细胞生物学全套资料第三章细胞生物学研究方法文档格式.docx
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D分辨率
λ波长,最短可见光波长λ=450nm
α物镜镜口角,通常α最大值可达140º
N介质折射率,空气中N=1
D=292nm,约0.3微米
油镜:
N可提高到1.5,
D值可达0.2微米
普通光镜的最大分辨率=0.2微米
表2-1介质的折射率
介质
空气
水
香柏油
α溴萘
折射率
1
1.33
1.515
1.66
光学显微镜的放大倍数
*普通光线的波长,为400~700nm
显微镜分辨力数值,不会小于0.2μm
*人眼的分辨力是0.2mm
一般显微镜设计的最大放大倍数,通常为1000X。
普通光镜样品的制备:
材料的固定(如甲醛等)→包埋(
如石腊)→切片(厚度5微米)
观察前一般需要染色:
*伊红、美蓝:
能特异性地与不同蛋白质结合
*品红:
DNA染色
(二)荧光显微镜
图2-2尼康E800荧光DIC显微镜
荧光的产生:
*细胞中某些物质
如叶绿素,受紫外线照射后可发荧光
*有些物质本身,不能产发荧光
用荧光染料or荧光抗体染色后→经紫外线照射亦可发荧光
*荧光显微镜,是能进行定性&定量研究的工具之一
图2-3落射式照明原理
荧光显微镜&普通显微镜,有以下的区别:
1.
照明方式,通常为落射式
即,光源通过物镜,投射于样品上(图2-3)
2.
光源波长较短,分辨力>普通显微镜
3.
有2个特殊的滤光片
光源前滤除部分可见光,保留459-490nm蓝色光
目镜、物镜之间
510nm的反射光
(2)
520-560nm进入视野(3),以保护人目
图2-4荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色)图片来自http:
//www.itg.uiuc.edu/
(三)激光共聚焦扫描显微境
图2-5激光共聚焦扫描显微镜
图2-6LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,
图片来自http:
激光共聚焦扫描显微镜
(laserconfocalscanningmicroscope,图2-5、6)
1.用激光作扫描光源→逐点、逐行、逐面、快速扫描成像→扫描的激光&荧光的收集,共用一个物镜→物镜的焦点,即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点
(样品一般经免疫荧光标记)
2.激光束λ较短,光束很细
激光共聚焦扫描显微镜,有较高的分辨力
大约是普通光学显微镜的2.4~3倍。
3.系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内
(类似扫描仪)
调焦深度不一样时,得到不同深度的图像
得到的图像信息都储于计算机内
通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构
4.激光共聚焦扫描显微镜
可用于观察细胞形态
也可用于细胞内
生化成分的定量分析
光密度统计
细胞形态的测量
(四)暗视野显微镜
暗视野显微镜(darkfieldmicroscope,图2-7)
聚光镜:
*中央有挡光片,照明光线不直接进人物镜
只允许被标本反射&衍射的光线进入物镜
*视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的
此显微镜能见到,小至4~200nm的微粒子
分辨率,比普通显微镜高50倍
图2-7暗视野照明方式
(五)相差显微镜
相差显微镜(phasecontrastmicroscope,图2-8、9)
*P.Zernike于1932年发明了相差显微镜
获1953年诺贝尔物理奖
*这种显微镜最大的特点
可以观察未经染色的标本和活细胞
相差显微镜的基本原理:
*把透过标本的可见光的光程差→变成振幅差
*提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见
相差显微镜,不同于普通光学显微镜:
1.环形光阑,位于光源&聚光器之间
使透过聚光器的光线,形成空心光锥
焦聚到标本上
2.相位板
物镜中加了,涂有氟化镁的相位板
可将直射光or衍射光的相位,推迟1/4λ
此外,分为两种:
A+相板:
*将直射光推迟1/4λ
两组光波合轴后,光波相加,振幅加大
标本结构比周围介质更加变亮
形成亮反差(或称负反差)。
B+相板:
*将衍射光推迟1/4λ
两组光线合轴后,光波相减,振幅变小
*形成暗反差(或称正反差)
结构比周围介质更加变暗
图2-8相差显微镜照明原理
图2-9一种介壳虫的染色体(PCM照片)
(六)偏光显微镜(polarizingmicroscope)
*用于检测具有双折射性的物质
如,纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等
*与普通显微镜不同的是:
光源前有偏振片(起偏器)
使进入显微镜的光线为偏振光
镜筒中有检偏器
(与起偏器垂直的起偏器)
这种显微镜的载物台是可以旋转的:
①当载物台上,放入单折射的物质时
无论怎样旋转载物台
由于两个偏振片是垂直的
显微镜里看不到光线
②而放入双折射性物质时
由于光线通过这类物质时,发生偏转
旋转载物台,便能检测到这种物体
(七)微分干涉显微镜
(differentialinterferencecontrastmicroscope,DIC)
优点:
*能显示三维立体投影影像
*与相差显微镜相比
标本可略厚一点
折射率差别更大,故影像的立体感更强。
微分干涉差显微镜DIC
*光源,偏振光
*有四个特殊的光学组件:
偏振器
棱镜
滑行器
检偏器
*适于细胞的结构,特别是一些较大的细胞器
如,核、线粒体等
立体感特别强
适合于显微操作
像基因注入、核移植、转基因等显微操作
常在这种显微镜下进行
图2-10DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)
(八)倒置显微镜
*组成与普通显微镜一样
*物镜、照明系统颠倒(图2-11)
照明系统
↑
载物台
物镜
*用于观察培养的活细胞,具有相差物镜
图2-11莱卡倒置显微镜
二、电子显微镜
(一)透射电子显微镜
1、基本原理
光学显微镜:
*无法看清<0.2µ
m的,显微结构or超微结构
*必须选择波长更短的光源,提高显微镜的分辨率
1932年Ruska发明了透射电子显微镜
(transmissionelectronmicroscope,TEM)
*电子束的波长≦可见光、紫外光
*电压越高,波长越短
*目前TEM的分辨力,可达近0.1nm
约为光镜的1000倍
电子显微镜&光学显微镜区别(p52,表3-1)
光学显微镜
电子显微镜
分辨本领
200nm
100nm
接近0.1nm(1000)
光源
可见光
紫外光
电子束
波长
λ400-700nm
λ约200nm
0.01-0.9nm
透镜
玻璃透镜
电子透镜
真空
不要求
1.33×
10-5~1.33×
10-3pa
成像原理
利用样品对光的吸收,形成明暗反差&颜色变化
利用样品对电子的散射&透射,形成明暗反差
表2-2不同光源的波长
名
称
X射线
α射线
0.1Kv
10Kv
波长(nm)
390~760
130~390
0.05~13
0.005~1
0.123
0.0122
电子显微镜的样品
*电子束的穿透力很弱
*电镜标本,须用超薄切片
厚度约50nm左右,需要用超薄切片机
电子显微镜:
放大倍数最高,可达近百万倍
由,①电子照明系统②电磁透镜成像系统
③真空系统④记录系统⑤电源系统等
图2-12JEM-1011透射电子显微镜
2、制样技术
(1)超薄切片
通常以锇酸&戊二醛固定样品→以环氧树脂包埋→以热膨胀or螺旋推进的方式,推进样品切片(图2-13)→切片厚度20~50nm→切片采用重金属盐染色,以增大反差(图2-14)。
图2-13莱卡超薄切片机
图2-14内质网透射电镜图(伪彩色)
(2)负染技术
负染就是用重金属盐(如磷钨酸、醋酸双氧铀)→对载网上的样品染色→吸去染料→样品干燥后→在样品凹陷处铺了一薄层重金属盐,而凸的出地方则没有染料沉积→从而出现负染效果(图2-15)→分辨力可达1.5nm左右
图2-15肌动蛋白纤维的负染电镜照片
(3)冰冻蚀刻
冰冻蚀刻(冰冻断裂)
标本的制备:
样品在-100˚C干冰or-196˚C的液氮中冻结→用冷刀,骤然将标本断开→冰在真空升华→暴露出断面结构→称为蚀刻(etching)
样本的处理:
蚀刻后→向断面以45°
角喷涂一层蒸汽铂→再以90°
角喷涂一层碳→加强反差&强度→然后用次氯酸钠溶液消化样品→把碳、铂的膜剥下来→此膜为复膜(replica)→复膜显示出了标本蚀刻面的形态→在电镜下得到的影像,即标本中细胞断裂面处的结构(图2-16)。
图2-16冰冻蚀刻电镜照片
(二)扫描电子显微镜
图2-17JEOL扫描电子显微镜
扫描电子显微镜:
(scanningelectronmicroscope,SEM,图2-17、18、19)
20世纪60年代问世
用来观察标本的表面结构,工作原理:
用一束极细的电子束,扫描样品→在样品表面激发出次级电子→次级电子的多少与样品的表面结构有关→次级电子由探测器收集→被闪烁器转变为光信号→经光电倍增管和放大器转变为电信号→显示出与电子束同步的扫描图像→图像为立体形象,反映了标本的表面结构。
为了使标本表面发射出次级电子→标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。
目前:
*扫描电镜分辨力,为6~10nm
*人眼:
0.2mm
*扫描电镜最大有效放大倍数:
0.2mm/10nm=20000X
人眼20000X
图2-18光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较
图2-19人类血细胞SEM照片
图片来自
(三)扫描隧道显微镜
(scanningtunnelingmicroscope,STM)
1981年Binnig等,根据量子力学原理中的隧道效应而设计。
当原子尺度的针尖(类似探头)→在<nm的高度上扫描样品时,电子云重叠→外加一电压(2mV~2V)时→针尖与样品之间产生隧道效应,电子逸出,形成隧道电流
电流强度:
与针尖、样品间的距离,有函数关系→当探针沿物质表面,在给定高度扫描时→因样品表面原子凹凸不平,使探针&物质表面间的距离,不断发生改变→从而引起电流,不断发生改变→将电流的改变,图像化,即可显示出原子水平的凹凸形态。
扫描隧道显微镜
*分辨率很高
*固态、液态&气态物质,均可进行观察
*普通电镜,只能观察制作好的固体标本
利用扫描隧道显微镜,直接观察生物大分子:
*如DNA、RNA、蛋白质等分子的原子布阵
*如生物膜、细胞壁等的原子排列
目前TEM的分辨力,可达近0.1nm
不同显微镜的放大倍数
*一般显微镜设计的最大放大倍数,通常为1000倍
约为光镜的1000倍,人眼的1000,000倍
*横向为0.1~0.2nm,纵向可达0.001nm
三、显微操作技术
图2-20尼康NT-88NE显微操作/注射仪
(图片来自
显微操作技术(micromanipulationtechnique):
在高倍复式显微镜下,利用显微操作器(图2-20)进行细胞or早期胚胎操作的一种方法。
显微操作器:
用以控制显微注射针,在显微镜视野内移动的机械装置。
显微操作技术包括:
①细胞核移植②显微注射③嵌合体技术
④胚胎移植⑤显微切割等
细胞核移植技术已有几十年的历史:
①Gordon等人(1962)对非洲爪蟾进行核移植获得成功
②我国著名学者童第周等
在鱼类细胞核移植方面,取得了丰硕成果
③多莉羊(体细胞)
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