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QPCR原理及应用Word下载.docx
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光电倍增管和冷光CCD摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。
在实时PCRT增过程中,荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。
具体数据就是基线,荧光阈值和Ct值。
2.Real-timeqPCR的数学原理
首先来看一个real-timeqPCR中的重要参数Ct值(Ctvalue),阈值
(threshold),和基线(baseline)。
一般来讲,第3-15个循环的荧光值就是
基线,是由于测量的偶然误差引起的。
阈值一般是基线的标准偏差的10倍。
在
实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。
Ct值就是荧光值达到阈值时
候的PCR循环次数。
所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢?
我们来看PCR的扩增方程:
从线性方程上看,斜率(slope)为-1/lg(1+E),所以E=10-1/slope-1。
如
果从标准曲线上得到斜率(),就可以算出扩增效率()。
一般来讲PCRT增效率在90%-1108都是可以用于数据分析的。
效率低于100%是由于PCR反应中存在抑制因素;
而高于100刑能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚体造成。
3.Real-timeqPCR的种类
根据real-timeqPCR的化学发光原理可以分为2大类:
一类为探针类,包括TaqMan探针和分子信标,利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加;
一类为非探针类,其中包括如SYBR@Green或者特殊设计的引物(如LUX@Primers)通过荧光染料来指示产物的增加。
Taqman砂针法
Taqman探针是最早用于定量的方法。
就在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸:
5'
端标记一个报告荧光基
团,3'
端标记一个淬灭荧光基团。
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收,也就是FRET反应;
PCFT增时,Taq酶的5'
-3'
外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
而新型TaqMan-MG探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP,有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。
分子信标法
分子信标:
一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。
在此发夹结构中,位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。
分
子信标的茎环结构中,环一般为15-30个核苷酸长,并与目标序列互补;
茎一般5-7个核苷酸长,并相互配对形成茎的结构。
荧光基团连接在茎臂的一端,而淬灭剂则连接于另一端。
分子信标必须非常仔细的设计,以致于在复性温度下,模板不存在时形成茎环结构,模板存在时则与模板配对。
与模板配对后,分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。
当荧光基团被激发时,它发出自身波长的光子。
SYBR@Greer法
SYBR@Green是一种结合于小沟中的双链DNA吉合染料,与双链DNA吉合后,其荧光大大增强。
这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。
SYBR@Green
I的最大吸收波长约为497nm发射波长最大约为520nm在PCR反应体系中,加入过量SYBR@Gree荧光染料,SYBR@Gree荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR@Gree染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
LUX@Primers法
LUX@lightuponextention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项
新技术。
目标特异的引物对中的一个引物3'
端用荧光报告基团标记。
在没有单链模板的情况下,该引物自身配对,形成发夹结构,使荧光淬灭。
在有目标片断的时候,引物与模板配对,发夹结构打开,产生特异的荧光信号。
4.Real-timeqPCR和常规PCR的区别
实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测
敏感性高
需要样品少
特异性高
精确定量
三、Real-timeqPCR实验设计
实验设计其实比实验本身更重要!
好的实验设计可以事半功倍,节省时间!
尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验
路线。
当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分析原因,才有可能创新。
对于一个real-timeqPCR而言,首先就是实验材料的处理和准备;
然后引物设计,这步至关重要,好的引物是实验本身成功的50%
进行实验和数据分析(这一部分单独说明)。
1.实验材料的处理和准备
以最基本的基因表达差异分析为例。
实验材料分为对照组(CON和处理组
(TRT。
组内要有生物重复,可以数据分析此处理是否有统计意义。
在材料收
集过程中,尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品)。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材。
现在新技术的发展,也有一些非液氮类的样品储存液,比如百泰克的RNAfixer。
2.引物设计
一般real-timePCR引物的设计遵循下面一些原则:
扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-603之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5'
端可以修饰。
引物3'
端不可修饰。
端要避开密码子的第3位。
Taqman探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。
遵循下面以下原则:
尽量靠在上游引物;
长度30-45bp,Tm比引物高至少5C;
5'
端不要是G,G会有淬灭作用,影响定量
四、Real-timeqPCR操作过程
1.RNA提取和反转录
在抽提RNA3程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
由于RNA酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循下面一些原则:
1.全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2.使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA避免使用公共仪器所
导致的RNA酶交叉污染。
例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RNA酶。
3.在提取裂解液中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会
要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°
C的
烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然,这些也不是绝对的要求。
如果是操作熟练。
完全可以用初次开封的离心管和枪头,新过滤的超纯水,进行RNA勺提取。
配制
一般来讲,进行real-timeqPCRMasterMix都是2X的浓缩液,只需要加入模
板和引物就可以。
由于real-timeqPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。
通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意:
1.MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。
2.更多的配制Mix进行,减少加样误差。
最好能在冰上操作。
3.每管或每孔都要换新枪头!
不要连续用同一个枪头加样!
4.所有成分加完后,离心去除气泡。
5.每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料(refereneedye,passivedye)常用的是ROXTM现在已经是ABI的注册商标了!
)或者其他染料,只要不影响检测PCF产物的荧光值就可以。
参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡,校正加样误差或者是孔与孔之间的误差,提供一个稳定的基线。
现在很多公司已经把ROXTM己制在MasterMix或者Premixture里。
如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲,real-timeqPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。
由于其产物长度在80-150bp之间,所以只需要变性和退火就可以了。
SYBR@Gree等染料法,最好在PCRT增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。
而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。
3.仪器设置
所有仪器的操作都基本一致。
设置的时候包括反应板设置(platesetup)和程
序设置(programsetup)。
我们以ABIStepOne为例,详细看一下反应设置:
A.首先是实验目的选择:
定量还是其他。
我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。
B.实验方法的选择:
我们选用的比较Ct的SYBRGreen方法,Fast程序,以cDNA为模板进行。
C.目的基因的设置:
有几个目的基因和目的基因的名称。
D.样品的设置:
包括哪个是实验组,哪个是对照组。
以及负对照的设置和生物重复的设置。
E.对照组和内参基因的设置:
这个是为后面的定量做准备
F.反应程序的设置:
PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。
比如BioTeke的95C2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10分钟)。
循环反应是95T15秒,60C15秒的40个循环。
溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。
或者是仪器说明书上建议的程序。
G.反应体系的设置:
A-G这五个步骤简单设置好,可以保存,修改反应程序或者立刻进行反应。
需要注意一点ABI仪器需要加ROX参比染料,默认的是ROX有些公司是把ROX或者其他染料配制在MasteMix里面;
也有的是单独分开。
要根据不同公司的MasterMix进行这一个步骤的选择。
BioTeke的MasterMix里没有参比染料,所以选择“none”。
设置好之后,就可以把配置好的PCR管放进仪器,点击RUN
五、Real-timeqPCR数据分析
1.Real-timeqPCR常见参数
基线(baseline)通常是3-15个循环的荧光信号
同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线
阈值(threshold)
自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍
手动设置:
置于指数扩增期,刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。
同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值,但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。
Ct值:
与起始浓度的对数成线性关系。
分析定量时候一般取Ct:
15-35。
太大或者太小都会导致定量的不准确。
Rn(Normalizedreporter)是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。
△Rn:
ARn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(厶Rn=Rn基线)。
2.影响Ct值的关键因素
模板浓度
模板浓度是决定Ct的最主要因素。
控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。
反应液成分的影响
任何分子的荧光发射都受环境因素影响—比如溶液的pH值和盐浓度。
PCR反应的效率
PCF反应的效率也会影响Ct值。
在PCFT增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增,与PCRT增效率高的条件下相比,可能会所产生斜率不同的标准曲线。
PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。
一般说来,反应效率在90-110%
之间都是可以接受的。
3.如何评估实时定量PCR反应的效果
PCR扩增效率:
为了正确地评估PCRT增效率,至少需要做3次平行重复,至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。
R2值:
另一个评估PCR效率的关键参数是相关系数R2,它是说明两个数值之间相关程度的统计学术语。
如果R2等于1,那么你可以用丫值(Ct)来准确预测X值(量)。
如果R2等于0,你就不能通过丫值来预测X值。
R2值大于时,两个数值之间相关的可信度很好。
精确度:
标准偏差(standarddeviation,偏差的平方根)是最常用的精确度计量方法。
如果许多数据点都靠近平均值,那么标准偏差就小;
如果许多数据点都远离平均值,则标准偏差就大。
实际上,足够多重复次数产生的数据组会形成大致的正态分布。
这经常可通过经典的中心极限理论来证明,独立同分布随机变量在无限多
时趋向于正态分布。
如果PCR反应效率是100%,那么2倍稀释点之间的平均Ct间隔应该恰为1个Ct值。
要以%勺几率分辨2倍稀释浓度,标准偏差就必须小于等于。
标准偏差越大,分辨2倍稀释的能力就越低。
为了能够在95%以上的情况下分辨出2倍稀释,标准偏差必须小于等于。
灵敏度:
无论CT绝对值是多少,任何能够有效扩增和检测起始模板拷贝数为1的系统都
达到了灵敏度的极限。
PCR效率是决定反应灵敏度的关键因素。
在检测极低拷贝数时的另一个重要的考虑因素是,低拷贝时的模板数量不能按普通情况来预期。
相反,它会遵循泊松分布,即进行大量的平行重复,平均应该含有一个拷贝的起始模板,实际上约37%f含有拷贝,仅有约37%含有1个拷贝,约18澈际上含有两个拷贝。
因此,为了更可靠地检测低拷贝,必须做大量的平行重复实验来提供统计显著性,并克服泊松分布的限制。
评价荧光PCF结果的标准
因素建议指标
效率5个数量级梯度稀释Slope〜R2>
精密度至少3个重复标准差<
(或者1个Ct之内)
灵敏度增加低浓度样本的重复数统计分析
除了这些因素,还必须评估和验证合适的实验对照(如无模板
对照,无反转录酶对照等)以及模板质量。
3.Real-timeqPCR定量方法
可以分绝对定量和相对定量。
绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线,在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较,从而得到
目的基因的量。
该标准品可以是纯化的质粒DNA体外转录的RNA或者是体外
合成的ssDNA相对定量可以分比较Ct法和其他一些相对方法。
比较Ct指的是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因表达差异,也称之是2-△△Ct。
绝对定量
2-△△Ct定量
其他定量方法
MarisaL.WongandJuanF.Medrano:
BioTechniquesJuly2005
六、Real-TimeqPCR常见问题分析
1.无Ct值出现
检测荧光信号的步骤有误:
一般SG法采用72C延伸时采集,Taqmar法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
引物或探针降解:
可通过PAGE电泳检测其完整性。
模板量不足:
对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
模板降解:
避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
2.Ct值出现过晚(Ct>
38)
扩增效率低:
反应条件不够优化。
设计更好的引物或探针;
改用三步法进行反应;
适当降低退火温度;
增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR产物太长:
一般采用80-150bp的产物长度。
3.标准曲线线性关系不佳
加样存在误差:
使得标准品不呈梯度。
标准品出现降解:
应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品引物或探针不佳:
重新设计更好的引物和探针。
模板中存在抑制物,或模板浓度过高
4.负对照有信号
引物设计不够优化:
应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳:
适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高:
适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。
模板有基因组的污染:
RNA提取过程中避免基因组DNA勺引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
5•溶解曲线不止一个主峰
6.扩增效率低
反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
反应条件不够优化:
可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
反应体系中有PCF反应抑制物:
一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
7.同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线,如何判断?
判断标准:
扩增效率,灵敏度,特异性
如果扩增效率在90%-110%都是特异性扩增,都可以把数据用于分析
8.扩增曲线的异常?
比如“S'
型曲线?
参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时,选NONE)
模板的浓度太高或者降解
荧光染料的降解
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