Siemens Advia 系列生化仪参数详解Word文档下载推荐.docx
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加样速度4.5秒,读点13.5秒,R1+S后读第一点,10分钟反应读点42个,R2在19点前加入。
反应杯总数231个,反应体积为80-430ul,R1和R2加入体积范围在5-300ul之间。
3分钟(最后读点14)、4分钟(最后读点18)、5分钟(最后读点21)、10分钟(最后读点42)、15分钟(最后读点63)、长程反应21分钟和31分钟。
ADVIA1650和1800加样速度为3秒,读点时间是6秒,R1+S后读第一点,10分钟反应读点98个,R2在49点前加入。
反应杯总数221个,反应体积为80-300ul,R1和R2加入体积范围在15-150ul之间。
ADVIA2400加样速度为2秒,读点时间是14秒,R1+S后读第一点,10分钟反应读点41个,R2在22点前加入。
反应杯总数340个,反应体积为60-180ul,R1和R2加入体积范围在10-100ul之间。
二、基本参数介绍:
主读点:
也就是MainDetectpoint的简写,m和n是主读点区的起止点,0<
m<
n,也就是说m和n两点是在启动反应后的两个点,m点的读点必须设置,n可以不设置(填写0就是不设置),双试剂中是指R2加入之后的一组时间点,据此计算吸光度速率或平均值用于浓度计算;
子读点:
Detectpoint的简写,p和r是子读点区的起止点,0<
p<
r,r点可以不设置。
子读点是指需要读取反应空白的区域,一般指启动反应之前的试剂和样本空白,在双试剂中是指R2加入前的一组时间点。
读点:
N,在终点法反应中,读点不小于三个,如果小于三个,系统自动前移满足三个。
在速率法当中,读点不能少于六个,如果小于六个,系统自动前移满足六个。
根据反应方法,子读点可以选择也可以不选择。
u/d和U/D旗标:
U和u表示上限,D和d表示下限,当超过小写u/d范围时,用大写U/D显示。
空白:
Blank(u/dU/D),这里指的是试剂空白的上下限。
就是以去离子水为样本的检测,主要用来监测试剂性能,是以主读点区主波长的吸光度值为基准的,当试剂的空白吸光度超过u/d上下限范围,就会用U/D显示出来,提醒操作人员注意试剂问题。
试剂空白是可以选择是否进行监测的。
Blanku/d的定义是,在下降速率当中,Blanku也就是空白上限为2ABS,Blankd为主读点吸光度的50%;
在上升速率当中,Blanku也就是空白上限为最高主读点吸光度的150%,Blankd为主读点吸光度的50%。
图1Blanku/U/d/D示意图
修正点:
E2。
E2表示试剂和样本加入后的几个点的吸光度值,用来进行LIH(乳糜、黄疸、溶血等标本)或底物耗尽的监测。
E2都将监测试剂空白以及样本加试剂的结果,也就是说E2=样本+R1的E2吸光度减去试剂空白的E2吸光度。
读点前移:
Point-Forwarding。
在速率法中,高浓度样本往往很快消耗完反应物,而底物却大量存在,速率反应很快停止。
当系统监测到这种情况时,会自动将主读点前移至发生速率反应的区域。
在使用读点前移的技术时,需要增加一个主读点M.DET.Pl,l<
n。
如果m和n主读点被监测到发生底物耗尽,那么自动前移读取l和m之间的读点。
图2读点前移示意图
图2所示中,m和n点之间出现底物耗尽现象,由于设置了l点,所以自动将读点移至l和m之间读取。
同样,l和m以及m和n之间要多于6个读点。
如果判断底物耗尽,就要借助样本吸光度限制这个概念。
样本吸光度限制:
Sampleu/d。
Sampleu或d只能选择一个,这是根据反应方向的不同而设定的,下降速率反应将只有Sampled,上升速率反应将只有Sampleu。
其要求监测R2加入之前和之后的数个读点的吸光度值,依然是主波长的吸光度值。
R2加入之前的监测点就是我们前面说的E2,R2加入之后的监测点是主读点区的最后两个点,叫做选择点。
E2和选择点进行计算:
Sampleu/d=选择点的吸光度-(E2*K)
其中:
E2=样本和R1的E2点吸光度值–试剂空白的E2点吸光度值
K=(R1+S)/(R1+S+R2)是体积系数。
当E2用于底物耗尽探测时,读点自动选取第7点,这样会避开LIH因素干扰。
判断依据,在下降速率反应中,当Sampled大于选择点吸光度时,认为是底物耗尽;
在上升速率反应中,当Sampleu小于选择点吸光度时,认为是底物耗尽。
图3底物耗尽示意图
图3的所示中,Sampled大于主读点区m和n最后两点的吸光度值,所以判断为底物耗尽,自动将读点前移到l和m点。
这里有一个问题,如果m点也处于底物耗尽的区域怎么办?
前移的结果也会不准确。
所以ADVIA的读点前移技术并不是那么可靠,为了保证可靠,其采用了非常复杂的计算方式,目的只有一个,规避东芝的弹性速率法。
这里简单的介绍一下弹性速率法。
其原理是监测速率反应的主读点区,并根据设置的吸光度差值进行没两个相邻读点的吸光度差,当实际读取的吸光度差值小于设定的吸光度差值时,就会判断为底物耗尽。
而底物耗尽判断后自动将读点前移至预先设置的两个点的区域,这样可以充分避开ADVIA中的如果m点也在底物耗尽区域的可能。
读点前移不在这里做详细介绍,后面有单独的章节。
反应方法:
有五个选择,EPA、RRA、2PA、CRA和IMA;
EPA反应方法:
就是常说的终点法,可以是一点终点法,也可以是两点终点法。
一点终点法时,子读点p和r无效,填为0;
两点终点法时,子读点p和r要填写,而且要在R2加入之前。
终点法读点要求至少三个点,不足三个点时,系统自动前移补足。
图4EPA终点法示意图
RRA反应方法:
也就是常说的速率法,可以是单速率法,也可以是双速率法。
采用单速率法时,读取主读点区的m和n的区域进行每分钟速率计算。
采用双速率法时,还要读取R2加入之前的子读点区p和r的区域进行每分钟速率计算,然后主读点和子读点相减再进行浓度计算。
使用速率法时,系统将自动进行E2吸光度计算。
但在参数设置,可以选择是否选择E2corre,也就是是否选择E2修正。
用DO或NotDo选择。
在速率法当中,Blanku/d必须输入,并且可以选择在R2加入前一点插入检查点CHECKD.P.I,此检查点将于试剂空白数据进行比较,借以判断试剂是否有问题。
但此法仅在下降速率法和IMA方法中使用。
如果不使用,则填写0。
当然,在速率法当中,也可以选择底物耗尽监测而增加的主读点
图5RRA速率法示意图
2PA反应方法:
也就是常说的两点速率法。
也是速率法的变种,区别在于不进行主读点间的两个点的线性监测。
其余与速率法完全一样。
图62PA两点法示意图
CRA反应方法:
官方说法为随着时间的变化反应接近恒定,曲线由最小二乘法拟合,也有称为固定点法。
大致意思是选择读点区的两个点进行吸光度值得最小二乘法计算。
是根据时间和吸光度的数值进行计算的,无论是速率法还是终点法均可采用。
当子读点被采用时,p=r≠0,或p≠0,r=0时,是速率法,速率计算是根据两点间曲线的正切线;
当p<
r时,用两点间连接直线进行计算。
当不采用子读点时,为终点法,采用最大时间吸光度和空白吸光度进行计算。
说实话,真不知道这个方法是做什么项目的,中文没有解释,英文的解释很少,也没发现实例。
图7CRP固定点法示意图
IMA反应方法:
也就是免疫比浊法。
是采用最小二乘法计算的速率法。
对于R1的加入量太少,无法进行E2计算时,这个方法就变得有用了。
也就是说,在很多免疫比浊项目里,R1的加入量往往小于R2的量,所以引发了一系列的计算和判别上的困难,IMA就是为了解决这个难题的。
样本和第一试剂加入量太少,就无法进行E2的计算,没有E2就无法进行前带监测和底物耗尽的监测,所以在IMA方法中R2之后插入监测点CheckD.P.I,用于弥补R1和S的不足。
采用IMA方法设置检查点后,系统自动计算limitvalues值(设备默认0.003),此法对浑浊样本的处理很有成效,所以用在免疫比浊项目上。
图8IMA免疫比浊法示意图
图9IMA应用示意图
IMA的其它使用方法与速率法一样,仅限于R1+S低于反应杯最小容量的测试项目里。
如果不存在这样的项目,那么即便是免疫比浊项目,也应该采用常规速率法或终点法。
定标方法:
因数定标、线性定标和非线性定标;
在参数界面里的Calcmthd,也就是计算方式里,有ABS和STD/MSTD选择,表示吸光度和单点定标/多点定标计算。
在ADVIA的所有机型里,定标中的零浓度点用试剂空白替代,所以在定标之前要做试剂空白,如果不做试剂空白,仪器会认为试剂空白就是原点。
注意这个差别,与奥林巴斯的不同。
奥林巴斯的试剂空白和零浓度校准点是两个概念,而在adiva里合二为一。
参数界面里的Formula,也就是公式才是选择定标方法的地方。
因数定标:
如果在Calcmthd里选择ABS,那就意味着你要采用因数定标,那么在Formula里只有一个可以选择,那就是Linear,因数定标只能用于线性定标。
因数定标也就是直线方程里的Y=KX+B中的K,所以也叫K值定标法。
而B的确定则需要试剂空白,所以因数定标法必须做试剂空白,然后结合给出的K值进行定标曲线的绘制,然后依据这个曲线进行浓度计算。
在Advia中,K值的给出是在参数界面的Standardssetting中的FV中。
线性定标:
线性定标需要两个点才能决定一条直线,我们一般给出一个零浓度点,一个带有浓度的标准点,这样仪器就会自动进行计算。
而Advia中零浓度点在试剂空白里给出了,所以对于两点线性定标来说,只需要在给出一个校准点就可以了。
所以在Advia的手册里,线性定标叫做一点线性。
而且Advia的所有校准点,无论是线性还是非线性,零浓度点都不计算在内,只数带有浓度的校准点,比如5点定标,加上零浓度点其实就是6点;
而6点定标,加上零浓度点就是7点。
不过,要指出的是,Advia的试剂空白并不是强制性的,这一点与奥林巴斯不同。
不进行试剂空白检查的项目,默认试剂空白也就是零浓度点的值是通过原点的。
下面给出两张图,一张做过试剂空白的线性定标,一张是没有做过试剂空白的线性定标。
图10没有做试剂空白的线性定标
由于假设所有没有做过试剂空白的线性定标的零浓度点都通过原点,所以图中的蓝线则是默认的校准曲线,但实际上并非如此。
如果提前没有做试剂空白,仪器也会自动做上,这样就会出现两个点,图中的两个红点就是。
左下角是零浓度点,右上角是标准店。
但蓝色的定标曲线却是右上角的红点和原点的连接,而不是与零浓度点连接。
这样的结果我们都知道会有错误,因为真正计算的是按照蓝色直线计算,而红色的我自己画上去的示意线条才是真正的计算直线。
要解决这个问题,只有重测试剂空白重新执行定标才行。
下图是做过试剂空白的线性定标图例
图11做过试剂空白的线性定标示意图
而在statisticalData里的FV就不是因数了,而是定标点的浓度。
上面两张图很清楚的告诉我们,一点线性定标,有一个Blank试剂空白,FV为0.00,而STD值只有一个,就是标准点的值。
图12Advia一点线性定标示意图
在线性定标中也有多点定标,例如同工酶法。
在Advia中,线性多点定标多是用来拟合一元三
(二)次直线方程。
对此有三种方法,由于很少使用,所以仅仅图示,不做解释。
图13无变换一元三次直线方程定标
图14对数线性变换的一元三次线性方程定标
图15对数变换的一元三次线性方程定标
同时,Advia还提供一元二次线性方程定标。
非线性定标:
Advia的非线性定标有Logit-Log1、Logit-Log2、Logit-Log3和Spline样条曲线、Iinegraph折线五种。
图16Logit-Log1非线性定标示意图
图17Logit-Log2非线性定标示意图
图18Logit-Log3非线性定标示意图
图19Iinegraph折线非定标曲线示意图
图20Spline样条非定标曲线示意图
在多点定标中,由于试剂随着使用时间的推移性能会发生改变,其中包括颜色的改变。
所以每天开机画面中会提供简单定标(Simplifiedcalibration)这个选项,原理是根据前后试剂空白修正整条定标曲线。
图21Simplifiedcalibration简单定标示意图
在图11中,左侧是定标细则的选项,其中,Calc.mthd表示计算方法,有ABS(因数法)、1-Point(1点定标)和Multi-Point(多点定标)三个选项;
在AxisConv.轴线变换中,有NoConv.(不变换)、Log.-Linear(对数线性)和Log.-Log.(对数)三种选择;
在MultipointFormula(多点公式)中,有Linear(线性定标)、quadratic(一元二次直线方程定标)、Cubic(一元三次直线方程定标)、Spline(样条曲线)、LineGraph(折线)、Logit-Log1、Logit-Log2和Logit-Log3等8种方式;
在#calStds里,要填写包括试剂空白在内的校准点数量。
图22多点非线性定标示意图
从图中我们看到,四个校准品的数值成梯度倍比关系,但无法做出满意的样条曲线,是否需要改为对数曲线还需要观察。
图23原厂试剂多点非线性定标示意图
这是原厂的IgM定标曲线,没有做试剂空白。
定标浓度并非梯度倍比稀释,但只有这样才能保证Logit-Log3曲线的完美。
好像国外很少使用样条曲线定标。
而这个项目恰恰是样条曲线。
如果用最高浓度倍比梯度稀释,就会得到一幅漂亮的样条曲线。
三、读点前移:
前面说过,Advia的读点前移技术是为了应对底物耗尽的速率反应,采用样本吸光度限制Sampleu/d和试剂空白限制Blanku/d来进行计算和判断。
要知道是,底物耗尽有时并不是因为样本的浓度或活性太高导致的,试剂污染或失效也有可能。
所以读点前移技术和底物耗尽判断,从另一个方面讲,也是对试剂性能的一个监测。
由于底物耗尽仅仅存在于速率法的反应当中,所以这里描述的均为速率法。
下面两张图就是超过Sampleu/d限制后的底物耗尽图例:
图24间接或相反反应超过Sampled限制的底物耗尽反应图示
图25直接反应超过Sampleu限制的底物耗尽反应图示
注意图25中27点出现的拐点,这已经是不明显的底物耗尽的表现。
样本吸光度限制和试剂空白的配合使用,加上检查点,可以很容易的判断试剂性能。
下图是极端情况下的试剂空白限制的图例
图26试剂空白图例
通过试剂空白计算出来的Blanku/d值与样本测试时主读点区主波长吸光度值进行比较,如果超出这个范围将会用U/D来标示结果,以提示操作人员该结果不可靠。
检查点check,而E2的吸光度计算点则选择在6、7、8这三个读点上。
注意这仅仅是用来监测底物耗尽的,如果用E2来监测LIH样本,则读点应该在2、3、4、5这些地方。
在直接反应中,也就是单试剂项目里:
当checku的值时,结果用u标示;
当checkd的值时,结果用D标示;
在间接反应中,也就是双试剂项目里:
当checku的值时,结果用U标示;
当checkd的值时,结果用d标示;
这就是结果里“U/u/D/d”这四种旗标的来历。
下面举例说明读点前移技术的使用:
图27读点前移举例1
图27中的三个曲线:
红色是试剂空白,蓝色是正常样本曲线,绿色是异常样本曲线。
图中有两天竖线,一个E2,一个是checkD.P.I,那么根据图示可以得到以下数据:
E2吸光度值试剂空白修正E2(E2-试剂空白)
试剂空白0.10-
正常样本0.500.40
异常样本0.600.50
那么经过体积修正过的E2是要计算修正系数的,而修正系数=(R1+S)/(R1+S+R2)。
这里假设R1是80,S是16,R2也是16,这样修正系数就是0.875。
那么经过体积修正过的正常样本E2就是0.343,异常样本E2就是0.429。
同时我们也知道,Check,其正常样本为0.55,异常样本为1.00。
那么体积修正过的Check,异常样本是0.571。
根据试剂空白的原则,Blanku应该是0.40,Blankd应该是0.05。
那么我们用Checku值的0.40进行比较,正常样本的差值0.207小于Blanku值的0.40,而异常样本的差值0.571大于Blanku值的0.40,又是间接反应,所以结果报告U。
图28读点前移举例2
图28的例子里,红色为试剂空白,绿色为异常标本2,蓝色为异常标本1。
很明显,异常标本1是典型的底物耗尽反应,而异常标本2貌似没有问题,但R2加入之前就过高了。
试剂空白-0.0041-
正常样本2.61192.6160
异常样本1.71541.7195
经过体积修正后的E2分别是:
异常样本1为2.242,异常样本2为1.474;
Check,异常样本2为1.4670;
E2和Check,异常样本2为-0.007;
Blanku值设为0.20,Blankd值设置为0.01。
异常样本1的差值0.224大于Blanku的0.20,又是间接反应,所以结果报告U;
异常样本2的差值-0.007,小于Blankd的0.01,又是间接反应,所以结果报告d。
这是两个利用试剂空白限制和E2以及Check,试剂空白放的很宽,并不是严格按照150%和50%最高最低计算公式计算的,但即便是这样,例子中还是判断为底物耗尽。
而在参数设置里,Blanku/d往往被设置成±
9.9999,这也就意味着不进行底物耗尽判断和试剂空白判断,那么Check
样本吸光度限制Sampleu/d在底物耗尽中的用途呢?
其与试剂空白Blanku/d可以同时,也可以单独使用,监测底物耗尽依然有一定的作用。
图29样本吸光度限制Sampleu/d在底物耗尽判断中的示意图
图29的上图是选择点吸光度值大于Sampleu,下图是选择点吸光度值小于Sampled,所以都被判断为底物耗尽。
下面举例说明计算方法:
图30Sampleu/d判断底物耗尽的例子
图中红色为试剂空白,蓝色为异常样本。
试剂空白的E2为-0.004,样本的E2为0.6127;
Sampleu/d=1.25-[0.6127-(-0.004)]*{[16(S)+80(R1)]/[16(S)+80(R1)+16(R2)]}=0.7215;
经过修正后的曲线就是蓝色虚线部分,那么主读点区的最后两个点的吸光度也就是选择点的吸光度值只有0.250,远远小于Sampled的0.7215(图中放宽到0.750),所以判定为底物耗尽。
(下降反应是Sampled,上升反应是Sampleu)。
判断底物耗尽后,就需要读点前移。
而采用读点前移,还需要一个
图31读点前移的各种可能图示
在这个图示中,主读点,读点前移就是读取,这种可能性太小了。
红色箭头才是更多的
当然最理想的状况是左侧的红色箭头,如果是右侧的红色箭头,即便是读点前移也毫无意义。
由此可知,Advia的读点前移技术相当的复杂,并不是那么容易掌握,而且在前移点的选择上也很令人抓狂,远不如东芝的弹性速率法简单。
不过,利用这种技术不仅可以判断试剂问题,也可以判断反应过程中的问题,还是很有帮助的。
我们要清醒的知道,利用读点前移技术,必须进行试剂空白检测,并且计算出Blanku/d和Sampleu/d,还要知道检查点Check,否则无法使用这一技术。
四、前带监测:
Prozone前带监测功能是几乎所有生化仪都拥有的,Advia系列也不例外。
更何况Advia强调免疫比浊功能,所以前带监测的设置与IMA的设置在一起,同在参数界面的一个区域里。
图32前带监测界面示意图
前带现象可能会导致实际结果偏低,这与底物耗尽类似,但在曲线上,而且截然不同。
在前带监测选择里,前带计算公式可以选择前带公式(用于终点法项目),也可以选择速率公式(用于速率法项目)。
无论选择什么公式,ProzoneLimit前带范围都要输入,这也是前带发生反应的实际吸光度值,超过这个值就会判定是前带反应。
Prozonejudge是前带的反应方向,这个方向决定是高于还是低于ProzoneLimit值,来判断前带现象。
如果选择速率公式,那么必须输入judgelimit的值,这个值低于前带子读点的吸光度值,将不进行前带检查。
,这与常规参数里的不同,也就是参数设置里的Calculationsmethodsetting里的
下面举例如何使用前带监测:
图33前带监测举例
图中的实线是正常样本,虚线是前带样本。
实线A的主读点中间值为m88–n90=0.750,子读点中间值为p51–r53=0.400。
主读点与子读点的吸光度差为0.350。
把这个数值作为ProzoneLimi
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