99mtc标记促凋亡蛋白smac多肽进行肿瘤显像的基础研究Word下载.docx
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该家族成员均含有1~3个杆状病毒IAP重复序列(baculoviralinhibitorofapoptosisrepeats,BIR),利用此结构区与caspase3,7,9结合而发挥凋亡抑制作用。
比如XIAP含有3个BIR结构区,其中BIR1,2连接区抑制caspase3,7,BIR3特异性地抑制caspase9。
Livin含有一个BIR区,可特异性抑制caspase9;
Survivin也通过其BIR区直接抑制caspase3,7[2,3]。
同样,IAPs抗凋亡的能力也受到调节。
线粒体促凋亡蛋白Smac(secondmitochondrialactivatorofcaspase)/DIABLO(directIAPbindingproteinwithlowpI)可与多种IAPs包括XIAP,c-IAP1,c-IAP2,survivin,livin的BIR区特异性结合,解除IAP的抑制作用,释放活化的caspases。
Smac,25kDa大小,前体存在于正常细胞线粒体,在凋亡信号刺激下,其N端55个氨基酸被剪切,形成成熟的Smac释放到细胞质而发挥作用[4]。
X线晶体衍射成像显示成熟的Smac通过N端前4个氨基酸:
丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-异亮氨酸(AVPI)与IAP家族的BIR结构域表面凹槽结合,从而解除对caspase的抑制,发挥促凋亡作用[5]。
(图1:
caspases,IAP和Smac相互作用关系示意图,图2:
Smac解除IAP抑制caspase作用示意图)
利用此特性,Arnt等分别将成熟Smac氨基端的4个氨基酸(AVPI)、6个氨基酸(AVPIAQ)、8个氨基酸(AVPIAQKS)与果蝇触角转录因子穿透序列(RQIKIWFQNRRMKWKK)相连接,合成可穿透细胞的融合多肽,与一些上皮来源的肿瘤细胞如乳腺癌细胞株MCF-7,T47D孵育,通过免疫共沉淀的方法证实各种融合多肽的确能穿透细胞膜,与内源性的XIAP,cIAP1结合,并能提高化疗药物如依托泊苷、紫杉醇诱发的凋亡,其中Smac6肽能力最强[6]。
Vucic等也合成了含有果蝇触角转录因子穿透序列Smac9肽(AVPIAQKSE),利用极化荧光分析技术证实Smac9肽不仅可以和XIAP的BIR3区结合,同样也可和Livin的BIR区结合[7]。
Sun等利用核磁共振分光法证实Smac多肽也可类似结合XIAP与survivn结合[8]。
IAP家族成员在多种人类恶性肿瘤中表达明显增高,以Survivin,XIAP,c-IAP1,c-IAP2,
Livin为著。
如肺癌(85.5%)、胰腺癌(88%)、食道癌(70%)、结肠癌(53%)、乳腺癌(60%)、结肠癌(53.2%)、膀胱癌(58%)和胃癌(68%)表达survivin,且其表达与肿瘤的恶性程度和预后显著相关[9-12]。
在恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、绒毛膜癌中有Livin表达,尤其在恶性黑色素瘤组织中的阳性率可达47.6%~70.6%,明显高于黑色素细胞痣(21.4~25.0%)[13]。
XIAP也在白血病、肝癌、肺癌、子宫颈癌等多种恶性肿瘤中表达增高。
本课题负责人所在之研究小组利用组织芯片及免疫组化技术对1100余例人类肿瘤中IAP家族成员的表达情况进行分析,也得到了相似结果。
肿瘤治疗过程中,许多抗肿瘤药物及放疗均是通过启动细胞凋亡机制完成的,而凋亡过程的抑制常常导致肿瘤细胞耐药[14]。
IAP在肿瘤细胞中过表达是肿瘤细胞逃避免疫监督的主要原因,IAP基因表达增高,细胞凋亡受抑,导致肿瘤耐药。
如Kato等的研究表明,食道癌Survivin的高表达能够对抗抗癌药引起的凋亡,在化疗效果好的患者的肿瘤组织中Survivin表达水平明显低于化疗效果差的患者,提示Survivin表达量能够预测肿瘤对化疗的反应[12]。
Li等检测了卵巢癌细胞中XIAP的表达情况,发现耐药细胞株XIAP的表达水平明显强于对化疗药物敏感细胞株,敏感细胞株经顺铂处理后,XIAP的表达下降,凋亡指数上升,而对耐药细胞株,顺铂未能影响XIAP的水平及细胞凋亡[15]。
因此,定量分析IAP表达对评估肿瘤的恶性程度、预后及治疗反应有极大的帮助。
大多数肿瘤高表达IAP,Smac多肽可特异性结合IAP。
多肽具有组织渗透迅速、血液中清除快、免疫原性低和合成方便的特性。
因此,若用某些可被探测的物质如放射性同位素标记该多肽,注射入体内,采用SPECT或PET则可进行肿瘤显像,同时还可以进行定量分析,量化IAP的表达,为临床医生评估肿瘤的恶性程度及预后,制定疾病的治疗方案提供重要的帮助,同时还可为治疗药物的筛选提供有力的帮助。
99mTc是目前运用广泛的纯γ核素,具有优良的理化性质,能标记多种化合物,在核医学临床诊断和实验研究中得到了广泛的运用。
巯基乙酰三甘氨酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(NHS-MAG3)作为一种有效的双功能螯合剂,在90年代中后期被用于人多克隆免疫球蛋白、抗体、小分子肽、DNA寡核苷酸及肽核酸等的99mTc标记[16]。
通过NHS-MAG3得到的标记产物,血浆蛋白结合率低,特别适合小分子物质的标记。
因此本研究选择NHS-MAG3作为螯合剂,对融合了穿透序列的成熟Smac氨基端的前6个氨基酸AVPIAQ-RQIKIWFQNRRMKWKK进行99mTc标记,探讨用于肿瘤诊断,预后以及肿瘤耐药评价的可行性。
试图通过基于凋亡抑制基因进行的显像,扩展肿瘤核素显像方法,为临床评估肿瘤预后、治疗疗效提供有用信息。
如该方法的确可行,还可对其进行188Re标记,以凋亡抑制蛋白为靶点进行肿瘤核素内放射治疗,具有极大的研究前景。
图1凋亡信号传导通路示意图(Fuentes-PriorP,2004)
图2Smac/DIABLO解除IAP蛋白抑制caspase作用示意图(VerhagenAM,2001)acaspase9通过其P10亚单位与XIAP的BIR3结构域凹槽紧密结合
bcapase3的催化部位同BIR2上游的连接体区结合(capase7也类似)
cSmac/DIABLON端氨基酸与caspase9类似,可竞争性结合BIR3凹槽,解除IAP对caspase9的抑制
dSmac/DIABLO可与BIR2上游的连接体区结合,解除对caspase3,7抑制
参考文献
1:
JacobsonMD,WeilM,RaffMC,etal.Programmedcelldeathinanimaldevelopment.Cell.1997;
88(3):
347-54..
2:
VerhagenAM,CoulsonEJ,VauxDL.Inhibitorofapoptosisproteinsandtheirrelatives:
IAPsandotherBIRPs.GenomeBiol.2001;
2(7):
REVIEWS3009.
3:
ShiY.Mechanismsofcaspaseactivationandinhibitionduringapoptosis.MolCell.2002;
9(3):
459-70.
4:
DuC,FangM,LiY,etal.Smac,amitochondrialproteinthatpromotescytochromec-dependentcaspaseactivationbyeliminatingIAPinhibition.Cell.2000;
102
(1):
33-42.
5:
WuG,ChaiJ,SuberTL,etal.StructuralbasisofIAPrecognitionbySmac/DIABLO.Nature.2000;
408(6815):
1008-12.
6:
ArntCR,ChioreanMV,HeldebrantMP,etal.SyntheticSmac/DIABLOpeptidesenhancetheeffectsofchemotherapeuticagentsbybindingXIAPandcIAP1insitu.JBiolChem.2002;
277(46):
44236-43.
7:
VucicD,DeshayesK,AckerlyH,etal.SMACnegativelyregulatestheanti-apoptoticactivityofmelanomainhibitorofapoptosis(ML-IAP).JBiolChem.2002;
277(14):
12275-9.
8:
SunC,NettesheimD,LiuZ,etal.SolutionstructureofhumansurvivinanditsbindinginterfacewithSmac/Diablo.Biochemistry.2005;
44
(1):
11-7.
9:
KennedySM,O'
DriscollL,PurcellR,etal.Prognosticimportanceofsurvivininbreastcancer.BrJCancer.2003;
88(7):
1077-83.
10:
SarelaAI,VerbekeCS,RamsdaleJ,etal.Expressionofsurvivin,anovelinhibitorofapoptosisandcellcycleregulatoryprotein,inpancreaticadenocarcinoma.BrJCancer.2002;
86(6):
886-92.
11:
KuJH,KwakC,LeeHS,etal.Expressionofsurvivin,anovelinhibitorofapoptosis,insuperficialtransitionalcellcarcinomaofthebladder.JUrol.2004;
171(2Pt1):
631-5.
12:
KatoJ,KuwabaraY,MitaniM,etal.Expressionofsurvivininesophagealcancer:
correlationwiththeprognosisandresponsetochemotherapy.IntJCancer.2001;
95
(2):
92-5.
13:
GongJ,ChenN,ZhouQ,etal.Melanomainhibitorofapoptosisproteinisexpresseddifferentiallyinmelanomaandmelanocyticnaevus,butsimilarlyinprimaryandmetastaticmelanomas.JClinPathol.2005;
58(10):
1081-5.
14:
JohnstoneRW,RuefliAA,LoweSW.etal.Apoptosis:
alinkbetweencancergeneticsandchemotherapy.Cell.2002;
108
(2):
153-64.
15:
LiJ,FengQ,KimJM,etal.Humanovariancancerandcisplatinresistance:
possibleroleofinhibitorofapoptosisproteins.Endocrinology.2001;
142
(1):
370-80.
16:
WinnardPJr,ChangF,RusckowskiM,etal.PreparationanduseofNHS-MAG3fortechnetium-99mlabelingofDNA.NuclMedBiol.1997;
24(5):
425-32.
项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题
研究内容
⑴99mTc标记MAG3-Smac及其性质鉴定
人工合成融合了细胞穿透序列的Smac6肽AVPIAQ-RQIKIWFQNRRMKWKK,对照肽为SmacN端6肽反向排列QAIPVA-RQIKIWFQNRRMKWKK;
以及不含穿透序列的Smac6肽AVPIAQ
四步法合成NHS-MAG3,偶联合成肽,99mTc标记;
标记物纯化、测定放化纯以及检测标记物的稳定性和血浆蛋白结合率。
99mTc-Smac体外生物学性质鉴定.
检测肿瘤细胞摄取99mTc-Smac的能力;
利用大肠杆菌表达XIAP、Survivin、Livin蛋白;
表面等离子体共振技术测定标记物与XIAP、Survivin、Livin蛋白结合的Kd值。
动物模型的建立与动物体内显像的研究
研究99mTc-Smac在动物体内的生物学分布、血液清除、体内代谢;
荷瘤裸鼠建立,将99mTc-Smac注射入动物模型后SPECT显像,分析肿瘤细胞内放射性强度;
通过注射显像剂后不同时间显像结果分析,确定最佳显像时间;
荷瘤裸鼠放疗或化疗后,比较肿瘤摄取显像剂的差异;
评价治疗疗效;
肿瘤组织XIAP、Survivin、Livin染色阳性细胞数与肿瘤摄取显像剂强度的相关性分析。
研究目标
(1)借助NHS-MAG3双功能螯合剂,使用99mTc标记可和肿瘤高表达的凋亡抑制基因结合的Smac多肽,实现肿瘤显像的可能性,从而建立一种新型肿瘤显像方法;
(2)该显像方法除了可对肿瘤进行多次显像外,还能定量测定凋亡抑制基因的表达水平,对评估肿瘤预后、治疗疗效提供有用信息,充分体现分子核医学与临床应用中的价值。
拟解决的关键问题
99mTc标记MAG3-Smac,要有优良的标记特性,保持与IAP蛋白的结合力,确能进入肿瘤细胞,实现肿瘤显像、评估肿瘤预后、治疗疗效的可能性。
拟采取的研究方案及可行性分析
研究方案
合成99mTc-Smac,经纯化、性质鉴定后测定其与IAP蛋白亲和力、靶特异性、生物稳定性。
其在动物体内生物学分布、体内代谢、血液清除速率等将通过荷瘤裸鼠加以研究。
注射99mTc-Smac后进行SPECT显像,定量分析放射性强度,并比较治疗前后放射性强度变化;
显像结果通过肿瘤组织免疫组化加以验证。
㈠99mTc-Smac的合成以及性质鉴定
1合成Smac多肽
融合了细胞穿透序列的Smac6肽AVPIAQRQIKIWFQNRRMKWKK(SmacA),对照肽为SmacN端6肽反向排列QAIPVA-RQIKIWFQNRRMKWKK(SmacB);
以及不含穿透序列的Smac6肽AVPIAQ(SmacC),可交于公司合成。
2合成NHS-MAG3,偶联Smac多肽
参照Hnatowich提供方法(NuclMedBiol.1997)合成NHS-MAG3,溶于无水二甲基甲酰胺,将Smac多肽分别溶于HEPES缓冲液(pH8.0),边振荡边逐滴加入NHS-MAG3溶液,使NHS-MAG3和Smac的摩尔比为10~20∶1,采用不同的连接时间进行偶联,用活化的Sep-PakC18反相柱纯化Smac-MAG3,甲醇或醋酸胺溶液洗脱,紫外分光光度计测260nm的吸光度,合并峰管,即为目的标记物,分装、冷冻干燥,-20℃保存。
放射性标记
将Smac-MAG3溶于醋酸胺溶液,用新鲜配制的0.5M酒石酸钠溶液调节pH值至7.6,使酒石酸钠最终浓度为6~7μg/μl。
依次加入99mTcO4-新鲜淋洗液74MBq和新鲜配制的1μg/μl氯化亚锡溶液,混匀后在室温下反应15min,依上述方法分离纯化。
通过HPLC方法测定标记率。
纸层析测定放射化学纯度。
499mTc-Smac稳定性检测
室温下将99mTc-Smac洗脱液分别放置1h,2h,4h,纸层析测定其放化纯;
将99mTc-Smac加入2倍体积新鲜人血清中,37℃分别孵育1h,2h,4h,进行纸层析,测定其放化纯。
599mTc-Smac兔血浆蛋白结合实验 新鲜兔血浆中分别加入37~74kBq99mTc-SmacA,B,C,37℃孵育1.5h,三氯醋酸沉淀法测定血浆蛋白结合率。
99mTc-Smac体外细胞实验
1细胞摄取
6孔板接种肺癌A549细胞,前列腺癌LNCap,PC-3,DU145细胞,恶性黑色素瘤A375,A875,SK,M14细胞,子宫颈癌Hela细胞,脐静脉内皮细HUVEC304细胞,常规培养24h后吸弃培养基,每3孔为1组,分别加入含74kBq99mTc-SmacA,B,C的无血清培养基2ml,37℃继续孵育10,20,40,60
和120min,收集、清洗细胞,分别测定细胞及清洗液中的放射性,计算摄取率=细胞中放射性计数/(细胞中放射性计数+清洗液中放射性计数)×
100%。
2表面等离子体共振技术测定标记物与IAP蛋白结合的Kd值
利用RT-PCR法,从恶性黑色素肿瘤细胞A375,,扩增XIAP,Survivin,LivincDNA的编码序列,克隆至pMD-T载体,DNA序列测定后再克隆到原核表达载体pGEX-2T中,转化感受态大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达获得包涵体融合蛋白,并经Western印迹鉴定。
通过超生雾化将80%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS),19%的1,2-二油酰-sn-丙三氧基-3-磷酸胆碱(DOPC)制成单层小囊泡(SUV)。
SUV的结合通过表面共振仪测定。
将SA芯片安装在仪器上,以5-μl/分的流速将SUV均匀铺在SA上以形成磷脂膜模型。
当膜表面的共振单位达到2000以上并稳定以后,磷脂膜模型即做好。
将未标记的MAG3-SmacA,B,C和99mTc标记SmacA,B,C的用HEPES-P缓冲液(0.1M的HEPES,0.15MNaCl,0.005%的P20)以及5mM的CaCl2稀释成不同的浓度,然后将50μl的蛋白注射到膜表面(固定相),随即用250μl的缓冲液洗脱(解离相)。
测量SPR角的变化监测蛋白与多肽分子间相互作用。
由SPR曲线可获得哪些分子发生了相互作用,相互作用的强度,结合和解离的速度,样品中分析物浓度,是否存在异构效应,结合位点分析,复合物中不同成分对结合的影响等。
99mTc-Smac动物体内显像的研究
动物模型的建立
将1×
106的人恶性黑色素细胞A375和前列腺癌DU145细胞接种于裸鼠的双侧后腿皮下。
肿瘤长到直径为5-7mm大小后进行裸鼠体内分布和显像的研究。
动物体内生物学分布
尾静脉注射4μg/kg的99mTc-Smac后于不同时间将小鼠杀死,分别取出脑、心、肺、肝、肾、脾、胃、小肠、肌肉、肿瘤组织、尿、大便等,分别称重,记录60s放射性计数,计算每克组织的放射性强度,得出各器官的时间放射性曲线。
血液半清除速率
尾静脉注射4μg/kg的99mTc-Smac后,分别于不同时间取血,经稀释后测定放射性计数。
画出时间放射性曲线,计算半清除时间。
4动物体内显像
SPECT显像
尾静脉注射4μg/kg的99mTc-Smac,注射前(本底)及注射后0,0.3,1,2,4,6,12,24小时,采集图像,窗宽15%,能量140KeV,采集像素为128×
128。
通过注射显像剂后不同时间显像结果分析,确定最佳显像时间。
框画ROI,分别计算每个ROI的放射性计数。
⑵评价肿瘤放化疗的疗效
将荷恶性黑色素瘤的裸鼠用2Gy/次,共7次,3周后显像,分别比较放射治疗的肿瘤与未放射治疗肿瘤内放射性强度的差异。
将荷前列腺癌LNCap、DU145的裸鼠用康士得(非甾体类的雄激素受体拮抗剂,其中LNCap为激素治疗敏感性,而DU145为激素非依赖)1mg/kg/d,治疗4~6周后显像,比较激素治疗前后放射性强度的差异,评价肿瘤治疗的疗效。
⑶组织学染色
显像后,将每只小鼠的脑、心、肺、肝、肾、脾、胃、小肠、肌肉、肿瘤组织取出,固定,石蜡包埋,做成组织芯片,XIAP,Survivin,Livin免疫组化染色。
对各组织染色阳性细胞数与体内相应组织摄取显像剂强度的相关性分析。
⑷数据分析
采用SPSS统计分析软件分析数据。
两组均数的比较用t检验,多组间的比较用方差分析,两两比较用LSD法,相关性分析采用线性相关与回归法;
P<
0.05有统计学意义
可行性分析
1.课题思路是申请者对凋亡及其凋亡相关家族进行细致深入学习和研究,参阅了大量文献,并结合自己核医学专业优势提出的。
Smac4~9肽均被证实可以和凋亡抑制蛋白中的XIAP,Survivin,Livin结合,而这些凋亡抑制蛋白又在大多数肿瘤中高表达,因此利用Smac多肽作为标记对象对肿瘤进行显像,具有很好的立论基础。
加之多肽具有组织渗透迅速、血液中清除快、免疫原性低、合成方便以及核素标记方法成熟的特性,技术上具有较高的可行性。
⒉课题组成员均是具有丰富研究经验的研究者,
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