生物医学论文生物医学ESR自旋捕集技术运用Word文档下载推荐.docx
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1.2脂类自由基捕集
脂质过氧化是一个产生自由基和自由基参与的链式反应.过去人们研究脂质过氧化一般都采用TBA(thiobarbituricacid)法检测脂质过氧化产生的最终产物之一MDA(ma-lonaldehyde),这样很难深入研究脂质过氧化的自由基机理.利用4-POBN(4-pyridyl-1-oxide-N-t-butylnitrone)自旋捕集剂在亚油酸,脂质体微粒体,突触体和红细胞膜等体系中捕捉到了脂质过氧化产生的脂类自由基(图5),研究了它们产生的机理及天然抗氧化剂对脂类自由基的清除作用机理[1-4,8-10].
1.3单线态氧的捕集
单线态氧虽然不是自由基,但是高度活性常常反应产生自由基.利用叔胺四甲基哌啶(TEMPONE)可以特异地检测单线态氧,是3条等强度的ESR谱线组成的(图6).为了证明体系中确实有单线态氧产生,往往还需要单线态氧的清除剂———胡萝卜素证明.另外,四甲基乙烯(TME)、2,5二甲基呋喃(DMF)、9,10-二苯基蒽(DPA)等也可以淬灭单线态氧,用以证实单线态氧的存在.单线态氧在D2O中的寿命要比在H2O中长10~15数量级,这也是鉴别单线态氧存在的一个重要方法.若在反应体系中加入D2O,用ESR检测单线态氧产率增大,进一步证明体系中确实有单线态氧产生[1-4,10].
1.4NO自由基的检测
NO是内皮细胞松弛因子,能够松弛血管平滑肌,防止血小板凝聚,是神经传导的逆信使,在学习和记忆过程及免疫和疾病中发挥着重要作用.NO是自由基,但由于它的自旋和轨道角动量偶合不能用ESR直接检测.有3种ESR技术可以检测溶液中的NO,一种就是传统的氮氧自由基自旋捕集NO自由基,另一种是用铁盐络合物.前者可以和NO反应生成自旋加合物自由基,对化学体系产生的NO自由基捕集效果很好,但是很难用于细胞和生物体系;
后者已经成功地用于检测体内产生的NO自由基了.我们利用血红蛋白检测到了NO自由基(图7).我们又用建立了DETC2-Fe2+络合物检测生物体内产生的NO自由基,并且用有机溶剂抽提DETC2-Fe2+络合物成功的检测了组织和培养细胞中产生的一氧化氮自由基,使ESR自旋捕捉一氧化氮自由基的灵敏度提高50~100倍(图7,8)[1,4,11-16].
1.5一氧化氮和氧自由基的同时检测
在生物体内和活细胞中,一氧化氮自由基和超氧阴离子自由基往往是同时产生的.人们过去一般是分别测定它们的产生和进行研究的,这样就会造成一定误差,同时也不方便.因此,我们实验室建立了一种利用ESR自旋捕捉技术,把体内和活细胞中产生的一氧化氮自由基和活性氧自由基(ROS)同时捕捉住并进行检测(图9).这样就可以既准确又方便地检测和研究体内和活细胞中产生的一氧化氮自由基和活性氧自由基的规律[1,4,17].
2ESR自旋捕集技术在生物医学研究中的应用
2.1炎症过程产生的自由基
炎症是机体受到外界微生物入侵后的一种保护性反应.吞噬细胞在炎症反应中起着重要作用,它们在炎症反应时吞噬细菌,受刺激活化,产生呼吸爆发,消耗氧气,活化己糖磷酸化支路,释放超氧阴离子自由基,过氧化氢和单线态氧,这些产物在杀伤入侵者的同时对正常机体组织也会产生损伤.我们用ESR自旋捕集技术直接捕捉到了活化人多形核白细胞呼吸爆发产生的活性氧自由基和NO自由基[1-6,15-16].
2.1.1巨噬细胞产生氧自由基的捕集
关于吞噬作用的生化机理研究最多的是肺巨噬细胞和血液中的中性粒细胞,因为它们可以方便地从支气管灌流液和外周血中分离得到.在吞噬一开始,它们都明显增加氧消耗,比休息状态增加10~20倍,同时,起动己糖磷酸化支路,葡萄糖消耗急剧增加,称为呼吸爆发.而氰化物不能抑制这一氧消耗,说明与呼吸链无关.呼吸爆发的启动依赖对膜的扰动,因为不仅调理化的细菌,而且小乳胶粒,调理过的酵母多糖和一些化学试剂都能诱导巨噬细胞呼吸爆发,这些化学试剂包括佛波醇(PMA),氟离子,小分子肽N-甲酰甲硫氨酰苯丙氨酸(fmet-leu-pne)和伴刀豆蛋白A等,因此呼吸爆发并不需要吞噬作用出现.我们用ESR自旋捕集技术直接捕捉到了PMA刺激多形核白细胞呼吸爆发产生的氧自由基证明在体系中产生的ESR信号主要来自PMA刺激多形核白细胞呼吸爆发产生的超氧阴离子自由基及其歧化反应生成的过氧化氢和羟基自由基(图10)[1-6].
2.1.2巨噬细胞产生一氧化氮自由基的直接捕集
在3×
107cell/mL的巨噬细胞体系中,捕集复合物(N-methyl-D-glucaminedithio-carbamate)(MGD)2Fe2+的浓度稀释到0.4mmol/L.加入100ng/mLPMA和/或0.3mmol/LL-精氨酸混合后,混合物立刻转入石英毛细管中,在ESR仪上于37℃检测,每30s记录一氧化氮ESR信号.一氧化氮捕集复合物((MGD)2Fe2+NO)给出三线峰ESR波谱,g因子为2.035,超精细分裂常数为1.25×
10-3T(图11).测量一氧化氮波谱第一条峰的高度,作为一氧化氮相对浓度[15,16].以上实验结果充分说明,PMN受到PMA刺激,在免疫反应时产生一氧化氮自由基.
2.2心脏病和自由基
心脏病是人类死亡率很高的一种疾病.缺血再灌注损伤会引起和加重人类很多严重疾病,如心脏病,中风,风湿性关节炎,运动损伤及器官的保存和移植.近来的研究结果表明,组织的缺血再灌注损伤与自由基有着密切关系.ESR自旋捕集技术在心脏病研究中的应用,特别是在心肌缺血再灌注损伤产生自由基的研究报道很多[1-4,11-14,20,21].
2.2.1缺血再灌产生氧自由基的自旋捕集
将自旋捕集剂加入再灌注液一起灌注缺血心肌,或者在缺血再灌注前注射到体内,捕捉产生的自由基,目前使用的自旋捕集剂主要是PBN.我们用自旋捕集技术研究心肌缺血再灌注产生自由基和药物对自由基的清除作用.用自旋捕集剂PBN捕捉到了大鼠心肌缺血再灌注产生的自由基.它的ESR波谱由2×
3的6条谱线组成,是由缺血再灌注产生的氧自由基及与心肌细胞膜反应产生的脂类自由基与PBN加合而成.加入SOD,金属离子络合物去铁敏可明显使这一信号减小,说明这一信号是由缺血再灌注产生的超氧阴离子自由基及羟基自由基引起的[1-3,21].
2.2.2缺血再灌产生一氧化氮自由基的捕集
一氧化氮自由基具有重要生物功能,对心血管既有保护作用又可能有损伤的“双刃剑”作用在这里体现的非常清楚.心脏病,特别是心肌缺血再灌注损伤与一氧化氮自由基的关系引起人们的广泛关注和兴趣.不仅用生理生化方法进行了研究,而且也用ESR技术研究了缺血再灌注过程产生的一氧化氮自由基.我们利用3种不同方法研究在离体和在体缺血再灌注损伤中产生的一氧化氮自由基及其作用,心肌细胞缺氧再给氧产生的一氧化氮自由基的信号转导作用,银杏黄酮和知母宁等天然抗氧化剂对一氧化氮自由基的调节作用和对心肌的保护作用[1-4,11-14,20,21].
2.3神经退行性疾病缠身自由基的研究
目前全球人口老龄化的趋势日益明显.最新人口普查表明,我国60岁以上的老年人口已达1.3亿,已提前步入老龄化社会,到2050年我国老年人口数量将达到4.39亿,占总人口的1/4.我国是在社会、经济不太发达,各地区发展水平又不平衡的情况下进入老龄社会的,这种社会矛盾将给我国带来比发达国家更多更严重的一系列医疗和社会问题.因而深入研究衰老,特别是脑衰老和其相关的神经退行性疾病,例如帕金森病、阿尔茨海默病等疾病,显得尤为迫切.从分子、细胞和在体水平上,研究与脑衰老相关的人类重大疾病的发病机理,寻求有效的预防和治疗药物和方法,不仅可以提高老年人的生活质量,减轻家庭和社会的负担,更可以为人类在新的世纪中破译脑的奥秘,最终战胜脑疾病提供重要的线索和依据.研究表明在神经退行性疾病的发病和发展过程中,自由基损伤是一个重要因素[2-4,23-31].
2.3.1帕金森综合症脑组织自由基的捕集
我们实验室利用6-OHDA诱导建立了帕金森综合症的细胞和大鼠模型,探讨茶多酚对其保护作用机制.结果发现,茶多酚可以浓度和时间依赖性减轻6-OHDA诱导产生的旋转行为,降低中脑和纹状体中ROS和一氧化氮自由基含量、抗氧化水平,增加了脂质过氧化程度、硝酸盐/亚硝酸盐含量、蛋白结合硝基酪氨酸浓度,同时还降低nNOS和iNOS表达水平.TH免疫染色和TUNEL染色表明,茶多酚预处理可增加黑质致密部存活神经元,减少凋亡细胞.实验结果证明,口服茶多酚可以有效保护脑组织免于6-OHDA损伤引起的神经细胞死亡,其保护作用可能是通过ROS和一氧化氮自由基的途径实现的[23-25].
2.3.2中风脑组织自由基的捕集
中风的死亡率仅次于心脏病和癌症,列于死亡病因的第3位,同时中风还是成年人最主要的致残性疾病.我们建立沙鼠半脑缺血再灌注损伤中风大鼠模型,利用ESR技术研究了中风的自由基机制和山楂黄酮对沙鼠脑缺血再灌注损伤保护作用的一氧化氮自由基调节机理,发现山楂黄酮对沙鼠脑缺血再灌注损伤有很好的保护作用,而且与一氧化氮自由基关系密切[26].
2.3.3老年痴呆症脑组织自由基的捕集
我们利用Aβ诱导海马神经元凋亡和转APP基因AD小鼠模型研究中发现有大量活性氧和一氧化氮自由基产生,同时iNOS表达增加,与氧化应激相关信号途径NFB和MAPK激活.利用ESR方法,研究了转基因鼠海马和皮层区的NOS酶的活力和产生的一氧化氮自由基,结果发现在尼古丁处理的转基因鼠组,海马和皮层区的NOS酶的活力显著下降,而且在这2个脑区,活性氧和一氧化氮自由基的含量也有显著下降[27-31].
2.4辐射损伤产生自由基的研究
自20世纪40年代始,由于在日本广岛和长崎2颗原子弹的爆炸和大规模的核试验,造成了大量人群的辐射损伤.很多国家都开展了这方面的研究,使放射生物学的研究有了长足的进步.用EPR技术发现了电离辐射对机体作用会生成自由基,由此建立了机体电离辐射损伤的自由基学说,成为辐射生物学效应的重要理论,同时也成为自由基生物学与医学最早被人们关注的领域,这对推动自由基生物学与医学的发展起了重要的作用[53-57].
2.4.1辐射治疗和氧自由基
辐射可以致癌,但辐射也可以治疗癌症,而且是一个重要方法.这种方法就是用高能辐射照射肿瘤以杀伤肿瘤细胞,为了提高疗效近年来又使用了敏化剂.用ESR技术发现氧自由基在放疗中发挥着重要作用.辐射产生的羟基自由基进攻细胞靶分子(RH)常常包括抽氢和形成次级自由基(.R),如果这些次级自由基不能被氢供体很快修复,就会与氧气反应产生过氧自由基(ROO.)和脂自由基(.L),这就是脂质过氧化链式反应,同时还可以破坏蛋白质和其它化合物的巯基[32-34].
2.4.2辐射敏化剂和氧自由基
辐射敏化剂是一种化学试剂,它具有增强辐射对肿瘤的杀伤作用.我们用EPR技术研究了光照血卟啉同脂质体膜的相互作用,发现光照血卟啉可以使脂质体膜通透性明显增加,红外激光和紫外激光增加更明显,紫外激光比红外激光作用更大.光照血卟啉可以使脂质体膜中脂肪酸自旋标记物ESR信号减小,说明发生了电子转移.光照血卟啉还可以使脂质体膜磷脂分子有序度稍有下降[32,33].光动力疗法(PhotodynamicTherapy,PDT),又被称为光辐照治疗(PhotoradiationTherapy,PRT)或光化学疗法(Photochemotherapy).我们建立的活性氧和一氧化氮同时捕集的方法,检测了光照30min后细胞内活性氧和一氧化氮的水平,光照以后可以使细胞内活性氧和一氧化氮均显著增加,其中活性氧增加最为明显,说明光动力反应产生的单线态氧氧化细胞内蛋白和不饱和脂肪酸,从而显著增加细胞内活性氧水平[34].
2.5吸烟中产生的自由基中的捕集
目前我国有3.5亿烟民,并且还有继续增加的趋势.流行病学调查表明吸烟不仅可以引起支气管和肺损伤,而且可以导致人类最可怕的疾病癌症和死亡率最高的心血管疾病.过去人们一直认为吸烟的毒性来自尼古丁,但这是错误的.吸烟是一个很复杂的燃烧过程,在吸烟的气相和焦油中存在大量自由基,它们可以直接和间接攻击细胞成分,可能是引起各种疾病的重要原因.点燃过程中产生的大量有害气体,毒性最大的就是自由基,焦油和一氧化碳,其中亚硝胺和苯荓芘是焦油中致癌性最强的两种物质.我们建立和发展了用ESR技术检测吸烟产生自由基的方法.因为吸烟产生的自由基分布在焦油和气相中,它们的性质差别很大,焦油中的自由基比较稳定,可以直接用ESR测定,气相中的自由基活泼,不稳定,不能用ESR直接测定,采用自旋捕集技术测定[35-38].
2.5.1吸烟焦油中的自由基
吸烟的焦油是吸烟烟气中颗粒大于0.1μm的物质,其中包括几种特别稳定的自由基,可以用电子自旋共振波谱仪(ESR)直接观察到.通过ESR波谱分析,发现它们主要来自醌/半醌自由基(Q./QH.),多环芳烃自由基,碳和磷自由基,后3者的浓度在焦油中比较低,只占15%,特别是最后2个就更低.每支烟焦油中自由基的浓度大约为6×
1014个自由基.多环芳烃自由基是一类直接致癌物,其ESR信号不宜饱和但在室温不宜观察到.焦油中的主要自由基成分是Q./QH.,大约占85%,其ESR信号很容易饱和,在低温很容易观察,这是一类非常重要的自由基,很容易自氧化产生氧自由基,从而导致一系列毒理反应.
2.5.2吸烟气相中的自由基
吸烟气相中的自由基多是瞬时不稳定自由基,不能用ESR波谱仪直接观察,需要用自旋捕集技术.我们用自旋捕集剂PBN和DMPO捕捉到了吸烟气相的自由基,其中主要是烷氧基(RO.)和烷类(R.)自由基.这些自由基是在吸烟燃烧形成的气流在流行过程中不断形成的,吸烟气相中的自由基多是瞬时不稳定自由基,主要是一氧化氮、二氧化氮、烷氧基(RO.)和烷类(R.)自由基.这些自由基是在吸烟燃烧形成的气流在流行过程中不断形成的,首先含氮物质在吸烟燃烧时氧化生成大量NO,遇氧生成反应性更强的NO2自由基,它可以和吸烟燃烧生成的烯类物质反应生成烷类自由基R.,R.可以和O2反应生成烷过氧自由基ROO.,ROO.又可以和NO反应生成烷氧自由基RO..这些自由基遇到细胞成分就会发生反应,不仅与细胞膜发生脂质过氧化反应,还可以氧化蛋白质和核酸.正是由于自由基的高反应活性,对细胞的损伤作用,就是他引起各种疾病的重要原因.
2.6在植物抗病和感病作用研究中的应用
动物系统研究表明一氧化氮自由基和活性氧在免疫反应中发挥着重要作用.最新研究发现一氧化氮自由基作为活性氧的合作者启动植物的保护基因和过敏坏死反应.一氧化氮自由基和活性氧在植物抗病反应中起着极其关键的作用.单独活性氧还不足以导致细胞死亡,一氧化氮自由基的介入和协调才可引起植物感染部位细胞的死亡,从而引起过敏坏死反应.本实验室自2000年开始就着手利用电子自旋共振研究一氧化氮自由基在植物免疫反应中的重要作用,取得了一些进展[39-41].
2.6.1ESR自旋捕集技术检测植物产生的ROS和一氧化氮自由基捕集方法的建立在植物中检测一氧化氮自由基与动物组织中检测有相同之处也有不同之处,相同的是原理,不同的是方法.我们仍采用ESR自旋捕捉技术的原理,因为植物与动物的一个明显区别是植物细胞有细胞壁,而动物则没有.植物与动物另外一个不同的是其根、叶茎分离后可以在相当长时间维持正常生理状态,这为体内检测自由基带来极大方便.我们建立和发展了测定植物体系产生一氧化氮自由基的方法,有直接方法和间接方法,有离体的也有在体的,这些方法为研究植物体系产生一氧化氮自由基的规律及其在植物抗感病和植物免疫反应的机理发挥了重要作用[39,41].
2.6.2一氧化氮自由基在小麦条锈病抗感过程中的作用机理条锈菌引起的小麦锈病是世界上许多地区小麦的重要病害.利用抗病品种是防治小麦锈病的主要措施.我们利用ESR技术研究的内源一氧化氮自由基与小麦不同抗性类型的关系,发现一氧化氮自由基启动的时间点和强度是决定抗病类型的关键因素;
同时利用外源一氧化氮自由基和寡糖素对小麦抗条锈性的诱导,证明了在小麦的过敏性坏死反应(HR)中一氧化氮自由基与毒性病原菌信号的协同作用以及诱导抗性中一氧化氮自由基的时间进程与低反应型抗性中一氧化氮自由基时间进程的一致性.通过分光光度法和蛋白印迹法分析了一氧化氮自由基的来源,并对一氧化氮自由基的多种来源进行了研究[39].
2.6.3亚硝酸还原酶是高等植物一氧化氮自由基的重要来源在动物体,一氧化氮合酶几乎是一氧化氮自由基的唯一来源,但是在植物中一氧化氮自由基的来源就复杂的多,而且还有争论.我们利用ESR技术研究了高等植物中一氧化氮自由基的来源,结果表明硝酸还原酶活性是在2个水平上控制的,
(1)硝酸还原酶基因表达控制硝酸还原酶蛋白水平;
(2)蛋白调节硝酸还原酶活性.这些结果表明小麦苗中产生的一氧化氮自由基主要是通过硝酸还原酶催化产生的,但是这并不是唯一途径[41].
2.7ESR自旋捕集技术在抗氧化剂及药理学研究中的应用
中药是中华几千年医药实践总结出来的,是我国历史的瑰宝,对保障中华儿女身体健康发挥了重要作用.尽管很多中药治病的机理还不清楚,但是其医疗效果是明显有效的.在中医药现代化过程,如何研究和解释中药治病的机理就是一个重要内容.我们利用ESR自旋捕集技术研究发现,很多中药,特别是中草药的有效成分都是天然抗氧化剂,例如五味子、黄芩、丹参等的药理学及其有效成分对氧自由基清除作用和对细胞成分的保护作用.
2.7.1五味子药理学作用
五味子的有效成份包括一组五味子素,主要有五味子酚(Sal),五味子醇甲(SolA),五味子甲素(SinA),五味子乙素(SinB),这些结构不同的五味子素具有不同的药理作用.为了探讨它们药理作用不同的根源,我们用自旋捕集技术研究了不同结构五味子素在不同体系中对氧自由基的清除作用,结果发现,结构不同的五味子素对氧自由基的清除作用不同.五味子醇甲和五味子乙素对PMA刺激多形核白细胞呼吸爆发产生的氧自由基的ESR波谱有明显清除作用,五味子乙素对这一细胞体系产生的氧自由基的清除作用比五味子醇甲强,它们对氧自由基的清除能力大于维生素E,但小于维生素C[42,43].
2.7.2黄芩甙及其铜锌络合物药理作用
黄芩含有丰富的黄酮类化合物.黄芩甙在临床上主要用于抗菌消炎和抗感染.黄芩甙及其铜锌络合物对氧自由基的清除作用,对羟基和超氧阴离子自由基清除的速率常数和对血红蛋白损伤的保护作用.用光照核黄素体系产生超氧阴离子自由基,这3种物质都不同程度清除了该体系产生的超氧阴离子自由基,其中黄芩甙铜络合物清除能力最强,黄芩甙锌次之,黄芩甙最弱.锌离子对该体系产生的超氧阴离子自由基没有影响,铜离子可使该体系产生的超氧阴离子自由基转化成羟基自由基.发现黄芩甙及其铜锌络合物对氧自由基引起红细胞膜损伤有明显的保护作用[44,45].
2.7.3在研究山楂黄酮的抗氧化和健康作用中的应用
山楂黄酮是目前我国唯一一个取得药字号的黄酮类药物,我们利用电子自旋共振波谱技术检测了山楂黄酮对自由基的清除作用,发现山楂黄酮对Fenton反应产生的羟基自由基有很强的清除作用,是银杏黄酮的1.3倍,但比维生素C稍弱;
对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶体系产生的超氧阴离子自由基有非常强的清除作用,是维生素C的大约2倍,是银杏黄酮的大约18倍;
山楂黄酮对过氧亚硝基也有很强的清除作用,是维生素C的大约1.4倍,比银杏黄酮的弱一些.并可以清除线粒体膜脂质过氧化产生的脂类自由基,这无疑是山楂黄酮具有以上药物功能的重要基础[26].
2.7.4在研究丹参酮抗氧化途径及其对心脏病的治疗作用机理中的应用
丹参、复方丹参和丹参酮已经广泛用于临床治疗各种疾病,特别是心脏病,效果显著.我们利用ESR自旋捕集技术研究了丹参酮作抗氧化剂治疗心脏病和防止阿霉素毒性的机理,发现丹参酮对这一体系产生的超氧阴离子自由基清除率还是比较明显的,而且有明显的剂量依赖关系,但检测不到丹参素和丹参酮对Fenton反应产生的羟基自由基的清除作用.发现丹参酮对起动脂质过氧化的活性氧自由基的清除能力并不强,但对脂质过氧化过程中的脂类自由基有较好的清除效果.发现鱼藤酮,抗霉素A阻断线粒体呼吸链产生的自由基主要是羟基,用KCN阻断线粒体也得到羟基自由基.丹参酮对心肌亚线粒体产生的羟基自由基的初始强度没有什么作用,但显著加速所测试的自由基信号的衰减[46,47].
2.8植物光合系统中产生活性自由基
高等植物叶绿体在光合作用过程本身就是一个电子转移和容易产生自由基的过程,又因叶绿体在光合作用过程中处于富氧环境而极易受到氧化损伤.当光照过强或光能利用率过低时,活性氧都有可能大量产生.而这些活性氧对蛋白、膜脂和色素分子都具有破坏作用.因而,深入研究活性氧所诱导的光合作用抑制机理对于如何减缓植物细胞的强光破坏,进而提高植物的光合作用效率具有重要意义.因此很早人们就一直研究叶绿体在光合作用过程产生的自由基,主要是在光系统2(PSII)内发现了大量的超氧阴离子自由基,但是,由于捕捉剂性能的限制对超氧阴离子自由基捕获一直不很理想,直至新一代高效自由基捕捉剂DEPMPO的出现之后,文献中才报道了关于水稻叶绿体PSII颗粒中捕获超氧阴离子自由基的可靠证据[48,49]
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