人MT1H基因对肺腺癌细胞A549增殖的阻碍及其机制文档格式.docx
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Keywords:
Lungadenocarcinoma;
MT1H;
Cellproliferation;
cyclinD1
0引言
金属硫蛋白(MTs)是一类富含半胱氨酸,缺少芳香族残基的低分子量蛋白质。
人MT基因位于染色体16q13,包括10个功能性基因和7个非功能性基因[1]。
功能性基因包括:
MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3、MT4。
目前很多研究发觉MT和肿瘤发生进展有关[2]。
ECRG2基因是通过mRNA不同显示技术,利用正常食管血组织和来自林县的三对高癌家族分离与鉴定的新基因[3]。
CuiY等[4]通过酵母双杂交技术发觉ECRG2和MT1H有彼此作用。
进一步研究MT1H和ECRG2具体如何彼此作用,第一需要明确MT1H的功能。
本实验咱们第一构建携带MT1H基因的重组真核表达载体/mychis()MT1H,然后对转染该基因的肺癌细胞A549的增殖特性进行了实验研究。
1材料与方式
细胞株、菌株和载体
肺腺癌细胞A549由本室保留。
真核表达载体mychis()B、DH5a菌株、含pACT2MT1H的DH5a菌株来自中国医学科学院肿瘤研究所病因室。
要紧试剂
TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、XbaI和BamHI内切酶、100bpLaddermarker、DNA胶回收试剂盒、逆转录试剂盒均为Takara产品。
LipofectamineTM2000、TRIZOL均为Invitrogen公司产品。
MTT为Sigma公司产品。
鼠抗人His抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。
引物由北京奥科生物公司合成。
目的基因的扩增
据MT1H全长cDNA序列及mychis()质粒图谱,设计一对引物:
P1:
5′TGATCTAGAATGGACCCCAACTGCTCC3′,在上游引物5′端引入XbaI酶切位点;
P2:
5′GATGGATCCGGCACAGCAGCTGCAC3′,在下游引物5′端引入BamHI酶切位点。
以质粒pACT2MT1H为模板,扩增MT1HcDNA。
PCR条件为:
94℃变性30sec,56℃退火35sec,72℃延伸1min,共35个循环。
PCR产物经%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
()MT1H重组质粒的构建及鉴定
用XbaI、BamHI别离双酶切PCR扩增产物和(),%琼脂糖凝胶电泳,凝胶回收试剂盒回收目的片段,于4℃在T4DNA连接酶作用下连接留宿,然后转化DH5a感受态细胞,挑选Amp抗性克隆,最后用PCR、双酶切、测序方式鉴定阳性克隆,命名为()MT1H。
细胞转染和阳性克隆挑选
参照LipofectamineTM2000说明书,将()MT1H和()质粒转染人肺癌细胞A549中,48h后,将转染细胞按l:
4传代,继续培育24h,换含G418400μg/ml的培育液挑选2周。
挑取单细胞阳性克隆继续在含G418200μg/ml的培育液中扩大培育。
别离命名为A549MT1H和A549空。
用半定量RTPCR和Westernblot鉴定转染是不是成功
RTPCR收成对数生长期的A54九、A549空和A549MT1H细胞。
用Trizol试剂提取各组细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA含量与纯度。
用AMV逆转录酶制备cDNA,取cDNA进行PCR扩增。
MT1H引物为P1:
5′CCAGTCTCACCTCGGCTTG3′;
5′TAGCAAATGAGTCGGAGTTGT3′,扩增片段294bp。
βactin引物为:
5′CATCCTGCGTCTGGACCT3′;
5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′,扩增片段480bp。
扩增条件为:
94℃2min;
94℃30sec,54℃30sec,72℃1min,35个循环;
72℃5min。
取10μl扩增产物进行%琼脂糖凝胶电泳。
Westemblot搜集细胞,加入RIPA细胞裂解液裂解细胞,Bradford法测蛋白浓度。
样品加入5×
蛋白上样缓冲液混合,煮沸5min,取等量蛋白上样进行SDSPAGE电泳;
电泳后,将蛋白转移至μmPVDF膜,丽春红染色,5%脱脂奶粉封锁;
随后加入鼠抗人his抗体,4℃孵育留宿;
加HRP标记二抗,作用1h,然后DAB显色。
MTT法绘制细胞生长曲线
取对数生长期细胞,用%的胰酶消化后计数,按每孔2×
104个细胞接种于96孔培育板,每组设6个平行孔,于37℃,5%CO2培育箱中培育。
天天掏出一块培育板,每孔加5mg/mlMTT10μl,继续培育4h后弃培育液,每孔加150μlDMSO,于振荡器振荡10min后用酶标仪570nm处测OD值,取6个孔的平均值,以时刻为横坐标,OD值为纵坐标作图。
流式细胞术检测MT1H对细胞周期的阻碍
搜集对数生长期细胞,经胰酶消化,制成单细胞悬液,PBS洗2次,70%冷乙醇固定,PI染色,上样于流式细胞仪。
RTPCR检测cyclinD1的表达
操作步骤同。
cyclinD1引物为:
上游:
5′CCAGTGACAAACCATCCAGT3′;
下游:
5′GGATATTCCCAAACCATTC3′,扩增片段为371bp。
5′GTGGGGCGCCCAGGCACCAC3′;
5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3′,扩增片段为500bp。
94℃50sec,55℃1min,72℃1min,30个循环;
72℃10min。
统计学分析
实验数据以±
s表示,采纳统计软件进行方差分析或t查验。
2结果
()MT1H真核表达载体构建结果
将()MT1H重组质粒用XbaI和BamHI双酶切,%琼脂糖凝胶电泳,结果显示两条带,别离为和192bp,与()和MT1H的大小一致,见图1。
将()MT1H阳性重组子进行DNA测序,测序结果与Genbank中的MT1H基因cDNA序列完全吻合。
说明()MT1H真核表达载体构建成功。
RTPCR检测MT1HmRNA的表达
A549MT1H细胞扩增出大小为480bp的βaction条带和294bp的特异目的条带,而A549和A549空细胞仅扩增出大小为480bp的βaction条带,未扩增出目的条带,说明MT1H已成功转染A549细胞,见图2。
Westernblot检测带His标签的MT1H融合蛋白表达
A549MT1H细胞提取总蛋白中检测出一条特异性目的条带,而A549空细胞未检测出目的条带。
证明稳固转染MT1H基因的A549MT1H细胞中有带His标签的MT1H融合蛋白表达,见图3。
细胞生长曲线
MTT结果说明,与A549和A549空细胞相较,A549MT1H细胞增殖速度明显增快。
MT1H对A549细胞增殖的阻碍从第3天开始具有显著不同(P&
lt;
),见图4。
MT1H对A549细胞周期的阻碍
A549MT1H细胞与A549和A549空细胞比较,G0/G1期细胞明显减少,S期明显增多,见表1。
表1MT1H对A549细胞周期的阻碍(略)
MT1H对A549细胞cyclinD1表达的阻碍
A549空和A549MT1H细胞cyclinD1mRNA表达别离为±
、±
,与A549空相较,A549MT1H细胞cyclinD1表达明显升高(P&
),见图5。
3讨论
自从1957年Margoshes和Vallee等从蓄积镉的器官马肾中分离出MT以来,MT引发大伙儿极大的关注[5]。
MT具有特殊的生理功能,能够和亲电子金属、氧自由基和某些细胞代谢产物结合,参与有机体的生理和病理进程。
最近几年来,MT和疾病专门是肿瘤的关系成为研究热点。
MT参与肿瘤细胞凋亡、增殖、肿瘤血管形成和化疗耐药,阻碍医治和预后[2]。
可是目前对MT异构体了解还很少。
Friedline[6]等通过比较4株乳腺癌细胞MT异构体mRNA表达发觉,MT1E只在雌激素阴性细胞株中表达不在雌激素阳性细胞株表达。
Garrett和Somji等[7,8]发觉MT1X在进展期前列腺癌中表达下调,而在膀胱癌中上调。
Jin等[9]发觉MT1F在3级分化的乳腺导管癌中显著升高。
VolkanGurel等[10]证明不同MT异构体对不同肿瘤细胞增殖阻碍不同,稳固转染MT3能抑制MCF7和Hs578T细胞株增殖,但不抑制细胞株T47Dor和MDAMB231增殖。
MT1E转染却对以上四株细胞生长均不阻碍。
这提示各类MT异构体功能可能存在不同,在不同细胞和组织,各类异构体承担着不同的作用。
早在1988年Kgi和Schaffer[11]就指出不同金属硫蛋白异构体在人发育或在不同生理条件下可能功能不同。
Bylander等[12]也推测各类MT异构体有独特的功能。
可是各类异构体的具体功能如何,它们功能存在不同的缘故是什么,均需要进一步研究。
这对了解MT在肿瘤发生进展中的作用具有重要意义。
本实验要紧目的是了解MT异构体1H对人肺腺癌细胞A549生长的阻碍及其机制。
咱们实验结果说明,采纳脂质体介导的转染技术增强肺癌细胞A549中MT1H表达,可明显增进A549增殖,G0/G1期细胞减少,S期细胞增多。
进一步检测cyclinD1表达的转变,发觉A549MT1H细胞cyclinD1表达明显高于A549-空细胞。
cyclinD1是重要的细胞周期调控蛋白,要紧功能是促使细胞通过G1/S限制点进入S期。
其表达失控时,将引发细胞周期失调,致使细胞增殖和凋亡失衡,可促使细胞恶性转化[13]。
因此,MT1H增进肺腺癌细胞A549增殖,可能和上调cyclinD1促使细胞进入S期增多有关,其确切机制还需要进一步研究。
本实验为进一步研究MT1H的分子生物学特性提供了实验依据,为深切探讨MT1H的作用机制和与其他基因的彼此作用奠定了基础。
至于MT1H是不是对肺癌细胞其他生物学行为有阻碍和相关传导途径,有待进一步深切研究。
【参考文献】
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- MT1H 基因 腺癌 细胞 A549 增殖 阻碍 及其 机制