细胞凋亡的几种检测方法样本Word文档格式.docx
- 文档编号:18386157
- 上传时间:2022-12-15
- 格式:DOCX
- 页数:6
- 大小:22.04KB
细胞凋亡的几种检测方法样本Word文档格式.docx
《细胞凋亡的几种检测方法样本Word文档格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《细胞凋亡的几种检测方法样本Word文档格式.docx(6页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
坏死细胞DNA电泳类似血抹片时持续性条带
3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定
凋亡细胞DNA断裂使细胞质内浮现核小体。
核小体由组蛋白及其随着DNA片断构成,可由ELISA法检测。
检测环节
1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中具有核小体;
2、在微定量板上吸附组蛋白体’
3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上组蛋白结合‘
4、加辣过氧化物酶标记抗DNA抗体使之与核小体上DNA结合’
4、加酶底物,测光吸取制。
用途
该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。
可用于人、大鼠、小鼠凋亡检测。
该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精准测定凋亡细胞发生绝多对量。
3、
流式细胞仪定量分析
细胞发生凋亡时,其细胞膜通透性也增长,但是其限度介于正常细胞与坏死细胞之间。
运用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,运用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区别正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。
应用价值
流式细胞仪检测具备如下特点:
1)、检测细胞数量大,因而其反映群体细胞凋亡状态比较精确
2)、可以做许多有关性分析
3)、结合被检测细胞DNA含量分析,可拟定凋亡细胞所处细胞周期
(1)检测形态学及细胞膜完整性Hoechs-PI双染色法
细胞发生凋亡时,其细胞膜通透性液增长,但其限度介于正常细胞和坏死细胞之间,运用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,运用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区别正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。
运用Hoechs-PI染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞重要摄取Hoecha染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞重要摄取碘化丙啶(PI)而呈强红色荧光。
(2)DNA片断原位标记法
凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)构造保持不变状况下,用荧光素、地高辛或生物素标记脱氧尿三磷酸(DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反映与凋亡细胞裂解后3•羟基(-OH)端结合,经显色反映后检测DNA裂解点技术。
DNA片段原位标记法有二种:
1、原位缺口转移(insitunick-translation,ISNT)技术,它是运用DNA多聚酶I将标记核苷酸连接到断裂DNA3•-OH端
2、原位缺口末端标记技术(insituendlabellingtechnique,ISEL),即TUNEL法,它是运用TdT将标记DUPT接到3•-OH端。
研究证明,TUNEL法敏感性远高于ISNT,特别对初期凋亡检测,TUNEL更为适当。
(3)检测细胞膜成分变化AnnexinV联合PI法
原理:
在细胞凋亡初期位于细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。
磷脂结合蛋白V(AnnexinV)是一种钙依赖性磷脂结合蛋白,它于PS具备高度结合力。
因而,AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测磷脂酰丝氨酸。
故运用对PS有高度亲和力AnnexinV,将AnnexinV标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC),同步结合使用PI拒染法(因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测,且对PI高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。
成果判断:
正常活细胞AnnexinV、PI均低染;
凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染;
坏死细胞AnnexinV/PI均高染。
应用价值:
细胞发生凋亡时,膜上PS外露早于DNA断裂发生,因而Annexin
V联合PI染色法检测初期细胞凋亡较TUNEL法更为敏捷。
又Annexin
V联合PI染色不需固定细胞,可避免PI染色因固定导致细胞碎片过多及TUNEL法因固定浮现DNA片段丢失。
因而,Annexin
V联合PI法更加省时,成果更为可靠,是当前最为抱负检测细胞凋亡办法。
办法及环节
A.
直接标记抗体(FITC标记抗体):
(1)
收集1×
106个细胞,800rpm离心5min,4℃以上冷PBS洗一次。
(2)
用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟,800rpm离心5min去上清。
加2mlPBS重悬洗涤细胞,800rpm离心5min。
(3)
用1ml含5%人血清PBS重悬细胞,冰上孵育10min,800rpm离心5min去上清。
加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量荧光标记抗体(5×
105个细胞/20ul抗体)PBS,避光冰上放置30min,离心弃上清。
加入200ul1%多聚甲醛固定,待测即可。
(4)
用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。
B.未标记抗体间接免疫荧光标记法:
(1)收集2×
106个细胞,用冷PBS2ml洗涤细胞一次,800rpm离心5min。
(2)用2ml4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min;
2mlPBS重悬细胞,800rpm离心5min;
(3)用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清PBS重悬细胞,冰上放置10min,800rpm离心5min。
(4)加入饱和剂量未标记抗体,冰上放置40min,800rpm离心5min,用2ml冷PBS重悬细胞,800rpm离心5min,洗去未结合一抗,重复一次。
(5)加入荧光标记(FITC)标记二抗,冰上避光放置40min后,800rpm离心5min,去上清,PBS洗涤两次。
(6)加入0.5ml1%多聚甲醛重悬细胞;
固定待测。
(7)流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。
C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品(PI染色)制备:
(1)待测样本制成单细胞悬液,然后200g离心5分钟,弃上清。
(2)用4℃预冷70%冷乙醇固定,4℃保存,至少固定18小时。
(3)调节细胞浓度为106细胞/毫升,取1毫升细胞悬液,用PBS洗三次,细胞重悬于1毫升PI染液中,37℃孵育30分钟即可进行流式分析。
(4)PI染液终浓度为50微克/毫升,RNaseA终浓度为20微克/毫升。
培养细胞染色体显示法
传代培养细胞染色体显示法
培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗解决—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片
1.培养细胞:
取处在指数生长期、用较大瓶皿培养、80%~90%汇合单层培养细胞。
2.加秋水仙素:
使用最后浓度为0.02~0.8微克/毫升营养液,温箱继续培养6~10小时;
或用低温封闭法:
把培养细胞置于4℃条件下6~12小时后,再于37℃温箱继续培养6~10小时解决(加秋水仙素)。
3.采集分裂细胞:
可运用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点,此时手持培养瓶,左右重复横向水平摇动,令培养液在培养细胞表面重复冲刷。
应用此法可使90%中期分裂细胞从瓶壁脱落,注意勿用力过猛,以防多量非分裂细胞脱落影响观测。
4.离心:
收集培养液,1000转/分钟离心5~10分钟。
5.低渗解决:
吸除上清液、加入预温至37℃0.075MKCl溶液,在温箱中静置20~30分钟。
6.预固定:
向悬液中加新鲜1:
3醋酸、甲醇固定液1ml,用吸管吹打调匀,此办法能起到先使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成块。
7.固定:
离心,同4,吸除上清液,加新鲜固定剂5~10ml;
加固定剂时要用一手微斜持离心管,另手用吸管吸取固定剂,把固定剂逐滴滴在离心管壁上,使之慢慢流入离心管中,然后轻轻吹打均匀,置15~20分钟。
8.重复7,末次离心后,小心吸除大某些上清,据悬液中细胞密度大小,余下固定液0.5~1ml。
9.制片:
用滴片法制片,按如下环节:
彻底洗净载物片,勿留任何油脂,置冰箱中储备备用。
滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片,在载物片表面浮现细微水气时,及时向片一侧滴2~3滴细胞悬液,滴片时距离能保持半米高度才好。
滴片后置室温中令其自然干燥,或用吹风机热风吹干亦可。
如此制备好标本可置盒中备用或及时进行染色观测。
10.染色和封片:
普通惯用Giemsa染色:
取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合,染色10分钟后,水洗、晾干、可直接观测。
如标本需要保存或做长时间观测,可过二甲苯两次后,用中性树胶封片后,再过二甲苯,然后封片亦可。
(2)人末梢血微量全血培养染色体显示法 1.培养液准备:
取15ml培养瓶数个,每瓶内分别充入5ml培养液(pH7.2),内含:
1640培养液(含10%~15%小牛血清),PHA0.1ml,青霉素100单位和链霉素100微克/毫升培养液 2.抽血针管准备:
取2~5ml针管一支,在消毒后无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器,无菌抽肝素(100U/mlBBS)少量湿润针管,如动作迅速不用肝素亦可。
3.采血:
用棉签75%酒精给患者或献血者皮肤消毒两次,缚止血带,静脉取血1~2ml。
无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4~0.5ml,如系外出采血,安装针管及分装血液两环节亦可在无菌条件略差环境内操作,但动作要迅速,以减少污染;
在采血量不多或不应抽血状况下,亦可在耳垂、手指肚(无名指)用刺血针采血。
4.培养和加秋水仙素:
37℃温箱中培养到60~72小时之间,此时细胞分裂相最多,向每培养瓶内加秋水仙素,最后浓度0.02~0.08微克/毫升营养液,再培养4~6小时。
5.低渗:
1000转/分钟离心10分钟,吸除上清液,加入预温过0.075MKCl溶液10ml,置温箱中低渗解决15~20分钟。
6.别的环节与解决传代细胞法相似。
(3)羊水细胞培养 1.抽取羊水:
无菌抽取羊水10-20ml,及时注入无菌离心管 2.离心分离:
1000转/分离心10分钟,弃去上清,留0.5ml. 3.培养:
加培养液4ml(含小牛血清1ml),用NaHCO3调PH至6.8,置37度培养,在温箱培养7-10天,可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长;
加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液,作用10-12小时。
4.别的环节与传代细胞染色体制备办法相似。
普通染色体制片程序 1、
取对数生长期细胞一种T75或T25瓶。
2、
将培养基换成10mlDMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素培养基,解决1~2小时。
3、
将细胞培养液倒掉,立即加入3~4ml0.1%胰蛋白酶,并及时摇晃0.5~1min。
当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后,立即加入终结液终结消化,并将分裂相细胞收集在一种15ml离心管中,并在1200r/min离心4min。
4、
将上清液倒掉,剩余50ul左右液在管中,并轻微震动,使细胞沉淀重新悬浮。
5、
加入10ml低渗液(0.075MKCL),第一毫升要逐滴加入,并边加边摇晃。
6、
37℃水浴中低渗30min。
7、
再加入1ml冰冷固定液(甲醇:
乙酸=3:
1混合液),并立即摇匀,离心,1000r/min、10min。
8、
同环节4。
9、
加入10ml冰冷固定液,第一毫升要逐滴加入,边加边摇晃。
10、
室温下固定30min,然后离心,1000r/min、10min。
11、
12、
13、
室温下固定15min,然后离心,1000r/min、10min。
14、
重复环节11~13一次。
15、
将离心后上清液倒掉,并加入50~100ul新鲜固定液重悬细胞。
16、
滴片(玻片规定是湿冷干净,滴片高度要不不大于30cm。
玻片倾斜角度15~30度左右) 17、
镜检。
(六)细胞冷冻保存与复苏(慢冻速溶) •
当细胞冷到零度如下,可以产生如下变化:
细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。
•
如果缓慢冷冻,可使细胞逐渐脱水,细胞内不致产生大冰晶;
相反.结晶就大,大结晶会导致细胞膜、细胞器损伤和破裂。
复苏过程应快融,目是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶重结晶。
在细胞冻存时加入保护剂,能大大提高冻存效果。
惯用低温保护剂是DMSO,它是一种渗入性保护剂,可迅速透入细胞,提高胞膜对水通透性,减少冰点,延缓冻结过程,能使细胞内水分在冻结前透出细胞外,在胞外形成冰晶,减少胞内冰晶,从而减少冰晶对细胞损伤。
细胞冻存办法
(1)、冷冻前一日提前更换半量或全量培养基,观测细胞生长情形。
(2)、配制冷冻保存溶液(使用前配制):
将DMSO加入新鲜培养基中,最后浓度为5-10%,混合
均匀,置于室温下待用。
(预先配制冻存液:
含20%血清培养基,10%DMSO加基本培养基) (3)、按常规办法消化处在对数生长期细胞培养物,制备单细胞悬液,并计算细胞总数;
(4)、将细胞悬液以800~1000r/min离心5min,去上清夜;
(5)、向细胞沉淀物中加入冷冻保护液,轻轻吹打混匀,使细胞密度达1×
106~1×
107个/ml;
(6)、按每管1~1.5ml量分装于冻存管内,拧紧管盖;
(7)、再冻存管上做好标记,涉及细胞代号及冻存日期。
冷冻保存办法1:
冷冻管置于4oC40分钟→-20oC30分钟→-80oC16~18小时(或隔夜)→液氮槽vaporphase长期储存。
注意点:
(1)
细胞在-20度冰箱不能超过1h,以免冰晶过大破坏细胞,可跳过-20直接到-80,这样细胞活率低点。
(2)
DMSO稀释时会放出大量热,不可直接加到细胞液中要提前配制。
(3)
DMSO必要时细胞培养级别,新买自身是无菌,第一次开瓶后及时少量分装于无菌瓶中,4度保存,避免重复冻容产生有毒物质。
细胞复苏(要点动作要快,轻)
(1)、调配370C~400C温水,或将恒温水浴箱温度调节至370C~400C;
(2)、从液氮中取出冻存管,及时投入370C~400C温水中迅速晃动,直至冻存液完全溶解;
(3)、将细胞冻存悬液转移到离心管内,加入约5ml培养液,轻轻吹打混匀;
(4)、将细胞悬液经800~1000r/min离心5min,弃上清夜;
(5)、向细胞沉淀内加入完全培养液,轻轻吹打混匀,将细胞悬液转移到培养瓶内,补足培养液进行培养。
(1)注意安全,以防冷冻管爆炸,带手套用镊子将冷冻管取出,不可用手。
(2)解冻时,液面不可超过冻存管面,以防污染。
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 细胞 检测 方法 样本