草莓的花药培养文档格式.docx

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草莓病毒种类繁多，现约有28种，我国产区普遍存在有4种，即草莓斑驳病毒（SMoV、草莓皱缩病毒（SCrV）、草莓轻型黄边病毒（SMYEV和草莓镶脉病毒（SVBV。

我国草莓产区这4种病毒单一品种带毒率在80%以上,2种病毒复合感染率在20%^30%，3种病毒复合感染率也有3%左右，单一病毒感染植株可使草莓减产20%-30%2种病毒复合感染减产可达50%栽培年限越长，感染病毒种类越多，发病受害程度越重。

草莓病毒病主要由蚜虫、无性分株繁殖、根结线虫等传播。

1.2发病条件

1.2.1毒源。

草莓田发病与有病草莓田或其他自然发病寄主的远近与数量，有直接关系。

1.2.2传毒媒介生物。

传毒媒介昆虫与线虫的出现时间和数量，对病毒传播有直接影响。

1.2.3栽培。

重茬地由于土壤中积累的传毒线虫及昆虫的数量增多，发病加重。

与果树、棉花、瓜类等邻近或间套种的草莓，易受到草莓传毒昆虫的侵袭而加重发病[2]。

2草莓花药培养的一般方法

2.1材料

草莓花药取自田间未脱毒苗。

宜采用花粉发育至4〜6mn大小的单核靠边期的花药。

通常花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是：

花萼未开放，花蕾略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色或者淡绿且不松动，花药微黄而充实。

2.2预处理

将采取的新鲜花药放在2〜4C的低温中储藏24h。

2.3消毒

表面消毒先用自来水将花药冲洗干净，用纱布轻轻擦干，对草莓花蕾用70%酉精浸泡1s，然后用0.1%升汞消毒4min,最后用无菌水冲洗3〜4次（此条件下草莓花药的愈伤组织形成率较高，可达80%，而其他的表面消毒处理效果均不太理想）[3]。

需要注意的是：

带有花丝的花药易形成花丝的愈伤组织，而花药愈伤组织形成受到严重抑制。

所以剥取花药时，尽量不要剥取到带花丝的花药。

2.4培养基

MS+BA1.0mg/L+2，4-D0.5mg/L

（1）

培养基

（1）加肌醇100mg/L、水解酪蛋白100mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L，pH5.8。

丛生增值培养基：

MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L

（2）诱导生根培养基：

1/2MS+NAA0.2mg/L（3）培养基

（2）、（3）各加0.3%蔗糖、0.8%琼脂，pH5.8。

2.5培养条件

培养温度25C，光照强度1200Lx，光照时间12h/d。

2.6愈伤组织的诱导

将经过灭菌后的草莓花药接种于

（1）号培养基中培养。

2.7丛芽的诱导与增殖

当愈伤组织的直径2〜3mm寸，应及时转入分化培养基中，约

3周后分化出芽点，约5周后形成明显的丛生芽，将芽切成小块，接种于

（2）号培养基上进行增殖。

2.8根的诱导

将高约3cm生长健壮的无根苗接种于（3）号培养基上，

约2周后，苗基部长出辐射状的白色小根，每株生根5〜7条，3

周后，根生长1.0〜1.5cm。

2.9炼苗

将培养有试管的玻璃瓶打开，在室温通风处炼苗3d，取出

小苗，洗去根部残留培养基移到已高压灭菌消过毒的蛭石和腐殖土等量的基质中，喷施0.1%的多菌灵溶液，炼苗1周即可移栽。

2.10移栽适温、高湿是移栽成活的关键，再结合沙培移栽，成活率一

般在90%以上。

要利用塑料薄膜进行保湿，每天喷水2次，1周

后揭膜[4]。

3影响草莓花药培养的主要因素

3.1基因型及小孢子发育时期不同基因型的材料，花药诱导率不同。

同时，愈伤组织的颜色与基因型的关系也很密切。

侯喜林在对草莓花药进行离体培养时观察到：

女峰的愈伤组织多为绿色或黄绿色，宝交早生的愈伤组织则多呈黄白色或红色（少量为黄绿色），而丰香的大部分愈伤组织是褐色的。

即使在同一种内、同一方法不同材料也有很大差别。

有的材料对某些培养基根本无反应。

花药培养时，花粉在接种时所处的发育时期可能比培养基更为重要，不同物种最适接种的花粉发育时期各异。

薛光荣等指出，以花粉处于单核靠边期的花药为外植体结合低温预处理对愈伤组织的诱导最为有利。

组织学研究证实，花药壁在花粉产生愈伤组织和形成花粉胚过程中对其有一定的影响作用，只有贴靠在花粉壁附近的花粉才能顺利实现脱分化[5]。

这说明由绒毡层起源的某些重要物质梯度变化对愈伤组织有重要影响。

3.2培养基成分

3.2.1基本培养基。

基本培养基种类及无机盐成分配比的变化对花药离体培养中愈伤组织的产生有决定性的影响。

对草莓花药培养而言，MSWhite及F、GN等均可作为其愈伤诱导培养基。

无机成分中铁对多种植物花药培养中愈伤组织的产生有重要影响，螯合铁被认为是必须的。

另外，培养基中的有机成分对愈伤组织的诱导同样具有重要作用。

3.2.2碳源。

蔗糖浓度在花药培养诱导单倍体植株过程中起重要作用。

较高的蔗糖浓度可以提高花药培养效率，周毓君等采用8．0%蔗糖，抑制了草莓花药壁细胞分化，但未能抑制药隔细胞的分化。

不同碳源对花药培养效果也不同，徐振南研究蔗糖、乳糖、甘油、葡萄糖在草莓花药培养中的作用，认为3.0%-5.0%的乳糖效果明显优于蔗糖[5]。

而Owen等研究了葡萄糖、蔗糖、麦芽糖3种碳源，结果表明葡萄糖效果最好。

3.2.3激素。

大量试验结果证明，花药离体培养过程中，各生长调节物质的配比及含量对愈伤组织的产生具有重要的影响作用。

它们的组成与配比不但显著地影响出愈率，而且对愈伤也有重要的调控作用。

浓度为0.12mg/L的GA对草莓芽的增殖有一定的促进作用。

另外低浓度的GA对草莓芽的增殖有一定的促进作用，但高浓度的易引起茎生长而节间数目不变，使得草莓苗生长瘦高、发育不良，不利于壮苗移栽。

合理的NAA与KT配比对愈伤组织的诱导是不可或缺的。

较高的细胞分裂素可在一定程度上抑制花丝产生愈伤组织。

Nyman和Wallin的试验也表明，培养基中一定量的TDZ同样有利于愈伤组织的诱导与分化。

高庆玉等证实花药愈伤组织诱导以LS+NAA+B为好，2,4-D效果不如NAA其中以LS+NAA6.5mg/L+BA2mg/L为最佳，诱导率可达92.8%。

同时还发现，出愈率高的激素组合，愈伤组织生长也好。

在继代增殖培养中，适当的激素浓度是获得高增殖倍数及良好生长情况的一个关键因素。

过高或过低的激素浓度都会影响芽增殖及生长效果。

而在继代的不同阶段要求的激素浓度是不同的[6-7]。

一般随着继代代数的增加，要求激素浓度逐渐降低，这与试验中激素的累积作用有关。

高水平的细胞分裂素倾向于诱导丛芽的形成，但浓度过高，则形成的芽过于细密且嫩茎质量下降，不利于下一步的生根培养。

随着继代代数的增加，所用激素浓度应降低。

3.2.4附加成分。

Margaret在草莓花药培养试验中发现，于培养基中附加脱乙酰古兰糖或再附加小麦淀粉可显著提高愈伤诱导率；

而在双层培养中，于固体层中加入活性炭则会抑制愈伤组织的生长，但对小孢子分化无影响。

花药培养中常用的条件培养基也是由于其中含有某些有机成分而有利于愈伤组织产生。

吴伟民等研究发现，分化培养基中添加5〜15mg/LAgN03匀可提高不定芽的分化率，以8mg/LAgN03较为适宜［5,8］。

3.3预处理

为了提高花粉植株的诱导率，往往需要对接种花药进行预处理。

接种前的预处理对愈伤组织产生有明显影响，尤其在诱发小孢子脱分化方面作用明显。

李玉花等以高压静电场处理花药后，发现可显著提高愈伤组织诱导率，而且静电场处理后组培茎丛苗可使超氧物歧化酶（SOD活性升高，丙二醛（MDA含量降低，为抗性育种提供一定依据。

一般认为，低温处理通过延缓花药正常发育途径，从而有利于花药培养中细胞的脱分化。

草莓花蕾经4C低温处理3d可显

著提高愈伤组织诱导率，同时，愈伤组织形成的时间也明显提前。

若处理时间过长，诱导率则显著下降，这可能是因为长时间的低温处理造成花药组织的过度消耗而引起生活力下降，从而影响培

养效果[5，9，10]

3.4培养方式与环境

3.4.1培养基。

草莓花药培养一般采用琼脂固化培养法。

但采用液体漂浮培养法，花粉胚或愈伤组织的形成率比固体培养基上明显增加。

液体培养使用花药中的生长诱导物质容易扩散到培养基中，从而诱发更多的花药对培养起反应。

Margaret等在草莓花药培养中采用固液双层培养法，但愈伤诱导频率和小孢子分裂频率与琼脂固化培养法相比都有所降低。

3.4.2光照。

光质对植株再生有不同的影响，往往光合的作用光谱对再生作用最有效，在实验室培养过程中最常用的是白色荧光。

秦永华发现，绿膜和红膜对芽的分化有明显促进作用。

Owen等研究表明，先暗培养30d，然后在白色荧光下培养30d比直接在黄光或白色荧光下培养的芽诱导率要高很多。

但适合单倍体诱导的光质和光量尚需要进一步研究。

3.4.3培养温度。

一般都控制在25C左右。

谢鸣曾采用20C和25C2种温度诱导了花药愈伤组织形成，结果表明20C诱导的愈伤组织结构紧密，颜色绿，活力强，易分化[5]。

3.5诱导生根的最适条件已有若干的研究报道，如柏新富等认为在草莓试管苗的生根

培养基中，用1/2MS和1/4MS的生根率明显高于MS而在促进生根的生长调节剂中，以NAA对草莓试管苗诱导效果最好。

刘庆忠等则认为，用1/2MS+IBA0.5mg/L培养基的效果较好。

另外，

般都认为活性炭有利于生根生长素NAA和IBA对诱导草莓生根

都具有良好效果，但两者诱导根系分化的特征有所不同，即NAA诱导生根数较多，IBA促进新根伸长作用明显[11]。

3.6花粉发育时期对诱导率的影响将不同发育期的草莓花粉接种到相同培养基中。

研究结果表明，花蕾直径为3〜5mm花蕾的花瓣未张开、花药颜色为淡黄色；

镜检花粉发育时期为单核期的花药，其诱导率达78.9%左右；

花蕾直径在6mn以上，花瓣微开，花药颜色呈深黄色或褐色，镜检花粉发育时期为单核靠边期或接近双核期，愈伤组织诱导率只有21.1%。

小花蕾的诱导率是大花蕾的3〜4倍[6]。

3.7CPPU浓度对其诱导和分化的影响

在诱导培养基中，当CPPU浓度为1mg/L时，愈伤组织诱导

率最高，达86.3%;

而当CPPI浓度低于0.5mg/L或达4mg/L时，愈伤组织的诱导率相对较低；

当CPPI浓度为1mg/L时，大于1mm的愈伤组织团块占75.5%，说明愈伤组织生长速度较快。

因此，诱导培养基中添加1mg/LCPPU有利于草莓花药愈伤组织的形成和增殖。

此外，从愈伤组织不经继代培养直接分化不定芽的情况来看，在以CPPL为生长调节剂且浓度为1mg/L或2mg/L时，诱导培养基上可直接形成不定芽，但频率较低[12]。

4问题与展望

草莓花药培养的意义在日益加大。

在育种工作中，利用此项技术，可缩短材料的纯化时间，还可通过对杂交F1、F2的花药

培养选择特异的性状。

但草莓花药培养仍有待发展，综合运用各种手段提高花粉的诱导率；

应用分子生物学手段对花药培养进行基础性研究，从根本上消除基因对花粉植株诱导率的影响；

在提高花粉植株诱导率的基础上，将花药培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相结合，在短时间内培育高抗优质的草莓新品种。

特别是以花药培养单倍体愈伤组织或单倍体植株作为转化受体，可以实现外源基因的稳定转化，避免外源基因的丢失及发生致命突变，是草莓转化研究中尚未开发而具有广泛应用前景的领域。

在提高花粉植株诱导率的基础上，构建双单倍体群体，为分子标记、图谱的构建、基因克隆以及种种遗传学研究提供理想的研究材料。

同时，采用分子生物技术对所获得的单倍体、混倍体和双单倍体进行简便高效的检测，以对其进行科学合理的利用。

利用花药培养技术获得单倍体植株，进行各种变异体及纯合二倍体诱导的有效方法尚需摸索，今后应加强在上述领域的研究，以加速该项技术在草莓育种实践中的应用。