冻存细胞的复苏与传代培养Word格式.docx
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(4)0.2mol/LNaOH浸泡半日。
(5)清洗5~10次,蒸馏水涮洗3次,倒置晾干。
勿使皮肤直接接触到被洗涤的物品(戴手套操作)。
(6)锡纸包装封口。
(7)干热灭菌180℃5~8h或湿热灭菌15磅以上40min。
注意:
自第5步以后均应戴手套操作,勿用普通纸包装待灭菌物品,以免纸被烧焦。
4.胶塞的处理
(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1%稀盐酸浸泡30min。
(4)自来水清洗10次,蒸馏水涮洗3次。
晾干,高压灭菌(见
(二)消毒与灭菌)。
旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次,过蒸馏水,晾干,包装并高压灭菌后,便可使用。
5.塑料制品的清洗
(1)用洗涤剂清洗,自来水冲洗数遍。
(2)次强酸洗液浸泡2~6h。
(3)自来水冲洗10次以上,蒸馏水涮洗3次。
(4)浸泡在70%乙醇1h以上,备用。
(5)临用前从70%乙醇中取出,在超净台内紫外线照射1h左右方可使用。
也可在洗净后不经70%浸泡,而用塑料袋包好,成箱地去照射60Co灭菌。
6.加样器头(Tip)和离心小管(Tube)的清洗
(1)新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水涮洗,晾干,高压灭菌后可以使用(方法同塑料制品)。
(2)当新的国产Tip和Tube用于RNA提取时,则用蒸馏水涮洗后再用DEPC水(抑制RNA酶)浸泡过夜后晾干,高压灭菌后方可使用。
(3)使用过的Tip和Tube用完后应浸泡在0.2mol/LNaOH或0.2mol/L盐酸溶液中。
用清水洗过,再用较稀的洗涤剂液在超声波清洗仪中超声处理30min。
自来水清洗5~6遍后,再用次强洗液浸泡2~24h。
自来水逐个充分冲洗并用蒸馏水涮洗,晾干,放入Tip架或饭盒内高压灭菌。
7.洗液的配制
常用的洗液是硫—重铬酸钾溶液。
洗液可根据需要配制成不同的强度(表1-1)。
表1-1常用的洗液配方
成分
强酸洗液
次强酸洗液
重铬酸钾
63g
3150g
120g
6000g
浓硫酸(工业)
1000mL
50000mL
200mL
10000mL
蒸馏水
配制方法:
(1)将重铬酸钾放人大烧杯中,加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌,使重铬酸钾充分溶解。
(2)将重铬酸钾液倒人酸缸中,然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌,充分混合溶解。
操作时务必注意安全,穿戴好耐酸手套和围裙,防止洗液溅到皮肤和衣物上。
万一不慎溅到皮肤上应立即用大量清水冲洗。
消毒与灭菌
1.物理消毒法
(1)射线消毒灭菌
主要使用60Co、X射线进行消毒灭菌,可用于牛血清和塑料制品的灭菌。
(2)紫外线消毒
用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿,如塑料培养皿、培养板等。
这是常使用的消毒方法之一。
①消毒方法现在一般用无臭氧型紫外灯。
消毒的效能与距离成反比,因此应根据消毒的目的适当设置消毒距离:
进行空气消毒时灯管应距地面2.5m以内;
台面的消毒应在80cm以内;
培养器皿的消毒在30cm以内。
消毒的时间与效能存在一定关系,但不是绝对的:
照射20min后,约有71%的细菌被消灭;
40min后79%的细菌被消灭;
60min后86%的细菌被消灭。
紫外线照射时间再长也不是100%的灭菌,最多只能把90%的细菌消灭,过长的照射是没有意义的。
故单独使用时,一般只用于空气和台面的消毒。
如仅用紫外线照射带菌的器皿,则无法彻底灭菌,所以应与其他消毒方法结合使用,如先用75%的酒精浸泡,再照紫外线消毒灭菌等。
②检查消毒灭菌效果照射后为检查超净台是否达到无菌效果,可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放置5个含琼脂糖半固体培养基的直径90mm培养皿,20min后再转入37℃培养箱中培养72h,观察细菌生长情况。
如果每块平皿上无菌落生长,说明洁净台符合无菌标准。
(3)干热灭菌
主要用于玻璃器皿的灭菌。
将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内,加热至160℃,保温90~120min。
用于RNA提取实验的用品则需180℃,保温5~8h。
(4)湿热灭菌
此方法也称为高压蒸汽灭菌,是最有效的一种灭菌方法。
主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20xSSC等)。
手动高压灭菌锅操作如下:
①首先查看高压锅内的水是否充足,放人物品盖好盖。
②加热高压锅。
将放气阀打开,放气5~10min,以排除锅内的冷空气。
③待锅内水沸腾后,落下放气阀继续升温升压,玻璃器皿等用15磅(121℃)30min,胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115℃)20min。
调节火力大小保持该压力。
④停止加热,待压力自然下降至0再打开放气阀排汽,开盖,取出高压灭菌的物品烘干。
如:
电热自动灭菌锅使用说明(型号:
SANYOAutoclaveMLS-3020):
①放气筒加水至LOW水平线处,将与高压锅相连的导气管插入放气筒里,然后将放气筒归于原位。
②打开高压锅盖,加入蒸馏水至高压锅底的水位线,水位线位于V型凹槽的1/3~2/3处。
③打开电源。
④设定高压温度及时间,高压锅的温度范围为105~121℃,高压灭菌一般采用121℃20~30min。
⑤把待高压的物品置于高压锅内,顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。
⑥关闭高压锅盖,旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。
⑦按start钮,开始高压,在温度达80℃时显示器开始显示温度,当温度达到所需的设定温度时,在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮,直到高压时间结束后指示灯灭,此时蜂鸣器报警一声。
当压力降至0MPa时,蜂鸣器再报警一声。
温度降至80℃时,蜂鸣器报警10次。
显示屏温度指示消失,此时才可打开锅盖。
⑧关电源,开高压锅盖,取出已灭菌的物品,烘干。
(5)滤过除菌
用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。
采用金属滤器和小型的塑料滤器,配上可以更换的微孔滤膜,极大地方便了操作。
滤器型号按直径大小划分。
如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90mm、100mm、142mm……等),配以过滤泵使用。
过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20mm、25mm等)。
滤膜孔径有0.60μm、0.45μm、0.35μm、0.22μm、0.10μm等,以0.22μm除菌最为保险,但对于较粘稠难滤过的液体,仍需选用孔径较大的滤膜。
①在过滤器上装上微孔滤膜,孔径为0.22μm。
②用布包好,湿热灭菌后使用。
2.化学消毒法
常用的消毒液有如下几种:
(1)70%(或75%)酒精:
超净台里常备70%酒精棉球(卫生级酒精),用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
(2)0.1%新洁尔灭:
主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。
超净台旁应常备盛有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。
(3)来苏儿水(煤酚皂溶液):
主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗,以及空气喷洒消毒,特别是污染细胞的消毒处理。
使用浓度请按瓶上说明。
(4)0.5%过氧乙酸:
是强效消毒剂,10min即可将芽孢菌杀死。
用于各种物品的表面消毒,用喷洒和擦拭方式进行。
(5)乳酸蒸气:
将乳酸放人坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。
将门窗紧闭1~3d。
可将空气中漂浮的微生物杀死。
(6)37%甲醛加高锰酸钾:
使用前先紧闭门窗。
将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。
用一张纸盛好适量的高锰酸钾,迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸汽。
1~3d后方可达到消毒空气的目的。
3.煮沸消毒
急性消毒可用煮沸法,器械等煮沸15min后使用。
(五)注意事项
1.清洗玻璃制品时,浸酸之后一定要用自来水冲洗10~15次。
因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。
清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。
千万不要用硬毛刷,否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。
Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。
如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2.干热灭菌时,应在白天使用烤箱,并不断观察,以免发生意外。
当温度超过100℃时,不能再打开烤箱门。
器皿烤完后,待温度降至100℃之下才能开烤箱门。
金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。
3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干,以防包装纸潮湿发霉。
4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液,均不能高压(如TdR,秋水仙素,谷氨酰胺,异硫氰酸胍,MOPS等)。
5.滤过除菌时,滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸),包好,经高压灭菌后才能使用。
滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。
过滤时压力不宜过大,压力数字以2为宜。
压力太大时微孔滤膜可能破裂,或使某些微生物变形而通过滤膜。
装滤膜时位置要准确。
另外滤器包装时,螺钉不要拧得太紧,以防高压蒸汽不能进入,待高压灭菌之后,再拧紧使用。
6.使用化学消毒法时,配制75%酒精应用卫生级,不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。
来苏儿水不能用于皮肤消毒,它对皮肤有刺激性。
空气消毒时,所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。
因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸汽对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
(六)实验报告
1.根据教师安排配制洗液,写出配制过程和遇到的问题。
2.根据教师安排用蒸馏器蒸制1000mL三蒸水,遇到什么问题?
应注意什么?
3.填表1-1-1各种瓶皿的清洗,并根据教师安排进行清洗。
4.填表1-1-2消毒和灭菌处理方法,并根据教师安排进行消毒。
表1-1-1各种瓶皿的清洗
瓶皿种类
清洗步骤
注意事项
新玻璃器皿
旧玻璃器皿
胶塞
塑料制品
微量离心管加样器吸头
表1-1-2消毒和灭菌处理方法
消毒和灭菌方式
消毒和灭菌步骤
紫外线消毒
干热灭菌
湿热灭菌
滤过除菌
(七)思考题
1.哪些物品适合于高压灭菌,并说明理由。
2.此外线消毒的适用范围和目的是什么?
二、培养基的配制
熟练掌握培养基(RPMll640和DMEM)的配制,了解其他培养基的配制方法。
组织培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。
合成培养基有商品出售,它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。
其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。
它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。
小牛血清含有一定的营养成分,更重要的是它含有细胞生长所必需的生长因子、激素、贴附因子等,这是合成培养基所无法替代的。
此外它还能中和有毒物质的毒性。
故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10%~20%)。
仪器滤泵(进口)1套,滤器(进口)1套,蒸馏器,高压灭菌锅,磁力搅拌器。
材料3000mL锥形瓶,250mL或500mL培液瓶,翻帽塞,饭盒,pH试纸,孔径0.22μm的微孔滤膜。
试剂盐酸,无离子水,小牛血清,合成培养基(RPMIl640或DMEM),青霉素,链霉素,NaHCO3。
(四)实验步骤
准备和安装过滤器
清洗好过滤器,干燥,放入一张孔径0.22μpm的微孔滤膜,用布包装好,15磅20min进行高压灭菌处理。
在超净台内打开过滤器架好,胶管一端接人滤泵再插入待除菌的液体中,出口端胶管伸人到已消毒好的瓶子中。
用滤泵做正压过滤,压力数字为2。
过滤后要检查滤膜是否完好无损。
合成培养基的配制
1.去离子水用蒸馏器进行重新蒸馏(去除无机和有机杂质),制3000mL三蒸水。
三蒸水应及时使用,如果放置一段时间,则使用前须高压处理(15磅20min)。
2.待水温降至15~30℃,加入合成培养基干粉,用磁力搅拌一定时间(2~4h)使之充分溶解。
3.配制RPMIl640培养基时应通人适量CO2或加入6mol/L盐酸调pH至6.0左右,这样才能充分溶解。
4.加入一定量NaHCO3调节pH至7.0左右。
5.加水至最终体积。
6.在超净台中对溶液进行滤过除菌,分装入250mL或500mL玻璃瓶中,用翻帽塞塞紧瓶口。
7.瓶口封好,4℃冰箱贮存(RPMIl640培养基可以-20℃贮存)。
小牛血清的处理
市场上出售的小牛血清一般做了灭菌处理,但在使用前还应做热灭活处理,即通过加热的方法破坏补体(近来也有观点认为热灭活处理是不必要的)。
1.将血清加热至56℃并保持30min,其间要不时轻轻晃动,使受热均匀,防止沉淀析出。
2.处理后的血清贮存于4℃。
3.小牛血清在使用前最好进行筛选以掌握血清的质量(见八、新生牛血清的筛选)。
(四)生长培养基的配制
除无血清培养之外,各种合成培养基在使用前需加入一定量的小牛血清和抗菌素。
1.培养基分装成小瓶(100~200mL)以便使用,翻帽塞塞紧瓶口。
2.按如下比例配制:
基本培养基占80%~90%,小牛血清占10%~20%。
按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100U/mL和100μg/mL。
(五)注意事项
1.培养细胞使用的瓶子和饭盒应与提取RNA和培养细菌的瓶子和饭盒严格分开。
因为用于处理提取RNA的DEPC水(0.1%焦炭酸二乙酯)是一种致癌剂,并可能影响细胞生长;
而培养过细菌的用品也不应与细胞混用。
2.过滤时压力不要太大,以压力数字2为宜,否则细菌易滤过达不到除菌效果,或使滤膜破裂。
分装时需根据使用量的多少分装于大小合适的瓶子中(分装量为使用3~5次用完为宜,并且每瓶只能装2/3体积的液体,过多时瓶子易爆或胶塞自喷)。
3.滤器用毕立即刷洗,过蒸馏水,晾干收藏。
根据表1-2的实验安排进行实验,实验结果中填写:
遇到什么问题?
如何解决?
实验结果怎样?
表1-2培养基的配制
第1次实验
第2次实验
第3次实验
实验内容
制备三蒸水3000mL并高压灭菌,热灭活血清,
包装和高压灭菌过滤器
配制和过滤培养基
配制生长培养基
实验结果
1.为什么配制培养基之前要反复处理配制用水并要事先高压处理?
2.血清在细胞培养中有何作用?
3.配制培养基时调节pH值的目的是什么?
三、PBS和消化液(胰酶液)的配制
熟练掌握PBS平衡盐溶液的配制,了解消化液(胰酶液)的配制方法。
PBS液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。
PBS与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致,且配方简单,是组织培养基本用液,常用于配制培养基及其他用液,或洗细胞等,细胞在PBS中可生存几个小时。
胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液,原代培养时用于处理组织块,使细胞分离下来。
传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面,并分散成单个细胞。
蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏,呈白色粉末状,易潮解,应在低温干燥处保存。
胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示,常用胰酶活力为1:
125或1:
250。
本实验室一般用1:
250(GRC公司生产)。
胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。
一般来说浓度大、温度高(勿高于37t)、作用时间长,则对细胞分离能力大。
但超过一定程度会损伤细胞,导致细胞传代后不能贴壁或死亡。
胰酶在pH8.0、37℃时消化能力最强。
溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力,所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。
当消化结束时,可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。
细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%。
用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%。
仪器抽滤泵1套,过滤器1套,高压灭菌锅,量筒,磁力搅拌器,研磨器。
材料3000mL锥形瓶,25mL、50mL试剂瓶,500mL输液瓶,螺口盖,翻帽塞,pH试纸,孔径0.22μm的微孔滤膜。
试剂NaCl,Na2HPO4,KH2PO4,KCl,酚红,NaHCO3,胰蛋白酶干粉,0.02%EDTA,CaCl2,D-葡萄糖,MgCl2·
6H2O,MgSO4·
7H2O,酚红(2%)(配法:
称酚红2g,置于研磨器中,先用数滴5.6%的NaHCO3溶液溶解并研磨,再加进该5.6%NaHCO3溶液使最终体积为100mL。
瓶装保存,备用)。
配制D-Hanks液
1.按表1-3称取D-Hanks试剂。
表1-3Hanks,D-Hanks液(g/L)的成分比较
Hanks
D-Hanks
CaCl2(无水)
0.14
—
KCl
0.4
KH2PO4
0.06
MgCl2·
6H2O
0.10
MgSO4·
7H2O
NaCl
8.0
NaHCO3
0.35
Na2HPO4·
12H2O
0.132
0.09
D-葡萄糖
1.0
1.0(根据需要加或不加)
酚红(2%)
1mL
2.依次加入上述试剂至800mL蒸馏水中,溶解后定容至1000mL。
3.高压灭菌,10磅10min。
配制Hanks液
1.按表1-2称取Hanks试剂。
2.配制Hanks时,需将CaCl2另溶解于100mL的蒸馏水中。
3.依次加入上述试剂至700mL蒸溜水中,溶解后再与CaCl2溶液一起定容至1000mL。
4.10磅,10min高压灭菌。
配制胰蛋白酶消化液
1.D-Hanks液高压灭菌之后,晾至室温,4℃保存备用。
2.称取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天时研磨器应放在冰浴中),加入少量D-Hanks液研磨1000次左右,调制成糊状。
再放人4℃预冷的适量D-Hanks液中,4℃下磁力搅拌使完全溶解。
3.用NaHCO3干粉将胰酶溶液的pH值调至8.0左右(胰酶作用的最适pH值),并加入0.02%EDTA以协助消化作用。
4.滤过除菌(方法见二、培养基的配制),-20℃冻存。
1.BSS的pH值应确定为7.2左右。
2.如配制的Hanks液高压灭菌后液体变混,则可将100mL的CaCl2与含有其他成分的液体分别装瓶高压灭菌之后,再在无菌条件下配制,定容。
这样可以避免高压灭菌后液体变混。
3.胰酶受热易失活,所以尽量避免盛夏配制,并且在配制过程中温度应始终保持在4℃左右。
4.胰酶研磨要充分,否则在过滤时会将较大的颗粒过滤掉,不能达到真正的浓度。
5.胰酶分装时尽量分装成小瓶,并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。
因为冷冻保存时体积会膨胀,而多次使用同一瓶胰酶可能增加污染的机会。
尽量缩短胰酶在0℃以上停留的时间,以保持胰酶的消化能力。
根据你的实验填表1-3-1
表1-3-1Hanks、D-Hanks液和胰蛋白酶消化液的配制
实验步骤
配制胰蛋白酶
1.D-Hanks液的主要用途是什么?
2.配制胰酶消化液时应注意哪些问题?
3.D-Hanks和Hanks液的成分和配制方法有什么主要区别?
4.如何估计是否传代和传代的方式?
四、细胞传代培养
熟练掌握细胞的传代培养法。
传代培养是组织培养常规保种方法之一。
也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
细胞对酶的消化作用反应不一,有的敏感,有的迟钝,适度掌握细胞消化时间和选择适宜的方法很关键。
传代要在严格的无菌条件下进行,每一步都需要认真仔细的无菌操作。
(三)仪器、材料与试剂
仪器CO2培养箱,倒置显微镜,超净台。
材料培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯,培养细胞。
试剂培养基(RPMIl640或DMEM),小牛血清或胎牛血清,0.25%胰蛋白酶,Hanks液。
1.入无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。
2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3.超净台台面应整洁,用0.1%新洁尔灭溶液擦净或75%酒精棉球清洁。
4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右,关闭超净台的紫外灯,打开风机清洁空气,除去臭氧。
5.点燃酒精灯;
取出无菌试管,巴士德吸管和刻度吸管;
安上橡皮头;
过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6.将培养用液瓶口用75%酒精消毒,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7.倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2~3mLHanks液洗去残留的旧培养基,或用少量胰酶涮洗一下。
8.每个大培养瓶加入1mL胰酶,小瓶用量酌减,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察
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- 细胞 复苏 传代 培养