植株生理生长指标测定Word文档格式.docx
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11.试管架;
12.容量瓶10ml;
13.药勺;
14.石英砂适量;
15.烧杯10ml、1000ml。
(三)试剂
1、乙酸乙酯(分析纯)。
2、次硫酸钠(Na2S2O4),分析纯,粉末。
3、1%TTC溶液:
准确称取TTC1.0g,溶于少量水中。
定容到100ml。
4、0.4%TTC溶液:
准确称取TTC0.4g,溶于少量水中。
5、磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7):
6、1mol/L硫酸:
用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml,边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000ml。
7、0.4mol/L琥珀酸:
称取琥珀酸4.72g,溶于水中,定容至100ml即成。
三、实验步骤
1、定性测定
(1)配制反应液:
把1%TTC溶液、0.4mol/L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:
5:
4比例混合。
(2)把根仔细洗净,把地上部分从茎基切除。
将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置37℃左右暗处放1~3h,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有脱氢酶存在。
2、定量测定
(1)TTC标准曲线的制作
取0.4%TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中,加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲腙。
再用乙酸乙酯定容至刻度,摇匀。
然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含甲腙25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列,以空白作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。
(2)称取根尖样品0.5g,放入10ml烧杯中,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml,把根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~3h,此后加入1mol/L硫酸2ml,以停止反应(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,其他操作同上)。
(3)把根取出,吸干水分后与乙酸乙酯3~4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎,以提出甲月替。
红色提取液移入试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次,皆移入试管,最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比测出吸光度,查标准曲线,即可求出四氮唑还原量。
四、结果计算
C—从标准曲线查出的四氮唑还原量(mg);
W—样品质量(g);
t—反应时间(h)。
植物体内硝酸还原酶活力的测定
硝酸还原酶(nitratereductase,NR),是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐(NO3ˉ+NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O)。
产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸(或对–氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。
生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法测定。
硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。
一般单位鲜重以μg氮/(g·
h)为单位。
NR的测定可分为活体法和离体法。
活体法步骤简单,适合快速、多组测定;
离体法复杂,但重复性较好。
Ⅰ离体法
一、实验材料、试剂与仪器设备
(一)实验材料
水稻、小麦或其他植物叶片、幼穗等。
(二)试剂
1、亚硝酸钠标准溶液:
准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于无离子水后定容至1000mL,然后再吸取5mL定容至1000mL,即为含亚硝态氮的1μg/mL的标准液。
2、0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液:
Na2HPO4·
12H2O30.0905g与NaH2PO4·
2H2O2.4965g加无离子水溶解后定容至1000mL。
3、1%磺胺溶液:
1.0g磺胺溶于100mL浓度为3mol/L的HCl中(25mL浓盐酸加水定容至100mL即为3mol/LHCl)。
4、0.02%萘基乙烯胺溶液:
0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中,贮于棕色瓶中。
5、0.1mol/LKNO3溶液:
2.5275gKNO3溶于250mL0.1mol/LpH7.5的磷酸缓冲液。
6、0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液:
8.8640gNa2HPO4·
12H2O,0.0570gK2HPO4·
3H2O溶于1000mL无离子水中。
7、提取缓冲液:
0.1211g半胱氨酸、0.0372gEDTA溶于100mL0.025mol/LpH8.7的磷酸缓冲液中。
8、2mg/mLNADH溶液:
2mgNADH溶于1mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液中(临用前配制)。
(三)仪器设备
冷冻离心机,分光光度计,天平(感量0.1mg),冰箱,恒温水浴,研钵,剪刀,离心管,具塞试管,移液管,洗耳球。
二、实验步骤
(一)标准曲线制作
取7支洁净烘干的15mL刻度试管按表1顺序加入试剂,配成0~2.0μg的系列标准亚硝态氮溶液。
摇匀后在25℃下保温30min,然后在540nm下比色测定。
以亚硝态氮(μg)为横坐标(X),吸光度值为纵坐标(Y)建立回归方程。
表1配制标准溶液时各物质加入量
试剂/mL
管号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠标准液
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
蒸馏水
1.8
0.0
1%磺胺
0.02%萘基乙烯胺
每管含亚硝态氮/μg
(二)样品中硝酸还原酶活力测定
1、酶的提取
称取0.5g鲜样,剪碎于研钵中置于低温冰箱冰冻30min,取出置冰浴中加少量石英砂及4mL提取缓冲液,研磨匀浆,转移于离心管中在4℃、4000r/min下离心15min,上清液即为粗酶提取液。
2、酶的反应
取粗酶液0.4mL于10mL试管中,加入1.2mL0.1mol/LKNO3磷酸缓冲液和0.4mLNADH溶液,混匀,在25℃水浴中保温30min,对照不加NADH溶液,而以0.4mL0.1mol/LpH7.5磷酸缓冲液代替。
3、终止反应和比色测定
保温结束后立即加入1mL磺胺溶液终止酶反应,再加1mL萘基乙烯胺溶液,显色15min后于4000r/min下离心5min,取上清液在540nm下比色测定吸光度。
根据回归方程计算出反应液中所产生的亚硝态氮总量(μg)。
三、结果计算
x—反应液酶催化产生的亚硝态氮总量(μg);
VT—提取酶时加入的缓冲液体积,mL;
VS—酶反应时加入的粗酶液体积,mL;
W—样品鲜重,g;
t—反应时间,h。
Ⅱ活体法
一、材料、仪器设备及试剂
2、1%磺胺溶液:
3、0.02%萘基乙烯胺溶液:
4、0.1mol/LKNO3溶液:
5、30%三氯乙酸溶液:
30g三氯乙酸,水溶后定容至100mL。
真空泵、真空干燥器、小烧杯、玻璃瓶塞、其他用具同离体法。
二、实验步骤
(一)标准曲线制作:
同离体法
(二)酶反应及活性测定
1、取样:
称取作物叶片1.0~2.0g4份,剪成1cm左右的小段,放于小烧杯中,用直径略小于烧杯直径的玻璃瓶塞将材料全部压于杯底,其中1份作对照,另外3份做酶活性测定用。
2、反应:
先向对照管中加入1mL30%三氯乙酸,然后各管中都加入9mL0.1mol/LKNO3溶液,混匀后立即放入干燥器中,抽气1min再通入空气,再抽真空,反复几次,以排除组织间隙的气体,至叶片完全软化沉入杯底,以便底物溶液进入组织。
最后通入氮气密封后,在25℃黑暗中反应30min,再分别向测定管(对照管除外)加入1mL30%三氯乙酸终止酶反应。
3、比色测定:
将各管摇匀静置2min后,各取2mL反应液,加入1mL磺胺和1mL萘基乙烯胺,摇匀显色15min后,于4000r/min下离心5min,取上清液于540nm处测其吸光度。
根据标准曲线计算出反应液中生成的亚硝态氮总量(μg)。
同离体法。
叶绿素含量的测定
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收,利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度,即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯-比尔定律,某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和叶层厚度L成正比,即:
式中:
α为比例常数,当溶液浓度以百分浓度为单位,叶层厚度为1cm时,α为该物质的吸光系数。
各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质,则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。
这就是吸光度的加和性。
今欲测定叶绿素混合提取液中叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素的含量,只需测定该提取液在3个特定波长下的吸光度A,并根据叶绿素a,叶绿素b和类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。
在测定叶绿素a,叶绿素b时为了排除类胡萝卜素的干扰,所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a,叶绿素b的80%丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm和645nm,已知在波长663nm下,叶绿素a,叶绿素b在该溶液中的吸光系数分别为82.04和9.27,在波长645nm下分别为16.75和45.60,可根据加和性原则列出以下关系式:
(1)
(2)
式
(1)、
(2)中的A663和A645为叶绿素溶液在波长663nm和645nm时的吸光度,Ca、Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度,以mg/L为单位。
解方程组
(1)、
(2)得:
(3)
(4)
将Ca与Cb相加即得叶绿素总量CT
(5)
另外,由于叶绿素a、叶绿素b在652nm的吸收峰相交,两者有相同的吸光系数(均为34.5),也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)而求出叶绿素a、叶绿素b总量:
(6)
在有叶绿素存在的条件下,用分光光度法可同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。
Lichtenthaler等对Arnon法进行了修正,提出了80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式:
(7)
(8)
(9)
Ca与Cb分别为叶绿素a、叶绿素b的浓度;
Cx∙C为类胡萝卜素的总浓度;
A663、A646和A470分别为叶绿素色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的吸光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异,因此,在使用其他溶剂提取色素时,计算公式也有所不同。
叶绿素a、叶绿素b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm,可据此列出以下关系式:
(10)
(11)
(12)
二、材料、仪器设备及试剂
新鲜(或烘干)的植物叶片。
分光光度计、电子天平、研钵、棕色容量瓶、小漏斗、定量滤纸、吸水纸、擦镜纸、滴管。
1、95%乙醇(或80%丙酮);
2、石英砂;
3、碳酸钙粉。
(1)取新鲜叶片(或其他绿色组织)或干材料,擦净组织表面污物,用打孔器剪取叶片组或剪碎(去掉中脉),混匀。
(2)称取混匀后的新鲜样品0.2g,共三份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉以及95%乙醇2~3mL(或80%丙酮,以下同),研磨成匀浆,再加95%乙醇10mL,继续研磨至组织变白。
静置3~5min。
(3)取滤纸一张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25mL棕色容量瓶中,用少量95%乙醇冲洗研钵,研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
(4)用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直到滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25mL,摇匀。
(5)把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。
以95%乙醇为空白,在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度(如用丙酮提取,波长应调整)。
四、实验结果计算与分析
按公式10~12(如用80%丙酮,则按公式7~9)分别计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度(mg/L)。
公式10、11相加即得叶绿素总浓度。
求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量(用mg/g鲜质量或干质量表示):
C—色素含量(mg/L);
V—提取液体积(mL);
N—稀释倍数;
W—样品鲜质量或干质量(g);
1000—1L=1000mL。
五、注意事项
(1)为了避免叶绿素的光分解,操作时应在弱光条件下进行,研磨时间应尽量短些。
(2)叶绿体色素提取液不能混浊。
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