微生物检测技术实验Word格式.docx

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这两个细菌在培养的早期均产生有机酸、但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。

因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。

伏－普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性未端产物的能力，如丙酮酸。

丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。

二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏－普反应阳性；

不产生红色化合物者为阴性反应。

有时为了使反应更为明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。

其化学反应过程如下：

产气肠杆菌为阳性反应，大肠杆菌为阴性反应。

柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。

有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；

而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。

细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基的pH升高，当加人1％溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会由绿色变为深蓝色。

溴麝香草酚蓝的指示范围为：

pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0～7.0时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。

硫化氢试验是检测硫化氢的产生，也是用于肠道细菌检查的常用生化试验。

有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物．

以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：

大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阳性。

三、器材

1、菌种：

大肠杆菌，产气肠杆菌。

2、培养基：

蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，柠檬酸盐斜面培养基，醋酸铅培养基。

蛋白胨水培养基:

蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL，pH7.6,121℃灭菌20min。

葡萄糖蛋白胨水培养基：

蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO42g，水1000mL，调pH7.2，分装，121℃灭菌20min。

柠檬酸盐培养基：

NH4H2PO41g，K2HPO41g，NaCl5g，MgSO40.2g，柠檬酸钠2g，琼脂15-20g，水1000mL，1%溴香草酚蓝乙醇液10mL，将上述试剂加热溶化后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤，分装，121℃，20min灭菌后制成斜面。

注意不要过碱，以黄绿色为准。

牛肉膏蛋白胨培养基：

牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，琼脂15-20g，水1000mL，pH7.0-7.2,121℃灭菌20min。

醋酸铅培养基：

pH7.4的牛肉膏蛋白胨琼脂100mL，硫代硫酸钠0.25g，10%的醋酸铅水溶液1mL。

将牛肉膏蛋白胨琼脂加热溶化，待冷至60℃时加入硫代硫酸钠0.25g，并调pH7.2，分装于三角瓶中，115℃灭菌15min，取出后冷至60℃，加入10%的醋酸铅水溶液1mL，混匀导入试管。

在配制柠檬酸盐斜面培养基时，其pH不要偏高，以浅绿色为宜。

吲哚试验中用的蛋白胨水培养基中宜选用色氨酸含量高的蛋白胨，如用胰蛋白水解素得到的蛋白胨较好。

3、溶液或试剂：

甲基红指示剂，40％KOH，5％α－萘酚，乙醚，吲哚试剂等。

四、操作步骤

1、接种与培养

（1）用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验），置37℃培养48h。

（2）将上述二菌分别接种于2支蛋白胨水培养基（吲哚试验），2支葡萄糖蛋白胨水培养基（甲基红试验和伏－普试验），2支柠檬酸盐斜面培养基和2支醋酸铅培养基中，置37℃培养2d。

2、结果观察

（1）硫化氢试验：

培养48h后观察黑色硫化铅的产生。

（2）吲哚试验：

于培养2d后的蛋白胨水培养基内加3～4滴乙醚，摇动数次，静置l～3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加人2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。

配制蛋白胨水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋自酶水解酪素得到的蛋白胨中色氨酸含量较高。

（3）甲基红试验：

培养2d后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳胜，变黄色者为阴性。

注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。

（4）伏－普试验：

培养2d后，将另1支葡萄糖蛋白陈水培养物内加人5～10滴40％KOH，然后加入等量的5％α－萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应速度。

若培养物呈红色者，为伏－普反应阳性。

（5）柠檬酸盐试验：

培养48h后观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。

蓝色为阳性，绿色为阴性。

五、实验报告

1、结果

将实验结果填人下表。

“＋”表示阳性反应，“一”表示阳性反应。

菌名

IMViC试验

硫化氢试验

吲哚试验

甲基红试验

伏－普试验

柠檬酸盐试验

大肠杆菌

产气肠杆菌

对照

2、思考题

（1）讨论IMViC试验在医学检验上的意义。

（2）解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？

（3）为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？

这个试验与伏－普试验最初底物与最终产物有何异同处？

为什么会出现不同？

（4）说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。

可以用哪种化合物代替醋酸铅？

实验二水中细菌总数的测定

1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2、了解水源水的平板菌落计数的原则。

本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。

由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。

目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。

1、培养基：

肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水。

2、仪器或其他用具：

灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

1、水样的采取

（1）自来水：

先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。

（2）池水、河水或湖水：

应取距水面10～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。

2、细菌总数测定

（1）自来水

①用灭菌吸管吸取lmL水样，注入灭菌培养皿中。

共做两个平皿。

②分别倾注约15mL已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。

③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。

④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。

两个平板的平均菌落数即为lmL水样的细菌总数。

（2）池水、河水或湖水等

①稀释水样：

取3个灭菌空试管，分别加人9mL灭菌水。

取lmL水样注入第一管9mL灭菌水内、摇匀，再自第一管取lmL至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2与10-3。

稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。

一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。

②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加人空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。

③各倾注15mL已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。

④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。

3、菌落计数方法

（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。

若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。

若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

（2）首先选择平均菌落数在30～300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表2－1，例1）。

（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。

若其比值小于2，应采取两者的平均数；

若大于2，则取其中较小的菌落总数（见表2－1，例2及例3）。

（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（见表2－1，例4）。

（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（见表2－1，例5）。

（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（见表2－1，例6）。

表2－1计算菌落总数方法举例

平板

菌落数

1mL自来水中细菌总数

1

2

稀释度

10－1

10－2

10－3

平均菌落数

计算方法

细菌总数/mL

（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？

（2）你所测的水源水的污秽程度如何？

（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度、培养时间等）来测定水样总数呢？

为什么？

实验三多管发酵法测定水中大肠菌群

1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法。

2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。

多管发酵法包括初（步）发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

l、初（步）发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白陈液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。

乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。

为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色．溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽胞菌生长的作用。

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；

此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下地可能延迟48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。

48h后仍不产气的为阴性结果。

2、平板分离

平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endo’smedium）或伊红美蓝琼脂（eosinmethyleneblueagar，EMBagar），前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。

亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。

伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。

初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。

3、复发酵试验

以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。

原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管），三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管（瓶）（内有倒置小套管），伊红美蓝琼脂平板，灭菌水。

乳糖蛋白胨培养基：

蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl5g，1.6的溴甲酚紫乙醇液1mL，水1000mL，将蛋白胨，牛肉膏，乳糖及NaCl加热溶于1000mL水中，调pH7.2至7.4，加入溴甲酚紫乙醇液1mL，混匀，分装，115℃灭菌20min。

伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g，NaCl5g，K2HPO42.0g，2%伊红水溶液20-30mL，0.65%美蓝水溶液10-15mL，琼脂20g，水补足1000mL，pH7.4,121℃灭菌20min。

载玻片，灭菌带玻璃塞空瓶，灭菌吸管，灭菌试管等。

1、水样的采取同实验二。

2、自来水检查

（1）初（步）发酵试验：

在2个含有50mL三倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中，各加人100mL水样。

在10支含有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10mL水样（如图3－1）。

混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。

（2）平板分离：

经24h培养后，将产酸产气及48h产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18～24h，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

①深紫黑色、有金属光泽。

②紫黑色、不带或略带金属光泽。

③淡紫红色、中心颜色较深。

（3）复发酵试验：

经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阴性无芽抱杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落l～3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。

证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表3－2，即得大肠菌群数。

图3－1多管发酵法测定水中大肠菌群的操作步骤和结果解释

3、池水、河水或湖水等的检查

（1）将水样稀释成10-1与10-2。

（2）分别吸取lmL10-2、10-1的稀释水样和lmL原水样，各注入装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。

另取10mL和100mL原水样，分别注入装有5mL和50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。

（3）以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。

（4）将100、10、1、0.1（10-1）mL水样的发酵结果查表3－2，将10、1、0.1（10-1）、0.01（10-2）mL水样的发酵管结果查表3－3，即得每升水样中的大肠菌群数。

表3－1大肠菌群检数表

接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）

表3－2大肠菌群检数表

接种水样总量111.1mL（100mL、10mL、1mL、0.1mL各1份）

“＋”大肠菌群发酵阳性；

“－”大肠菌群发酵阴性

表3－3大肠菌群检数表

接种水样总量11.11mL（10mL、1mL、0.1mL、0.01mL各1份）

“＋”发酵阳性；

“－”发酵阴性

（1）自来水100mL水样的阳性管数是多少？

10mL水样的阳性管数是多少查表3－1得每升水样中大肠菌群数是多少？

（2）池水、河水或湖水阳性结果记“＋；

阴性结果记“一”。

查表3－2得每升水样中大肠菌群数是多少？

查表3－3得每升水样中大肠菌群数是多少？

水样管/mL

发酵结果

100

10

0.1

0.01

（1）大肠菌群的定义是什么？

（2）假如水中有大量的致病菌——霍乱弧菌，用多管发酵技术检查大肠菌群，能否得到阴性结果？

（3）EMB培养基含有哪几种主要成分？

在检查大肠菌群时，各起什么作用？

（4）经检查，水样是否合乎饮用标准？

实验四细菌抗酸性染色法

掌握抗酸性染色的方法。

抗酸染色法是鉴别分枝杆菌属细菌重要的染色法。

分枝杆菌属的细菌脂类化合物含量高．其中含有长链的分枝菌酸。

分枝菌酸易与石炭酸复红结合，又不易被酸性酒精脱色，因此分枝杆菌被染成红色。

因为菌体着色困难，所以要用微火加热的方法，有助于菌体着色。

但是一旦着色又不易洗脱。

不含分枝菌酸的细菌着色后易被洗脱，再经复染而成蓝色。

草分枝杆菌（Mycobacteriumphlei），金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）斜面菌种。

2、试剂：

齐氏石炭酸复红液、3％盐酸酒精液、吕氏美兰染液。

3、其它：

显微镜、含4mL生理盐水试管、载玻片等。

1、取分枝杆菌和金黄葡萄球菌斜面菌种和生理盐水试管，分别制菌悬液。

2、按常规涂片，风干。

3、初染：

在两种菌的涂片上分别加上石炭酸复红染液，微火加热使冒蒸汽，但不蒸干，不沸腾，继续滴加染液，10分钟后倾去染液。

4、酸性酒精脱色，使流下的酒精无红色为止，水洗。

5、复染：

用吕氏美蓝复染2分钟，水洗，风干。

6、镜检。

草分枝杆菌菌体红色，金黄色葡萄球菌菌体蓝色。

根据染色结果绘制出示意图。

本实验所用的染色方法与细菌的芽孢染色法有何异同？

能否用芽孢染色的方法进行抗酸性染色？