMED要最后加入？

3.样品溶解液中各组分的作用分别是什么？

实验二　植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定

糖类是自然界存在的数量最多的有机化合物，它既是植物躯体和细胞的结构成份，又是生命活动能量的主要来源，并且与植物体内各类物质的代谢密切相关，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类及其变化，对了解植物体内的组织代谢和农产品的品质，具有重要意义。

本实验采用硅胶G薄层层析法，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类，要求通过本实验，学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，掌握吸附薄层层析的原理，操作及其在糖类鉴定中的作用。

植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经除去杂质，即可获得较纯的可溶性糖混合物。

薄层层析是一种快速而微量的层析方法，它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法，本实验只讨论吸附薄层层析，即所有支持物是吸附剂（如硅胶粉），层析时，主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。

糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。

硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目，不同的糖分子由于分子量及羟基数的不同，因而它与硅胶分子间的吸附力不同。

造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来，一般吸附力的大小为：

三糖>

双糖>

己糖>

戊糖。

其中各种糖移动的速率可用Rf值表示。

通过与标准糖的Rf值比较。

即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。

溶质斑点中心到样点的距离：

Rf（值）=溶剂前沿到点样点的距离

1、材料：

苹果或其他植物材料

2、仪器：

离心机及离心管、天平、研钵、量筒（25ml）、移液管（10ml）、恒温水浴、毛细管、层析缸、吹风机、烘箱、喷雾器、烧杯、铅笔，尺子，硅胶GF254薄层层析板。

3、试剂

展开剂（氯仿：

冰醋酸：

水=30：

35：

5）

5%标准糖溶液（10mg/ml）：

木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖等。

显色剂：

2mL苯胺，10mL85%磷酸，2g二苯胺，1mL浓盐酸，100mL丙酮，溶解后混匀）

[实验步骤]

1、硅胶板活化：

将硅胶板置于120℃烘干箱中，烘干30min。

2、水果中可溶性糖提取液的制备：

取洗净的苹果（或其他水果）削去果皮，称3g果肉在研钵中研成匀浆后，倒在双层洗净的纱布上。

包起置于漏斗，用干净玻璃棒将果汁压出。

取果汁1ml于离心管中，加无水乙醇3ml，充分混匀后，在3000转/分下离心20分钟，上清夜即为可溶性糖提取液。

3、苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定：

取活化后的硅胶G板一块，距底边1.5厘米水平线上确定5个点，相互间隔1厘米，其中4个点，分别点上5%的木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖标准溶液数滴，另一点点上苹果提取液数滴。

在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶G板的方向点样，而且毛细管接触G板的时间应尽量短，不然点样斑点直径难以控制，点样量约20－30μL，分次滴加，使点扩散后的直径不超过3ｍｍ。

4、展层

将点样后的薄层板置于密闭的薄层层析缸中，用新配制的展开剂，采用上行法展层，至展开剂距薄层板的上端约１cm时取出，用吹风机吹干。

5、显色

把一块薄板放在通风橱内，采用苯胺－二苯胺－磷酸（2g二苯胺，加2mL苯胺，10mL85%磷酸，1mL浓盐酸，100mL丙酮，溶解后混匀）显色剂丙酮溶液喷雾法显色，然后于85℃烘箱中烘10-30分钟，各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较，根据斑点颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。

显色剂处理后不同单糖显现的颜色

单糖

颜色

葡萄糖

蓝紫

半乳糖

果糖

橙红

木糖

蓝绿

鼠李糖

绿

精确量出原点至溶剂前沿，以及各斑点中心的距离，计算出它们的Rf值。

根据标准糖的颜色和Rf值，鉴定出样品中糖的种类，并绘出层析图谱。

原点至斑点中心的距离

Ｒf＝──────────────。

原点至展开剂前沿的距离

1、点样时，要注意点样点不能太大，操作时，应待第一次点样风干后，再在原点样点上继续点样，为少量多次点样。

2、每个点样点不宜距离太近，点样点不宜靠近硅胶板边缘，注意边缘效应。

3、放置硅胶板时，不能碰着层析缸的内壁。

4、在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。

为减轻或消除边缘效应，可先将展开剂导入层析缸中，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。

实验三酵母RNA的提取

掌握从真核细胞中提取RNA的方法。

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

其中苯酚法又是实验室最常用的。

组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。

此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。

酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%~10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%~0.516%。

为此提取RNA多以酵母为原料。

工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。

这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。

稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

提取的RNA有不同程度的降解。

浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。

RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。

加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。

（2）地衣酚显色法：

核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与苔黑酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。

（3）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[（NH4）3PO4·

12MoO3]。

[器材与试剂]

水浴恒温振荡器、冰箱、电子天平、冷冻离心机、烧杯、锥形瓶、离心管、量筒、玻棒

1、食用干酵母：

2g

2、0.2%氢氧化钠溶液，0.2gNaoH溶于蒸馏水并稀释至100ml。

3．乙酸。

4．95%乙醇。

5．异丙醇。

6．10%硫酸溶液：

浓硫酸（比重1.84）10ml，缓缓倾于水中，稀释至100ml。

7．氨水。

8．5%硝酸银溶液：

5gAgNO3溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。

9．三氯化铁浓盐酸溶液：

将20μl10％三氯化铁溶液（用FeCl3·

6H2O配制）加入到4ml浓盐酸中。

10．苔黑酚溶液：

用三氯化铁浓盐酸溶液将苔黑酚溶液配成0.1%的苔黑酚溶液，配1－2mL

1．RNA的提取：

置2g干酵母粉于150ml三角瓶中，加入0.2%NaOH溶液20ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌。

加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH6-7），转入50ml离心管中，5000r/min，离心10-15分钟。

小心把上清液倒入另一干净离心管中，加入异丙醇不少于20ml，边加边搅拌。

加毕，静置，待完全沉淀，小心倾去上层约一半溶液，较多絮状沉淀的下层置离心机，5000r/min，离心10分钟弃上清。

沉淀用95%乙醇洗2次（每次约10ml），空气中晾干后，沉淀即为粗RNA，可作鉴定。

2．鉴定：

取上述RNA沉淀，加10%硫酸液5ml，加热至沸1~2分钟，将RNA水解。

5000r/min，离心10分钟取上清。

⑴取水解（上清）液0.1ml，加苔黑酚—FeCl3试剂1ml，加热至沸1分钟，观察颜色变化。

⑵水解液2ml，加氨水2ml及5%硝酸银溶液1ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物。

注意，有时絮状物出现较慢，可放置10分钟。

[实验结果]

记录观察到的现象，根据实验现象判断提取物的成分，并解释原因。

实验四大蒜细胞SOD的提取和分离

通过大蒜细胞SOD的提取与分离，学习和掌握蛋白质和酶的提取与分离的基本原理和操作方法。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。

这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。

近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。

过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。

生物体内产生的自由基主要有超氧自由基（O2.－）、羟自由基（OH.）、过氧自由基（ROD）、烷氧自由基（RO）等。

植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）和抗坏血酸过氧化物酶（ASA-POD）等是酶促防御系统的重要保护酶。

抗坏血酸（VC）、VE和还原型谷胱甘肽（GSH）等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。

SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O2.－、H2O2、OH.和O2等活性氧的含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。

SOD是含金属辅基的酶。

高等植物含有两种类型的SOD：

Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们可催化下列反应：

O2.－＋O2.－＋2H＋SOD→H2O2＋O2

H2O2＋CAT→H2O＋1/2O2

由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。

并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。

邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物，在420nm有最大吸收峰。

邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。

颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。

恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、玻璃研钵、玻棒、烧杯、量筒、精密pH试纸

二、材料和试剂

1、新鲜蒜瓣

2、A液：

pH8.2,0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）-盐酸缓冲溶液（内含1mmol/EDTA-2Na）。

称取1.2114gTri和37.2mgEDTA2Na溶于62.4ml0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100ml.（缓冲液需调pH8.2）

3、B液：

4.5mmol/L邻苯三份盐溶液。

称取邻苯三酚（A.R）56.7mg溶于少量10mmol/L盐酸溶液，并定容到100mL.

4、10mmol/L盐酸溶液

（注：

常用的浓盐酸是37%-38%，密度为1.19g/ml,浓盐酸摩尔浓度约11.7）

5、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）（自查，先分别配置pH7.8Na2HPO4和NaH2PO4溶液，后以适当配比组成）

6、氯仿-乙醇混合液：

氯仿:

无水乙醇=3:

5

7、丙酮：

用前需预冷至4-10℃

1、组织细胞破碎：

称取3g大蒜蒜瓣，置于预冷研钵中，加入少量的石英砂及5mL0.05mol/L磷酸缓冲液，冰浴上研磨成匀浆，移入15mL离心管。

用5mL磷酸缓冲液冲洗研钵，洗涤并入离心管中，磷酸缓冲液的最终体积为10mL，全部转入离心管中，在5000rpm下离心15min，取上清液（提取液）。

留出1ml备用，准确量取剩余上清液体积。

2、除杂蛋白：

上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。

3、SOD的沉淀分离：

粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。

将SOD沉淀溶于5mL0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，得到SOD酶液。

留出1ml备用，准确量取剩余上清液体积

4、SOD酶活性测定

1）将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

SOD活力测定加样程序见表：

试剂

空白管

OD1

OD2

对照管

SOD提取液

SOD粗酶液

SOD酶液

A液/mL

3.00

SOD液/mL

0.1

蒸馏水/mL

2.00

1.80

1.7

室温放置20min

B液/mL

0.2

OD值

2）加入邻苯三酚后迅速混匀，准确计时4min，加一滴浓盐酸停止反应，420nm测吸光值（OD）

[结果]

1、酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×

5/0.1

（1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量）

总活力U=活力单位×

总体积

比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度

纯化倍数=粗酶液（酶液）比活力/提取液比活力

回收率=粗酶液（酶液）总活力/提取液总活力

　2、根据所得结果计算出提取液、粗酶液和酶液酶活力单位、总活力、比活力、纯化倍数、回收率，并写出计算过程。

1、酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。

实验五菜花（花椰菜）中核酸的分离和鉴定

1、初步掌握从植物中分离核酸的方法。

2、掌握RNA、DNA的定性检定方法。

用冰冷的稀三氯醋酸或稀高氯酸溶液在低温下抽提菜花匀浆，以除去酸溶性小分子物质；

再用有机溶剂，如乙醇、乙醚等抽提，去掉脂溶性的磷脂等物质。

最后用浓盐溶液（10%氯化钠溶液）和0.5mol/L高氯酸（70℃）分别提取DNA和RNA，再进行定性检定。

由于核糖和脱氧核糖有特殊的颜色反应，因此可用定糖法来定性定量测定核酸。

1、核糖的测定：

测定核酸的常用方法是苔黑酚（即：

3，5-二羟甲苯）法（Orcinol反应）。

当含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5-二羟甲苯在沸水浴中加热10-20分钟后，有绿色物产生，这是因为RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，后者再与3，5-二羟甲苯作用产生绿色物质。

100℃

　　　　　RNA＋浓盐酸＋二羟甲苯──→绿色复合物

FeCl3

　DNA、蛋白质和粘多糖等物质对测定有干扰作用。

2、脱氧核糖的测定：

测定脱氧核糖的常用方法是二苯胺法。

含有脱氧核糖的DNA在酸性条件下和二苯胺在沸水浴中共热10分钟后，产生蓝色。

这是因为DNA嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-6-酮基戊醛，它再和二苯胺作用产生蓝色物质。

　　　　　100℃

　　　　　DNA＋少量浓H2SO4＋二苯胺──→蓝色物

　此法易受多种糖类及其衍生物和蛋白质的干扰。

上述两种定糖的方法准确性差，但快速简便，能鉴别DNA与RNA，是检定核酸、核苷酸的常用方法。

恒温水浴、电炉、离心机、布氏漏斗、吸管、烧杯、量筒、剪刀

1、新鲜菜花：

20g

2、95％乙醇：

50ml

3、丙酮：

60ml

4、5％高氯酸溶液：

5、0.5mol/L高氯酸溶液：

6、10％氯化钠溶液：

8g氯化钠，加蒸馏水定容至80ml。

7、石英砂：

0.4g

8、二苯胺试剂：

将0.1克二苯胺溶于10毫升冰醋酸中，再加入0.275毫升浓硫酸（置冰箱中可保存6个月。

使用前，在室温下摇匀）。

9、三氯化铁浓盐酸溶液：

10、苔黑酚乙醇溶液：

取0.06g苔黑酚溶于1ml95％乙醇中（可在冰箱中保存1个月）。

一、核酸的分离：

1、取菜花的花冠20克，剪碎后置于研钵中。

加入20毫升95％乙醇和0.4克石英砂，研磨成匀浆。

然后用布氏漏斗抽滤，弃去滤液。

2、滤渣中加入20毫升丙酮，搅拌均匀，抽滤，弃去滤液。

3、再向滤渣中加入20毫升丙酮，搅拌5分钟后抽干（用力挤压滤渣，尽量除去丙酮）。

4、在冰盐浴中，将滤渣悬浮在预冷的20毫升5％高氯酸溶液中。

搅拌抽滤，弃去滤液。

5、将滤渣悬浮于20毫升95％乙醇中，抽滤，弃去滤液。

6、滤渣中加入20毫升