碱性磷酸酶动力学参数的测定Word文档格式.docx

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4-氨基安替比林：

天津市永大化学试剂有限公司分析纯

铁氰化钾：

硼酸：

苯酚：

天津市福晨化学试剂厂分析纯

三羟甲基氨基甲烷（Tris）：

北京化学试剂公司分析纯

NaOH：

碳酸钠：

天津光复科技发展有限公司分析纯

碳酸氢钠：

实验中使用的主要溶液有

（1）0.1mol/L碳酸盐缓冲溶液（pH=10）：

碳酸钠1.5875g，碳酸氢钠0.84g，蒸馏水溶解至250mL。

（2）0.04mol/L基质溶液：

磷酸苯二钠0.436g（无结晶水），用煮沸冷却的蒸馏水溶解至50mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。

（3）0.1mol/L醋酸镁溶液:

醋酸镁1.0725g，蒸馏水溶解至50mL。

（4）pH8.8Tris缓冲溶液：

Tris1.21g，蒸馏水溶解至100mL，取此溶液10mL，加蒸馏水80mL，再加0.1mol/L醋酸镁10mL，混匀后用1%的醋酸调节pH值至8.8，用蒸馏水稀释至100mL即可。

（5）0.5mol/LNaOH溶液：

NaOH5g，蒸馏水溶解至250mL。

（6）酶液：

碱性磷酸酶1.25mg，用pH8.8的Tris缓冲溶液配制50mL，冰箱内保存。

碱性磷酸酶1.25mg，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制50mL，冰箱内保存。

碱性磷酸酶1.25mg，用去离子水为缓冲溶液配制50mL，冰箱内保存。

（7）0.3%4-氨基安替比林液：

4-氨基安替比林液0.3g，碳酸氢钠4.2g，蒸馏水溶解至100mL。

（8）0.3%铁氰化钾溶液：

铁氰化钾1.25g，硼酸3.75g，，各溶于100mL蒸馏水中，溶解后混合至250mL，盛于棕色瓶，冰箱内保存。

（9）酚标准溶液：

苯酚1.5g，溶于0.1mol/L盐酸至1000mL，为储备液。

取此储备液25mL，标定后用蒸馏水稀释至0.1mg/mL作为标准溶液。

1.2仪器

烧杯（100mL）6量筒，移液管，试管，试管架

分光光度计型号UV2300上海天美科学仪器有限公司

电子天平型号AL204-IC梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司

恒温水浴等型号DF-101S金坛市晶玻实验仪器厂

2试验方法与步骤

2.1标准曲线的制备

取酚标准液0.00、0.05、0,10、0.20、0.30、0.40mL于6支试管中，分别加蒸馏水至2.00mL后，37℃水浴中保温5min，然后各加入0.5mol/LNaOH溶液1.00mL、0.3%4-氨基安替比林液1.00mL、0.3%铁氰化钾溶液2.00mL，混匀后室温放置17min，510nm波长处比色，并绘制标注准曲线。

各管酚含量分别为0、5、10、20、30、40μg。

2.2动力学参数确定实验

取干净试管9支，编号，按表1,表2，表3正确操作。

表1动力学参数测定试剂用量1

试管号

水/mL

0.04mol/L基质液/mL

碳酸盐缓冲液/mL

pH8.8Tris缓冲溶液配制酶液/mL

最终基质浓度/（mmol/L）

1

0.9

0.1

2.0

2

0.85

0.15

3.0

3

0.8

0.2

4.0

4

0.75

0.25

5.0

5

0.7

0.3

6.0

6

0.6

0.4

8.0

7

16.0

8

-

1.0

20.0

9

表2动力学参数测定试剂用量2

pH=10碳酸钠缓冲溶液配制酶液/mL

表3动力学参数测定试剂用量3

去离子水为缓冲溶液配制酶液/mL

加入酶液后，立即计时37℃水浴中保温15min。

保温结束后，立即加入0.5mol/LNaOH溶液1.00mL以终止反应。

各管分别加入0.3%4-氨基安替比林液1.0mL及0.3%铁氰化钾溶液2.0mL，充分混匀，放置10min以9号管为对照，在510nm处比色，并计算各管的酶活性。

用双倒数作图法，在坐标纸上作图，求该酶的Km值。

3结果与讨论

3.1标准曲线的绘制

用分光光度计测量每个试管的透光率，再依据公式-logT计算吸光度的值，具体数值见表4

表4标准曲线参数值

酚含量（μg）

透光率T%

吸光度（ABS）

100

38.6

0.413

10

30.2

0.52

20

18.9

0.724

30

11.2

0.951

40

7.9

1.102

依据表4的数据绘制标准曲线见图1

图1标准曲线图

得到公式y=0.0312x。

相关系数较小的可能原因为：

标准样受到污损，人为操作有误，一起不稳定等。

3.1.2动力学参数确定实验

按照2.2进行动力学参数测定试验，实验结果见表5，并依据表5的结果进行数据处理，处理结果见表6,7,8。

利用表6,7,8的数据，以底物浓度的倒数为横坐标，酶促反应速率的倒数为纵坐标作图，见图2,3,4。

计算出动力学参数，得到动力学方程1/V=Km/（Vmax*Cs）+1/Vmax。

表5不同酶液的T%

pH8.8Tris缓冲溶液配制的酶液的T%

pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的T%

去离子水为缓冲溶液配制的酶液的T%

0.711

0.691

0.720

0.702

0.682

0.709

0.675

0.658

0.706

0.667

0.647

0.705

0.677

0.636

0.685

0.64

0.623

0.666

0.629

0.591

0.655

0.617

0.584

0.645

表6pH8.8Tris缓冲溶液配制的酶液的数据

T

ABS

D

C

1/Cs

1/V

0.148

4.740

0.790

0.5

0.154

4.926

0.823

0.33

18.2

0.171

5.481

0.914

16.4

0.176

5.641

0.940

15.9

0.169

5.417

0.903

0.16

16.7

0.194

6.218

1.036

0.125

14.5

0.201

6.442

1.074

0.063

14

0.210

6.731

1.122

0.05

13.3

图2pH8.8Tris缓冲溶液配制的酶液的双倒数图

让y=0，则x=-1.085，Km=0.9217mmol/l。

表7pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的数据

0.161

5.160

0.860

17.5

0.166

5.321

0.887

16.9

0.182

5.833

0.972

15.4

0.189

6.058

1.010

14.9

0.197

6.314

1.052

14.3

0.206

6.603

1.101

13.7

0.229

7.340

1.223

12.2

0.234

7.500

1.250

12.0

图3pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液的双倒数图

让y=0，则x=-0.935，Km=1.0695mmol/l。

表8去离子水为缓冲溶液配制的酶液的数据

0.143

4.583

0.764

19.6

0.149

4.776

0.796

0.151

4.840

0.807

18.5

0.152

4.872

0.812

0.164

5.256

0.876

17.2

0.177

5.673

0.946

0.184

5.897

0.983

15.2

0.190

6.090

1.015

14.7

图4去离子水为缓冲溶液配制的酶液的双倒数图

让y=0，则x=-1.3504，Km=0.7405mmol/l。

3.2动力学参数测定实验结果与讨论

以上结果表明：

用去离子水为缓冲溶液配制的酶液最合适，用pH8.8的Tris缓冲溶液配制的酶液次之，用pH=10的碳酸钠缓冲溶液配制的酶液最不合适。

此次实验，受限于实验环境，设备条件，人为操作等因素的影响，对于这三种酶液的具体情况还有待研。

3.3体会

通过这次试验，我更加深入的了解了不同缓冲液配置的酶液对于酶促反应速率的影响，且对于反应操作也更加得心应手，不足之处在于酶液的配置及保存都有很严格的要求，受外界环境因素的影响较大，导致实验结果出现偏差，希望之后通过文献的查阅，实验条件的改善，人员操作的谨慎能更加准确的测定其效果。

参考文献

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[4]王秋颖.碱性磷酸酶特性及其应用的研究进展[J].中国畜牧兽医，2011,38

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[5]陈银霞.影响酶促反应速度的外因研究[J].现代农业科技,2008,18：

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