饲料添加剂I粪肠球菌质量内控标准提供伟嘉版本Word格式.docx
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3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1杂菌数
指在选择培养基上,除粪肠球菌外的其他细菌和霉菌菌落数之和。
3.2杂菌率
指杂菌数在目的菌种数和杂菌数之和中所占百分率。
4要求
4.1感官指标
表1粪肠球菌的感官要求
产品名称
项目指标
色泽
气味
杂质
外观
DBN粪肠球菌原粉
淡黄色至黄褐色粉状
具有乳酸特有的酸甜味,无腐败,无异臭味
无异物
粉末状
DBN粪肠球菌可溶原粉
溶解度大于95%,无异物
DBN粪肠球菌菌粒
乳白色至淡黄色颗粒状
颗粒状或条状
4.2理化指标
理化指标应符合表2的规定。
表2粪肠球菌理化指标
孔径
水分
≤
粪肠球菌活菌数
(×
108个/g)≥
7%
500
0.8mm
10%
4.3卫生指标
标准名称卫生指标应符合表3的要求。
表3粪肠球菌卫生指标
项目
指标
杂菌率≤
0.1%
致病菌(肠道致病菌或致病性球菌)
不得检出
总砷(以As计)(mg/kg)
≤2.0
铅(以Pb计)(mg/kg)
≤5.0
其它卫生指标
符合NY/T14442007中4.1.3的规定
4.4净含量
按国家质量监督检验检疫总局第75号令执行。
5检验方法
本标准使用的水,在未注明其他要求时,应符合GB/T6682中三级用水的要求。
本标准所使用的试剂,在未注明规格时,均为分析纯(AR)。
如有特殊要求另作明确规定。
5.1抽样
按GB/T14699.1-2005的规定,进行样品的采集。
采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具,如灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和刀。
在卫生学调查基础上,采取有代表性的样品。
样品采集后应立即进行检验。
5.2感观检验
取一定量(固态250g、液态250ml)的样品于无色玻璃杯中,采用目测、鼻嗅的方法进行检验。
5.3水分测定
按GB/T6435-2006规定方法测定。
5.4成品粒度测定
按GB/T5917.1-2008规定方法测定。
5.5粪肠球菌检测
按附录A(规范性附录)执行。
5.6卫生检测
5.6.1砷含量测定
按GB/T13079-2006规定执行。
5.6.2铅含量测定
按GB/T13080-2004规定执行。
5.6.3霉菌检测
按GB/T13092规定执行。
5.6.4细菌总数
按GB/T13093规定执行。
5.6.5致病菌检测
按GB/T13091-2001、GB/T4789.5-2008和GB/T4789.10-2003规定执行。
5.6.7杂菌率
计算公式:
5.7净含量
按JJF1070-2005规定执行。
5.8监测与仲裁判定
检测结果判定的允许误差按GB/T18823-2002规定执行。
6检验规则
6.1检验分类
产品的检验分为出厂检验和型式检验两类。
6.2组批与取样
6.2.1组批:
同品种、同一生产线、同一天内生产的同一批料为一批。
6.2.2取样:
按GB/T14699-2005方法取样,每批产品包装袋数为1-4时,每袋取样;
每批产品包装袋数为5-16袋时,最少取4袋;
每批产品包装袋数大于16袋时,最少取
袋。
每批取样量不少于0.5kg。
6.3出厂检验
感官指标、水分、粒度、微生物含量(含活菌数和杂菌率)指标为出厂检验项目,产品出厂前必须由公司质检部门检验合格并出具合格证,方可出厂。
6.4型式检验
6.4.1一般情况下,企业半年进行一次型式检验。
但有下列情况之一时,亦须进行型式检验。
a)产品成批出厂前;
b)原料、配方、生产工艺及设备有重大变化时;
c)产品停产3个月以上需要重新恢复生产时;
d)国家质量监督机构要求进行质量抽查时。
6.4.2型式检验项目:
第4章所规定的全部项目。
6.5判定规则
6.5.1在保证产品质量的前提下,生产厂可根据工艺、配方、设备、原料等变化情况,自行确定出厂检验的批量。
6.5.2检验时如产品已霉烂变质、有明显结块或有致病菌检出,卫生指标不合格,则判定该批产品为不合格产品,不得复检;
6.5.3活菌指标若低于表2规定值的80%者为不合格项,允许在原样本中加倍取样复检,以复检结果为依据。
若仍有不合格项,则判定该批产品为不合格产品。
7标签、包装、运输、贮存、保质期
7.1标签
采用鲜明的标签贴于外包装,标签内容应符合GB10648的规定要求。
7.2包装
包装为铝箔袋、纸箱包装或纸塑复合袋包装。
包装应符合运输和贮存的要求。
7.3贮运
贮运过程中防雨、防潮、防止日光暴晒。
不得与有毒有害或其它污染物品混装、混运。
7.4贮存
产品应贮存在凉爽、通风、干燥的库房内,或阴凉贮存。
不得与有毒有害或其它污染物品混贮。
7.5保质期
在符合贮存运输的条件下,自生产日期起保质期为12-15个月。
附录A
(规范性附录)
粪肠球菌检测方法
A1范围
生产分析和质量控制部门适用。
A2原理
细菌呈球状、球杆状,0.5-0.8μm,常成对或短链状排列,无芽孢,革兰氏染色阳性。
在血平板上菌落呈针尖大小、灰白色、圆形、表面光滑凸起、溶血。
在葡萄糖肉汤中呈均匀混浊生长。
革兰氏阳性,过氧化氢酶呈阴性,能在6.5%氯化钠肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤及45℃生长,能分解葡萄糖产酸不产气,发酵山梨醇,不发酵阿拉伯糖,硝酸盐还原阴性,精氨酸双水解阳性,最适生长温度36℃,最适pH4.7-7.6。
A3试验方法
A3.1仪器设备和材料
A3.1.1生物显微镜(10×
100)
A3.1.2菌落计数器
A3.1.3恒温培养箱(36±
1℃)
A3.1.4恒温干燥箱
A3.1.5恒温摇床
A3.1.6灭菌锅
A3.1.7无菌室或超净工作台
A3.1.8酸度计
A3.1.9架盘药物天平:
0-500g,精度至0.5g
A3.1.10试管:
Ф15mm×
150mmФ18mm×
180mm
A3.1.11灭菌培养皿:
直径9cm
A3.1.12三角瓶:
500ml
A3.1.13无菌吸管:
1ml(具有0.01ml刻度)5ml,10ml(具有0.1ml刻度)
A3.1.14玻璃刮刀或L型玻璃棒(涂布棒)
A3.1.15灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和剪刀
A3.1.16酒精灯
A3.1.17载玻片
A3.1.18镊子
A3.1.19接种环、接种针
A3.1.20均质器或微型振荡箱
A3.2培养基和试剂
A3.2.1除特别注明外,试验中所有试剂为分析纯试剂,水为蒸馏水或相应程度的水,溶液为水溶液。
A3.2.2BPY琼脂培养基(配置方法见附录B1)
A3.2.3血琼脂培养基(配置方法见附录B2)
A3.2.4pH9.6的肉汤培养基(配置方法见附录B3)
A3.2.5耐盐试验培养基(配置方法见附录B4)
A3.2.640%胆汁肉汤培养基(配置方法见附录B5)
A3.2.7糖类发酵培养基(配置方法见附录B6)
A3.2.8硝酸盐培养基(配置方法见附录B7)
A3.2.9索恩利氏培养基(配置方法见附录B8)
A3.2.10革兰氏染色液(配置方法见附录B9)
A3.2.11解囊液(配置方法见附录B10)
A3.2.12乳酸纸层析法(配置方法见附录B11)
A3.2.13格里斯氏试剂(配置方法见附录B12)
A3.2.14二苯胺试剂(配置方法见附录B13)
A4粪肠球菌菌落数检测
A4.1检验程序如下
检样
↓
用无菌水做成几个适当倍数稀释液
选择2-3个适当稀释度各0.1ml,加入富集培养基平皿
↓
36±
1℃培养24小时
↓
菌种鉴别检验
菌落计数
报告
A4.2操作步骤
A4.2.1采样
A4.2.1.1采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。
首先准备好灭菌容器和采样工具,如灭菌牛皮纸袋或广口瓶,金属勺和刀,采取有代表性的样品,样品采集后应尽快检验,否则应将样品放在低温干燥处。
A4.2.1.2以无菌操作称取经过充分摇匀的待检样10克移入含有90毫升解囊液(按本标准附录B10规定执行)的灭菌三角瓶内,并于振荡器中恒温振荡培养器中36℃,200rpm预处理30分钟,做成1:
10的均匀稀释液,混合均匀。
A4.2.1.3用无菌吸管吸取1:
10稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中,并于微型振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3分钟,充分摇匀制成1:
100的稀释液。
A4.2.1.4用无菌吸管吸取4.2.1.3的稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中,进行10倍梯度稀释,并于微型振荡器上混合3min。
每个稀释度换用一支1.0ml灭菌吸管,按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-8。
A4.2.2平板计数法
A4.2.2.1估计样品的含菌量,选择三个连续稀释度,分别在作10倍稀释的同时,各取0.1ml分别加到计数培养基平皿,均匀涂布,各个稀释度作3个平皿,最好同时作2种培养基,同时作无菌水空白对照。
以上操作全过程需在20min内完成。
A4.2.2.2将平板倒置于36℃恒温中培养,培养24小时后观察菌落特征。
A4.2.2.3选取具有30-300个典型菌落的平板,进行计数。
并计算同一稀释度三个平板的平均菌落数。
A4.2.2.4根据证实试验确定为粪肠球菌的菌落数,按比例计算出该皿内的粪肠球菌的菌落数,然后乘其稀释倍数再乘以10,即得每克(或ml)样品所含粪肠球菌数并作出报告。
例:
将检样10-6稀释液0.1ml涂布于选择富集培养基平板上,生成的可疑菌落数为35个,取5个进行鉴定,证实为菌粪肠球菌菌的是4个,则1g样品中菌粪肠球菌菌数为(35×
4/5)×
106×
10=1.2×
108。
A4.2.2.5计数后,将可疑菌落、目标菌落分别接种于营养琼脂斜面,与37℃培养24小时,进行粪肠球菌鉴定试验。
A5粪肠球菌的鉴定
A5.1在pH9.6的肉汤培养基上的生长试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种葡萄糖肉汤(pH9.6)液体培养基,并将未接种的空白作对照,于36℃培养18—24小时,观察生长情况,培养基有混浊物为阳性。
粪肠球菌能够在pH9.6的肉汤培养基上的生长。
A5.2耐盐试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种耐盐培养基,并将未接种的空白作对照,于35℃培养3-7天,与未接种的对照管对比,观察培养液的混浊情况,记录试验结果。
粪肠球菌能够在6.5%NaCl的培养基上生长。
A5.3耐胆盐试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种40%胆汁肉汤(pH9.6)液体培养基,置35℃培养24-48小时,观察有无细菌生长。
阳性菌呈颗粒状生长,上液澄清,管底有沉淀;
阴性菌则不生长。
粪肠球菌为阳性,可以生长。
A5.4葡萄糖产酸和产气试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,接种乳酸菌葡萄糖发酵培养基,并将未接种的空白作对照,于36℃培养2-3天,观察记录。
若产酸则培养基变黄色,并可用pH计测定pH值,用纸层析法检查是否为乳酸。
若产气则德培拉姆氏小试管中有气泡。
粪肠球菌发酵葡萄糖产乳酸不产气,pH可达4.1-4.6,发酵山梨醇,不发酵阿拉伯糖。
A5.5硝酸盐还原试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,种硝酸盐培养基,并将未接种的空白作对照,于35℃培养3天,在干净的比色瓷盘小窝中倒入少许已接种培养的培养液,再滴一滴格里斯氏试剂的A液及B液。
在对照中同样加入格里斯氏试剂的A液及B液各一滴。
观察并记录溶液是否变色,若变红色则为阳性,若无红色出现,再加入一滴二苯胺试剂,如溶液变为蓝色则为阴性,不变蓝色,则为阳性。
粪肠球菌为硝酸盐还原阴性。
A5.6精氨酸双水解酶测定试验
挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔,穿刺接种索恩利氏培养基,并用灭菌的凡士林油封管,并将未接种的空白作对照,于35℃培养3、7、14日观察,培养基转为红色者为阳性,不变者为阴性。
粪肠球菌的精氨酸双水解酶测定试验呈阳性。
A5.7结果解释及报告
符合粪肠球菌群的特征,有较强的耐盐性、耐胆碱性、能在pH9.5的培养基上很好的生长、葡萄糖发酵产酸不产气、发酵山梨醇、不发酵阿拉伯糖、硝酸盐还原阴性、精氨酸双水解酶测定试验呈阳性,则可报告为粪肠球菌。
对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验。
附录B
专用培养基和试剂
B1BPY琼脂培养基
葡萄糖5g
酵母膏5g
氯化钠5g
大豆蛋白胨10g
牛肉膏5g
碳酸钙0.7g
蒸馏水1000mL
按以上配方配制培养基,溶解后用40%的氢氧化钠溶液调pH为6.8-7.0,高温蒸汽灭菌锅121℃,20min灭菌。
B2血琼脂培养基
蛋白胨10g
葡萄糖2g
磷酸二氢钾2.5g
柠檬酸钠5g
脑浸汁800ml
猪心浸汁200ml
羊血10%
pH7.2
注:
猪心和猪脑浸汁法:
(1)新鲜猪心除去心头和脂肪,搅碎100克加蒸馏水至1000ml;
(2)新鲜猪脑除去血管,取200g加蒸馏水至1000ml;
(3)50℃保温1小时,然后煮开15min;
(4)冷却后用纱布过滤备用。
B3pH9.6的肉汤培养基
pH9.6的肉汤100ml
葡萄糖2g/L
将普通肉汤调整pH9.6,加入葡萄糖溶解后,分装试管,每管2~3ml,121℃灭菌15min,备用。
B4耐盐培养基
牛肉膏3g
氯化钠65g
蒸馏水1000ml
将上述成分溶解后,调节pH7.0,分装试管,高压灭菌121℃15min~20min,冷至45℃,备用。
B540%胆汁肉汤培养基
蛋白胨10g
氯化钠5g
牛肉浸膏5g
新鲜胆汁(猪、牛)400ml
蒸馏水600ml
先将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠加热溶于蒸馏水中,调pH至7.6,加入胆汁混匀后,分装试管,每管3ml,置115℃灭菌20min,冷藏备用。
取新鲜猪(牛)胆若干只,取胆汁用纱布过滤,装于瓶中115℃灭菌20min,冷却后置4℃冰箱内,次日取出吸取上清液备用。
B6糖类发酵培养基
B6.1基础培养基
蛋白胨1%
酵母膏0.5%
吐温800.1%(v/v)
盐溶液A0.5%(v/v)
盐溶液B0.5%(v/v)
溴甲酚紫(1.6%水溶液)约1.4ml
盐溶液A:
KH2PO410g
K2HPO410g
蒸馏水100ml
盐溶液B:
MgSO4·
7H2O11.5g
MnSO4·
2H2O2.4g
FeSO4·
7H2O0.68g
B6.2以上成分溶解后调pH到6.8-7.2,分装试管。
121℃高压灭菌20-30min。
B6.3葡萄糖、阿拉伯糖、山梨醇各10g
B6.4将山梨醇和阿拉伯糖配制成10%的水溶液,经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。
B7硝酸盐培养基
牛肉蛋白胨培养基1000ml
KNO31g
培养基配制好后,调节pH7.0-7.6,分装试管,每管4-5ml,121℃蒸汽灭菌15-20min,冷至45℃,备用。
B8索恩利氏培养基
蛋白胨1g
NaCl5g
K2HPO40.3g
洋菜6g
酚红0.01g
L-精氨酸盐10g
将以上成分加热溶解,调节pH7.0-7.2,分装试管,每管4-5ml,121℃蒸汽灭菌15-20min,冷至45℃,备用。
B9革兰氏染色法
B9.1结晶紫染色液
结晶紫1g
95%乙醇20ml
1%草酸铵水溶液80ml
将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
B9.2革兰氏碘液
碘1.0g
碘化钾2.0g
蒸馏水300.0ml
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振荡,待完全溶解后,再加蒸馏水至300ml.
B9.3沙黄复染液
沙黄0.25g
95%乙醇10.0ml
蒸馏水90.0ml
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
B9.4染色
B9.4.1将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
B9.4.2滴加革兰氏碘液,作用1min水洗。
B9.4.3滴加95%乙醇脱色约15-30s,或将乙醇滴满整个涂片,立即倒去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10min.
B9.4.4水洗,滴加复染液,复染1min,水洗、待干、镜检。
B9.4.5结果
革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
B10解囊液
柠檬酸9.6g,磷酸氢二钠14.2g加蒸馏水至1000ml,调节pH至7.5,分装,121℃,15min灭菌,备用。
B11乳酸纸层析法
B11.1展开剂:
水、乙醇、正丁醇以1:
5:
5的量相混合,然后加1%的甲酸。
B11.2显色剂:
0.04%的溴酚蓝酒精溶液,用0.1%的NaOH调pH到6.7。
B11.31mol/L乳酸标准溶液:
吸取分析纯乳酸8.4ml,移入100ml容量瓶中,加蒸馏水至刻度,备用。
B11.40.1mol/L乳酸标准使用液:
将1mol/L乳酸标准溶液稀释至0.01mol/L。
B11.5点样
选择大小合适的国产新华滤纸,在滤纸下方距边约3cm处划条横线,每隔2.5-3cm划一点作为点样位置,并表明点样编号。
用干净的毛细管沾取样品点样,每点一次样品用吹风机吹干,0.01mol/L乳酸标准使用液为对照。
B11.6层析
将点好样的滤纸放入层析缸,先用展开剂饱和一夜,然后加展开剂开始层析。
上行25cm左右取出晾干,喷显色剂,并与对照比较黄色斑点的位置,确定是否是乳酸。
B12格里斯氏试剂
A液:
将对氨基苯磺酸0.8g,溶解于2.5mol/L乙酸溶液100ml;
B液:
将甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100ml中。
B13二苯胺试剂
将二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中,用20ml蒸馏水稀释。
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