HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量文档格式.docx
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Thismethodissimpleandaccurate,andcanbeusedforquantitativeanalysisofPSBinwater.
Keywords:
CoQ
;
biomass;
sewagereclamation
收稿日期:
2010-09-26.
基金项目:
国家自然科学基金重点项目(50978072).
作者简介:
赵微(1982—),女,博士研究生;
张光明(1973—),女,教授,博士生导师.
光合细菌(Photosyntheticbacteria,PSB)是一类
以光作为能源、能在光照厌氧或黑暗好氧条件下利
用有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合
作用的微生物.PSB能有效处理高浓度有机废水
[1]
,
对淀粉、豆制品加工
[2]
、啤酒厂
[3]
、油脂工业等工业
废水及生活污水,处理效果好,对COD的去除率达
到60%~95%,且PSB菌体本身含有丰富的营养物
质和生理活性物质
[4]
,能够作为肥料、饲料、饵料
[5]
回收利用,在处理废水的同时可实现污水资源化.然
而,由于废水中各种干扰物质的存在,使得废水中PSB菌体产量的准确测量存在问题.
在纯培养条件下PSB的定量检测方法包括显
微镜直接计数法、平板计数法、紫外分光光度法与
可见分光光度法、HPLC法等.显微镜直接计数法
随机性大,不能宏观、全面地反应菌体数量,在废水
处理中一般不采用该方法.平板计数法计数周期
长、方法复杂,在废水处理中一般也不采用该方法.
紫外分光光度法与可见分光光度法受废水中杂质
影响较大,尤其是受色度的影响,因此这2种方法
不适合检测带有浊度或色度的废水.HPLC法虽然
方法简便易行、精确、不受废水中杂质影响,但不能
将PSB作为直接检测物来分析.吴祖芳等的研
究
[6]
表明,PSB中含有一种特征物质CoQ
[7]
(CoQ
又称泛醌,化学名称为2,3-二甲氧基-5-
甲基-6-癸异戊烯基-1,4-苯醌).其在PSB中
含量较高且相对稳定,可以用它的含量来定量表征
PSB的菌体产量.目前CoQ
的检测方法包括紫外
分光光度法、可见分光光度法、HPLC法等.同样由
于废水中杂质的干扰,导致不能使用分光光度法分
析CoQ
的质量.可选的检测方法只有HPLC法,目
前测定废水中PSB内CoQ
质量的HPLC方法,国
内外未见报道.因此本文研究采用HPLC法分析
CoQ
的含量以表征废水中PSB的菌体含量,排除
各种干扰因素,拟建立定量分析废水中PSB菌体
产量的方法,以期为PSB在废水中的检验与定量
分析提供科学依据.
1试验
1.1材料
试验所采用的光合细菌为球形红假单胞菌
(Rp.sphaeroids),购于中科院微生物研究所.试
验采用活性污泥模拟废水中各杂菌,污泥取至处
理生活污水A/O工艺的二沉池.试验废水采用浊
度较大,有机物质含量较多的人工配水来模拟大
豆废水.试验仪器与药品:
冰箱(BCD-216ST,
Haier);
超声波清洗器(HS3120,BENCHTOP-
CLEANERS);
高效液相色谱(Agilent1200,Agi-
lentTechnologies,Inc.).CoQ
标准品(Sigma公
司生产);
甲醇、无水乙醇、乙腈、丙酮均为色
谱纯.
1.2方法
标准样品的制备:
取CoQ
标准样品
30mg,加入无水乙醇40mL,在50℃水浴中震荡
溶解.放冷后,转移至100mL容量瓶中,用无水乙
醇稀释至刻度摇匀,作为标准品母液,将母液分别
稀释为3.0、2.5、2.0、1.5、1.0mg/L.所有样品均
经0.45μm膜过滤待用.
纯培养基中CoQ
的提取方法:
取2.5mL发
酵液在11000r/min的条件下离心10min,分离
上清和菌体.菌体用去离子水洗至中性,得到菌体
细胞待用.CoQ
的提取采用冻融辅助超声法
[8]
将菌体细胞放入冰箱冷冻区冷冻24h后提取溶
剂.样品均经0.45μm膜过滤后取上清液进行
HPLC分析.杂质中CoQ
的提取方法为:
分别取
7200mg/L的大豆废水、160mg/L的PSB、
7200mg/L的大豆废水加160mg/L的PSB,
的提取方法同上.杂菌中CoQ
取2.5mL质量浓度为10000mg/L的活性污泥,
在11000r/min的条件下离心10min,分离上清和
菌体.菌体用去离子水洗至中性,得到菌体细胞,
的提取方法同上.不同培养条件CoQ
的提
取方法:
将PSB在纯培养基中纯培养7d,光照-
溶解氧条件分别为光照-厌氧、黑暗-好氧、自然
光-微好氧.分别取不同培养条件的发酵液
2.5mL,CoQ
的提取方法同上.不同生长时期
将PSB在纯培养基中培养,光
照-溶解氧条件为自然光-微好氧.分别在第
24、48、72、96h取发酵液2.5mL,CoQ
的提取方
法同上.安静等研究
[9]
表明PSB生长前36h为延
滞期,36~72h为生长期,从72h开始进入稳定
期,96h以后细胞进入衰亡期.加样回收率试验
方法:
采用外标加样回收法,取已知含量的CoQ
样品5份,精密称定,分别置具塞的锥形瓶中,加
同量的废水(7200mg/L)、PSB(160mg/L),
的提取方法同上.
2结果与讨论
2.1色谱条件
流动相的选择:
选用的色谱柱为Sphherisorb
C18(10cm×
4.6mmID)柱,柱温35℃,紫外检
测波长275nm,进样量15μL.流动相分别为甲醇
和水、甲醇和乙腈、无水乙醇和水、甲醇和无水乙
醇.当流动相为甲醇和水时,检测不到CoQ
标准
品.当流动相为甲醇和乙腈时,两者任意比例关系
下,色谱峰或者不出峰,或者峰型不对称.当流动
相为无水乙醇和水时,由于无水乙醇粘度大,
标准品的保留时间长,柱压特别高.当流动
相为甲醇和无水乙醇时,色谱峰峰型对称出峰较
好,因此对甲醇与无水乙醇的比例进行深入研究.
分别配制甲醇与无水乙醇的体积比为1∶1、3∶2、
4∶1、9∶1进行实验,随着流动相甲醇比例的增加
标准品的保留时间缩短,当甲醇和无水乙醇
·
54·
哈尔滨工业大学学报第43卷比例为3∶2时,在28.773min出峰,当两者比例
为4∶1时,在23.257min处出峰,当两者比例为
9∶1时,在21.183min处出峰.综合比较后发现,
不同比例甲醇与无水乙醇为流动相时峰型都很
好,出峰时间选择甲醇与无水乙醇的比例为9∶1.
流速的选择:
当流速为0.6mL/min时,CoQ
标准品的保留时间超过35min,保留时间过长.当
流速为1.5mL/min时,柱压过高.当流速为
1mL/min时,CoQ
标准品的保留时间
21.183min,柱压16.4MPa.综合比较,选择流速
为1mL/min.
综合上述结果,本文提出的色谱条件:
色谱
柱为SphherisorbC18(10cm×
甲
醇与无水乙醇(体积比9∶1)为流动相;
流速为
1mL/min;
柱温为35℃;
紫外检测波长为
275nm;
进样量为15μL;
柱压为16.4MPa.在此
条件下,色谱出峰快、峰型良好.采用如上确立的
HPLC检测方法,获得CoQ
标准品谱图与标准曲
线分别见图1与图2,由图可见,CoQ
标准品的保
留时间为21.183min,CoQ
标准品密度与峰面积
具有良好的相关性.
0.02
0.01
-0.01
7.515.022.530.0
t/min
U
/
V
图1CoQ
标准品HPLC色谱图
2.2提取溶剂的选择
由于CoQ
为细胞内物质,其提取效果的好
y=623.32x-37.487
R
2
=0.9848
2000
1500
1000
500
0.71.42.12.83.5
籽(C
O
Q
)/(10
-3
g·
-1
)
峰
面
积
(
s
图2CoQ
标准曲线
坏直接关系到产品的收率,许芳等研究表明采用
乙醇与丙酮对PSB中CoQ
提取效果较好.本文
对菌体细胞分别采用:
1)无水乙醇提取5h;
2)丙
酮提取5h;
3)丙酮提取5h后,挥发去除全部丙
酮,用无水乙醇溶解.不同提取溶剂对CoQ
提取
率的影响见图3,可见,先用丙酮提取5h后,挥发
掉全部丙酮,再用无水乙醇溶解,这一提取方法相
对提取率最高.
120
90
60
30
乙醇丙酮先乙醇后丙酮
相
对
提
取
率
%
图3不同溶剂对CoQ
提取率的影响
2.3外标加样回收率及检测限实验
采用上述确立的检测方法及提取方法,并进
行外标加样实验,加样回收率见表1.平均回收率
为99.13%,相对标准偏差为0.81%(n=5).实
验表明,上述方法精密度高,重复性好,可用于
的提取与检测.
表1加样回收率(n=5)
样品中CoQ
质量/mg对照品中加入CoQ
质量/mgCoQ
总质量/mg回收率
/%
6.403.209.6099.17
6.406.4012.8099.23
6.409.6016.0099.01
6.4012.8019.2099.21
6.4016.0022.4099.04
表2样品中CoQ
质量检测限试验可见,当
质量浓度低于9.6mg/L时,检测结果出现
很大的偏差,当CoQ
质量浓度高于22.4mg/L时,
由于质量浓度过高也出现很大的偏差,可重复性
差,因此对CoQ
质量浓度的检测限为9.6~
22.4mg/L.当CoQ
质量浓度低于3.2mg/L时,
应先浓缩再进行检测,当CoQ
质量浓度高于
22.4mg/L时,应先稀释再进行检测.
55·
第12期赵微,等:
HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量2.4不同培养条件与培养时期对PSB内CoQ
质量的影响
PSB内CoQ
的含量是否稳定将直接关系到
检测方法的可行性.PSB培养条件光照-溶解氧
组合的不同可能导致PSB代谢类型不同,不同代
谢类型的PSB内CoQ
的质量可能不同
[10]
.同一
种微生物在不同的生长时期,由于细胞代谢活力、
对不良条件的抵御能力、菌体体积的不同可能引
起CoQ
含量不同.不同培养条件及培养时期PSB
内CoQ
质量的研究见图4和图5.
表2检测限试验
质量浓度/(mg·
)回收率/%
3.2070.15±
2.89
9.6099.17±
0.92
22.4099.04±
0.84
25.6080.01±
2.37
45
15
黑暗-好氧光照-厌氧自然光-微好氧
m
C
o
1
g
图4不同培养条件每克烘干后PSB内CoQ
的质量
由图4可见,黑暗-好氧、光照-厌氧、自然
光-微好氧条件下,每克烘干后PSB内CoQ
的质
量分别为(41.2±
1.7)、(41.6±
1.3)、(41.3±
2.3)mg,不同培养条件下每克烘干后的PSB内
的质量稳定.
44
33
22
11
迟缓期稳定期
对数期衰亡期
图5不同培养时期每克烘干后PSB内CoQ
由图5可见,在不同培养时期迟缓期、稳定期、
对数期、衰亡期每克烘干后PSB内CoQ
的质量分
别为(39.8±
1.4)、(41.4±
2.0)、(40.3±
1.8)、
(40.1±
1.9)mg.不同培养时期每克烘干后PSB内
2.5废水中干扰因素对PSB内CoQ
废水中的糖类、蛋白质、脂类等杂质的存在可
能干扰CoQ
的检测.处理污水过程中不可避免地
会感染杂菌,杂菌的菌群中可能含有PSB,因此杂
菌的存在也可能干扰CoQ
的检测.废水中干扰因
素的研究见图6和图7.
发酵液大豆废水发酵液+大豆废水
图6发酵液、大豆废水、发酵液+大豆废水中每克烘干后
由图6可见,发酵液、大豆废水、发酵液+大
豆废水中每克烘干后PSB内CoQ
的质量分别为
(41.5±
1.5)、0、(40.3±
1.9)mg.废水本身不含
有PSB,废水中杂质的存在不干扰CoQ
的检测.
发酵液杂菌发酵液+杂菌
图7发酵液、杂菌、发酵液+杂菌中每克烘干后PSB内
由图7可见,发酵液、杂菌、发酵液+杂菌中
每克烘干后PSB内CoQ
的质量分别为(41.5±
2.1)、(61.2±
0.01)、(41.0±
1.7)mg.杂菌中
的含量十分的少,与废水中PSB内CoQ
的
质量不在同一数量级上,因此杂菌的存在不干扰
由图4~7可见,不同培养条件及培养时期的
质量分数非常稳定,废水中的杂质以
及杂菌等干扰因素均不影响CoQ
的检测.表明本
方法可用于水及废水中CoQ
质量的检测,从而可
用于分析水及废水中PSB的产量.
2.6PSB菌体产量的换算
由图1可知,CoQ
质量浓度与峰面积关系为
Y=623.32X-37.487.
56·
哈尔滨工业大学学报第43卷其中:
X为CoQ
的质量浓度,g/L;
Y为峰面积,
V·
s;
R
=0.9848).
质量分数为
w(CoQ
)=
ρ(CoQ
ρ(PSB)
×
100%.
由图4和图5可知,CoQ
质量分数为
4.08%.
由式
(1)、
(2)可得,峰面积与PSB质量浓度
的关系为
ρ(PSB)=
Y+37.487
25.431
.
3结论
1)利用HPLC法分析水与废水中CoQ
量来定量表征PSB的产量,建立了一个定量表征
水及废水中PSB含量的方法.提出色谱条件为:
色谱柱为SphherisorbC18(10cm×
4.6mmID)
柱;
柱温35℃;
进样
量15μL;
柱压16.4MPa.
2)先用丙酮提取5h后挥掉全部丙酮再用无
水乙醇溶解这一提取方法对CoQ
的相对提取率
最高.平均回收率为99.13%,相对标准偏差为
0.81%(n=5).不同培养条件及培养时期PSB内
的含量十分稳定.废水中杂质、杂菌等干扰
因素均不影响检测结果.
3)PSB质量浓度为(Y+37.487)/25.431g/L,
其中Y为峰面积,V·
s,可用上述方法定量分析水
中PSB的菌体产量.
参考文献:
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ChineseJournalofEnviromentalScience,1995,1
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12-19.
[3]戴晓,张光明.光合细菌(Z08)啤酒废水资源化研究
[J].哈尔滨工业大学学报,2010,42(6):
937-940.
[4]F
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- 关 键 词:
- HPLC 法定 分析 水中 光合 细菌 菌体 产量