奶牛瘤胃中非离子型表面活性剂对发酵特性微生物生长酶活性以及消化能力的影响教材Word格式文档下载.docx

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甲烷抑制剂；

蛋白质水解、抗生素和脱氨基抑制剂；

除虫药剂；

微生物酶；

脂肪酸和脂质饲料；

缓冲药剂和人造唾液；

通过离子载体提高丙酸盐类；

益生素和非细菌性直接饲喂的微生物（DFM），包括酵母菌培养物和霉菌发酵提取物。

人们已知非离子型表面活性剂（NIS）具有高效刺激多种需氧微生物释放酶的能力（Deshpandeetal.,1987;

Hungetal.,1988;

Yazdietal.,1990;

LongandKnapp,1991）。

这次试验提供了利用NIS作为饲料添加剂的可能性，因此可以减少抗生素和离子载体的使用。

在之前的试验中，我们得出了这种特殊的饲料添加剂具有促进瘤胃内微生物群落的生长，并可提高多糖水解酶的活性的结论。

在1L厌氧微生物生长介质中，NIS的浓度为0.5g，这种物质增加了瘤胃内细菌和真菌的增长速率，也增加了谷物和稻草的消化率以及多糖水解酶的活性（未公开资料）。

接下来，将说明NIS作为反刍动物饲料添加剂的潜在可能性。

2.材料和方法

2.1动物以及实验设计

12只平均体重在450±

37kg的韩国本地奶牛（Hanwoo），分别在瘤胃部设有可外取式的装置，用来评价NIS在瘤胃中添加对消化特征、微生物生长率和酶活性的影响。

12只牛被随机地分配成两组，每组6只，分别作为控制组和NIS处理组。

控制对照组的动物用瘤胃上的套管加入100ml蒸馏水。

NIS处理组的动物则用同样的方法每天注入200mlNIS溶液。

试验时间持续10天，其中5天进行原位实验，5天对瘤胃中的液体进行收集，在实验时间开始之前，所有动物用各自的处理方法处理15天。

2.2进食规律及饲料

每个动物每天喂食2次（0900和1700），将饲料和稻草以6:

4的配比（按照饲喂的营养基础；

表1），每天按照20g饲料/kg体重进行饲喂，这些动物被饲养在一边开放式的混凝土牛棚里。

提供给它们一个矿物质含量丰富的盐块和添加了镥元素的水。

分别用AOAC（1990）中描述的官方方法930.01、976.05、920.39和927.02来测量饲料中的含水量、粗蛋白含量、醚提取物含量和粗灰分含量。

中性和酸性的去污纤维（NDF和ADF）的含量用VanSoest等人（1991）的方法进行测量，没有使用亚硫酸钠和淀粉酶。

饲料中的钙和磷元素用原子吸收分光光度计来检测（Shimadzu，AA6145F，日本）

表格1

饲料中的化学组分和含量

项目

混合饲料

稻草

混合组分含量（g/kg，作为饲料的基础成分）

玉米

588

小麦碎渣

50

麦麸

150

木薯

80

棉籽粉

40

菜籽粉

甘蔗废糖蜜

瘤胃脂肪

9

石灰

12

盐

10

维生素和矿物质混合物

29

总计

100

干物质（g/kg）

880.8

干物质的化学成分（g/kgDM）

粗蛋白

127.2

51.2

醚提取物

32.9

25.0

粗灰分

59.0

171.6

TDNa

816.3

426.3

NDFb

281.6

827.6

ADFc

81.7

575.2

钙

10.2

3.4

磷

1.1

a总可消化的营养成分的计算参考韩国饲料含量标准（国家家畜研究机构，1988）

b中性去污纤维

c酸性去污纤维

2.3NIS和NIS溶液的准备

NIS的构成，由非离子型表面活性剂SOLFA-850，主要物质是水山梨糖醇三油酸酯{酸度最大14；

皂化度，172-186；

HLB（亲水-疏水平衡），1.8；

外观，暗黄色液体}，由CO.Ltd/公司提供。

非离子型表面活性剂溶液由NIS、苹果酸和高度离子化水配制而成（混合比率和准备方法正在申请专利）。

2.4瘤胃内物质的采样和分析

瘤胃中的物质通过瘤胃上的套管取样，在上午喂食以后的0、3、6、9小时进行原位实验。

样品用一分钟的时间混合，然后迅速用没有CO2气体的氧气，通过四层粗孔纱布进行抽滤，并进行pH的测量。

过滤后的瘤胃液体被用来分析氨氮、挥发性脂肪酸（VFA），并且确定酶活性和微生物数量。

氨氮浓度的测量方法参照Chaney和Marbeck（1962）的方法。

VFA浓度根据Erwin等人（1961）用气液色谱法（Packard，439-GLC）进行测量。

在瘤胃液体中的微生物细胞增长情况用分光光度计在吸光度650nm下进行分析，之后去除其中的杂质，将细胞用100mM的磷酸钠缓冲剂（pH6.5）洗涤3次。

纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶的活性用DNS（二硝基水杨酸）的方法进行化验。

1.5毫升粗酶溶液的上清液和0.5ml/10g的羟甲基化纤维素（CMC）相混合，溶于0.05mol/L的柠檬酸缓冲液中（pH5.5）。

反应在55摄氏度下静置进行一个小时，最后5分钟在沸腾状态下反应。

煮沸后的样品在7000转下离心5min，上清液中减少糖量，用Miller（1959）的DNS比色法进行检验。

一个单位的酶活性被定义为该单体的酶每分钟所减少的糖量所产生和1mmol葡萄糖对等的单糖的量。

对于木聚糖酶和淀粉酶的活性研究则通过取20g/ml燕麦分别分解为木聚糖（w/v）和淀粉（w/v）并溶于0.5M/L磷酸钾缓冲液（pH6.5）中。

减少的糖量按照上述的方法进行分析。

总水解蛋白酶的活性通过98摄氏度下含氮酪蛋白的水解量进行测量。

反应混合溶液包含900μl的底物溶液（1g含氮酪蛋白溶于0.1M/L磷酸钠缓冲液中，pH7.5）和100μl酶样品。

混合物在98摄氏度下反应30min，反应结束时，将样本放在冰上并且添加500μlTCA（三氯乙酰酸）溶液（15gTCA溶于100ml蒸馏水中）。

之后将样品放置于Eppendorf微型离心机中进行离心（12,000转，3min）以去除沉淀物。

用分光光度计在440nm处对上清液进行检测，用蒸馏水进行调零。

一个单位的蛋白酶活性被定义为原材料蛋白酶每小时水解1毫克含氮酪蛋白的毫克数。

2.5瘤胃中物质的微生物总数计数

活性细菌和真菌的总数分别用Holseman等人（1977）和Joblin（1981）的方法用厌氧菌滚动管进行统计。

可分解纤维素的细菌也可以用大多数可能的数值（MPN；

用10-6到10-9连续稀释）程序统计出来。

MPN肉汤培养基用以计数可分解纤维素的细菌，这和Dehority等人（1989）的纤维素培养基包含可溶性碳水化合物（葡萄糖、纤维二塘、木糖各1g溶于100mL缓冲液中）和一条滤纸纤维素（70±

100mm）类似。

12天培养后，纤维素的数量用纤维条被水解掉的量进行评估。

在对瘤胃中的原生动物进行计数之前，运用Ogimoto和Imai（1981）的方法，将样品固定在MFS（甲基绿-甲醛-盐溶液）溶液中，溶液由900mL蒸馏水、100mL甲醛溶液（35g甲醛溶解在蒸馏水中）、0.6g甲基绿和8.0gNaCl。

将固定在甲基绿甲醛盐溶液中的原生动物用同样的溶液进行稀释，并将稀释液滴于一个特殊的原生生物分析镜上，也就是一个有规律间隔细小沟槽的载玻片（Cat.No.900,HausserScientific,BlueBell,Pa.19422），并将此在显微镜下观察计数。

对于用来计数瘤胃中的原生生物，沟槽的最佳间隔为0.5mm（Ogimoto和Imai，1981）

2.6DM原位降解率

为了检验在瘤胃中添加蒸馏水（空白组）和NIS溶液（NIS实验组）稻草DM的降解率，我们进行了一个原位实验。

DM降解率的测定，通过将5g的稻草置于尼龙袋（25μm每个；

80mm×

130mm内径）中并悬挂在瘤胃里进行反应。

这些袋子进行了清洗，在55摄氏度下干燥48h，并在装样品前和装之后都进行了称量。

袋子在温水中浸泡了10min后置于瘤胃中30min在上午的喂食之后。

袋子一式三份，分别在消化反应进行了6、12、24、36、48和72h以后取出。

袋子取出以后，对其进行清洗，直到清洗液变得干净为止，然后再把它们放在55摄氏度的烘箱内干燥48h，用于测定其中的DM。

DM的降解速率由Ø

rskov和McDonald（1979）的指数方程进行计算：

其中，P是稻草DM的比率，t为降解时间，a为部分能快速溶解的DM，b为潜在可降解的DM，c为分数b消失的速率常数。

常数a，b和c用NLIN进行估计，即一种反复迭代的最小二乘法（SAS,1996）。

而有效降解性则通过接下来的Ø

rskov和McDonald（1979）的方程式进行计算：

p是经过瘤胃消化的估计速率，假定，通过瘤胃的速率0.025h-1作为稻草有效降解性的估计量。

2.7体外降解性

将稻草磨碎称取250mg，以同样操作得到完全相同的两份。

将样品放于50ml的试管中，根据Maeten和Baenes（1980）所描述的试验方法，加入瘤胃液体，分别反应24、48和72h。

12（2种处理方法*6个平行试验）个样本的瘤胃液体的来源，分别取自12只经过两种处理方法（添加蒸馏水和添加NIS液体）瘤胃上带有套管的奶牛。

反应最后，在发酵管中对稻草DM的含量进行分析。

和最初的量进行比较，计算出的最后的DM反应降解量即为DM体外降解性。

这可作为空白的校准。

2.8统计分析

对于差异性分析和方法分析，参考Duncan的多级实验，运用SAS（1996）的一般线性模型程序（GLM）分析。

经仔细选择，将P<

0.01作为评价各方法明显不同的指标。

3.结果

3.1瘤胃的发酵特征

瘤胃内的pH、总VFA和氨氮的含量受NIS处理的影响，见图1。

NIS处理的奶牛，和用蒸馏水处理的牛（空白对照组）相比，瘤胃内的pH较低。

经过6h的控制，NIS处理后的牛的瘤胃pH降到了6.32。

通常而言，瘤胃内pH受添加的NIS的影响，除了喂食后9h的pH，由于离喂食之后的时间较长，NIS作用减弱。

按照Tamminga（1979）的综述中提到，对于蛋白质和纤维素水解最有利的pH范围是6.32±

0.02到6.83±

0.04。

图1.瘤胃反应特征（A）pH值;

（B）总VFA;

（C）氨氮;

（D）微生物细胞增长率。

对照组（○-○）用200mL蒸馏水处理；

NIS处理组（■-■）200mL去离子表面活性剂处理。

每个点上的竖条为方差大小的体现。

竖条上的数字表明差异性的大小，不同的数字对应迥异的差异性（P<

0.01）。

100ml瘤胃液体中的总VFA含量（喂食6h以后）为103.05±

3.92和90.29±

2.87mM，分别对应NIS处理组和空白对照组。

和对照组相比，NIS处理组的总VFA增加了12.38%。

喂食3h后，NIS处理组的氨氮含量，也有明显地增加，和空白对照组比较增加了19.35%。

无论何种处理方法，通过Satter和Slyter（1974）的方法测出的氨氮浓度范围在9.78±

0.56到21.34±

0.77mg/dl之间，这个范围有利于微生物的生长和蛋白质的合成。

总VFA和每种VFA，以及醋酸和丙酸的比率都受到NIS溶液处理瘤胃的影响（表2）。

NIS处理的瘤胃的奶牛，和空白对照组相比较，总VFA含量在3h和6h喂食后控制下，分别增加到5.80%和12.38%。

受NIS影响总VFA的增加主要由于醋酸和丙酸含量的增加。

也发现一小部分异味酸。

在整个消化时间内，乙酸和丙酸的含量在NIS处理后6h达到最高值，在9h以后达到最低值。

3.2微生物总数和酶活性

用饲喂之后6h的奶牛瘤胃内液体来统计活性纤维素水解细菌、原生生物和真菌的总数（图2）。

NIS处理后的瘤胃内总活性细菌数增加了4倍多（从7.50±

1.3×

109到31.0±

4.6×

109cfu/ml瘤胃液体）（P<

0.01），但是纤维素水解型细菌并没有受到NIS溶液添加的影响，总活性细菌的总数从9.50±

1.5×

107变化到6.0±

1.2×

107每毫升瘤胃液体。

NIS的处理使原生生物的数量下降了2.1倍（从10.50±

105到7.50±

1.8×

105细胞数/ml）（P<

0.01），而对真菌数量却几乎没有影响（14.0±

1.75×

104和16.5±

1.68×

104tfu/ml）。

表2

每天用200mL蒸馏水处理（空白对照组）和NIS溶液处理（NIS实验组）后的奶牛瘤胃中液体的挥发性脂肪酸的浓度（mM）

奶牛瘤胃中水解酶的活性情况见图3，水解酶包括蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶。

和空白对照组相比，经NIS溶液处理过的奶牛瘤胃中的淀粉酶、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活性较高，特别是在饲喂之后6h和9h。

用NIS溶液处理取饲喂之后9h的瘤胃样品中，可观察到蛋白酶的活性具有相似的增加趋势。

3.3原位和体外干物质降解

用NIS溶液处理后，稻草的原位DM降解率（DR）在早期的消化时间里（前24h的消化时间）没有明显作用，但是在接下来的消化时间（消化时间从24h到72h）里却有着明显的变化（P<

0.01）（表3）。

经每天200mLNIS溶液处理后的瘤胃中尼龙袋内的稻草干物质消化率较空白对照组有了明显地增加（P<

0.01），增加了31.4%、30.0%和14.8%，分别对应于消化进行了36h、48h和72h。

图2.次柱状图分别体现了蒸馏水处理（空白对照组）和非离子表面活性剂（NIS）处理后的每毫升瘤胃液体中的总活性细菌总量（灰色柱，cfu/ml，×

109），纤维素降解细菌量（黄色柱，MPN/ml，×

107），原生动物量（○-○线，cell/ml，×

105）和真菌量（□-□线，tfu/ml，×

104）。

图3.折线图分别记录了200mL蒸馏水（对照组，○-○）和非离子表面活性剂溶液（NIS处理组，■-■）处理后瘤胃内液体的水解酶活性，水解酶包括蛋白酶（A）、淀粉酶（B）、羧甲基纤维素酶（C）和木聚糖酶（D）。

1单位酶活性定义为，每分钟减少的蔗糖当量所产生1mmol淀粉、葡萄糖或是木糖（分别为淀粉酶、羧甲基纤维素酶或木聚糖酶）的酶量。

而一个单位的蛋白酶活性被定义为原材料蛋白酶每小时水解1毫克含氮酪蛋白的毫克数。

干物质降解率常数（参数b和c）以及实际降解性也都受到NIS溶液的重大影响。

参数a+b为潜在和降解和可快速降解的比率之和，NIS处理组（0.7199）较空白对照组（0.5817）比较有所增加。

NIS处理有效影响了降解率，NIS处理组和空白对照组分别为41.2%和36.0%。

图4中反映了不同时间下，稻草在瘤胃内消化DM的降解量（A）和降解率（B）的图像。

DM的降解率（B）可以观察到NIS处理后的DM降解率除了早期的时间，都表现为明显比空白对照组更快、更高。

NIS处理组的降解量峰值出现在48h，而空白对照组的降解量到72h还一直在升高。

然而，当用蒸馏水处理（对照组）和NIS溶液处理后的瘤胃内液体作为接种物进行稻草体外干物质降解时，干物质降解率并没有收到NIS溶液处理的影响（表3）。

表3

表格所描述的是，每天对奶牛瘤胃中添加200mL蒸馏水（空白对照组）或是非离子表面活性剂溶液（NIS处理组），对稻草干物质在瘤胃的原位消化和取瘤胃液体作为接种物的体外降解，所得到的消化率和降解性常数。

4.讨论

之前对真菌细胞可渗透性的研究证明了非离子表面活性剂（NIS；

表面活性剂）能够刺激酶的释放（Reese和Maguire，1969；

Munn等人，1983）。

Yazdi等人（1990）的研究表明，在表面活性剂山梨酸酯80的需哦用下，能刺激需氧子囊真菌——粗糙链孢霉菌的纤维素酶合成体分泌纤维素酶，并且他们证明了一些水解纤维素酶N.crassa的分泌和一层脂质成分的薄膜有关，而酶释放的增加是由于膜上脂质的不饱和度的增加使膜的流动性改变。

表面活性剂的作用被归结为至少三个原因：

（1）作用于细胞膜，使膜的渗透性增加（Reese和Maguire，1969）；

（2）促进结合酶的释放（Reese和Maguire，1969）；

（3）在有氧情况下，由于生长率的降低，使需氧量下降（Hulme和Stranks，1970）。

在厌氧环境下的瘤胃中，没有好氧微生物只有厌氧微生物，如果NIS在这种环境下只具有第一和第二个作用（增加细胞渗透性和细胞结合酶的释放）而没有第三个作用（降低细胞生长率），那么NIS可能帮助反刍动物提高消化能力。

正如我们所期待的，我们的研究结果显示，在奶牛瘤胃中添加NIS能够显著提高蛋白酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活性，提高稻草原位和体外的降解率，提高瘤胃中液体VFA和氨氮的浓度，并且在没有好氧微生物的情况下提高瘤胃中厌氧微生物的生长率。

这个结果表明，NIS确实可以作为一种在瘤胃中促进多种酶活性和微生物生长的饲料添加剂。

图4.折线图为，每天对奶牛瘤胃中添加200mL蒸馏水（空白对照组，○-○）或是非离子表面活性剂溶液（NIS处理组，■-■），对稻草干物质在瘤胃的原位消化（A）和取瘤胃液体作为接种物的体外降解（B），所得到的消化率。

虽然大家所知NIS对于好氧真菌细胞结合体来说是最有效的刺激酶释放的表面活性剂（Deshpande等人，1987；

Wittenberger等人，1978），然而对于瘤胃中厌氧微生物的作用是之前没有报道过的。

我们的试验证明了NIS可以刺激瘤胃中厌氧微生物释放出多种酶。

瘤胃中胞外酶活性的增加，可能是由于NIS的添加使细胞膜的渗透性的提升有关，因此使得更多的酶被释放到细胞外，这是Reese和Maguire（1069）和Yazdi等人（1990）对好养真菌种类所提出的假设。

表面活性剂NIS表现出具有影响一些特定微生物细胞渗透性的能力（Paunescn等人，1964），它通过改变细胞膜的渗透性，同时促进细胞膜对化合物的吸收和释放（Reese和Maguire，1969）。

此外，NIS能够通过减少氧气的供给抑制好氧微生物的生长（Hulme和Stranks，1970）。

但是，在之前的研究中，伴随着胞外酶活性的增加，NIS的添加并没有对瘤胃中厌氧微生物的生长率产生影响。

在瘤胃液体中，总细菌数和真菌数的增长，也使纤维素酶和木聚糖酶的活性有所增加，如图3所示。

由于缺少相关文献，所以关于NIS对于瘤胃中微生物的影响无法进行直接比较。

但是，根据目前的实验观察，这在我们实验室已经得到了认可。

我们之前的研究表明，瘤胃中非水解纤维素细菌包括嗜淀粉拟杆菌（Bacteroidesamylophilus）、埃氏巨球形菌（Megasphaeraelsdenii）、Prevotellaruminicola和反刍动物月形单胞菌（Selenomonasruminantium），当添加NIS聚山梨酸酯80的浓度在0.05%和0.10%时，会大幅提高上述细菌的生长率。

然而，一些纤维素水解细菌包括Fibrobactersuccinogenes、白色瘤胃球菌（Ruminococcusalbus）、生黄瘤胃球菌（Ruminococcusflavefaciens）和Butyrivibriofibrisolvens，这些细菌的生长率对于NIS的添加只受到了轻微的促进作用或是几乎没有作用。

而瘤胃中单细胞或是多细胞真菌，包括Neocallimastixpatriciarum27和Piromycescommunis22、Orpinomycesjoyonii19-2和Anaeromycesmucronatus543，则因聚山梨酸酯80的添加生长率大幅增加。

虽然用NIS处理后的奶牛瘤胃的pH在饲喂后0h和9h进行比较没有明显地差别，但是和用蒸馏水处理的奶牛瘤胃pH相比的，NIS处理后的pH比较低。

这个结果可以证实NIS处理后的瘤胃具有更高的VFA浓度。

NIS处理后得到的更高的氨氮浓度，和瘤胃内发酵反应蛋白酶的活性具有必然的关系，氨氮浓度升高，瘤胃中微生物细胞分泌的水解蛋白酶增加，同时更多的植物蛋白得到消化。

瘤胃中，醋酸、丙酸和丁酸的浓度，以及醋酸和丙酸的比值明显受到NIS添加的影响（表2）。

不同的处理方法表明，NIS处理后的自然发酵反应发生改变，使VFA和醋酸/丙酸的比率发生明显改变。

分别对NIS处理组和蒸馏水处理的瘤胃中液体作为接种物进行稻草干物质的体外降解实验，虽然两者没有明显地区别，但是稻草原位干物质降解实验的研究却表明，NIS处理组的降解率增加到31.4%和30.0%分别用原位放置尼龙袋反应36h和48h（表3），和对照组相比有显著地提高（P<

NIS处理后使得营养物质的消化系数增强，NIS的使用预计可以增加瘤胃的发酵参数，增加微生物的数量和酶的活性。

因此，NIS可作为提高纤维饲料消化率的饲料添加剂。

5.结论

非离子表面活性剂的添加可以通过提高瘤胃消化特征（如，瘤胃pH，氨氮，VFA）来明显提高稻草的体外和原位的降解率，瘤胃微生物种群量（如，总活性细胞数和瘤胃厌氧真菌数）以及瘤胃液体中各种水解酶的活性（如，蛋白酶，淀粉酶，羧甲基纤维素酶和木聚糖酶）。

非离子表面活性剂的这种作用，我们首先进行了报道。

并且非离子表面活性剂价钱便宜，易在市场上获得。

由于非离子表面活性剂的添加可以提高瘤胃中营养物的利用，这对于反刍动物而言具有重大的研究意义。

总而言之，利用NIS作为饲料添加剂来提高植物原料的消化，具有潜在的工业实用性。