胰腺干细胞的分子标志及其取得途径Word格式.docx
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nestin是在神经干细胞中发觉的一种中间丝蛋白,已被确认是神经干细胞的分子标志。
2000年Hunziker等[3]第一报导4周龄的小鼠胰岛内存在nestin阳性细胞。
他们由nestin阳性胰腺导管上皮样细胞诱导分化取得胰岛细胞的一个亚群,以为nestin是胰岛干细胞的一个分子标志物,其作用可能是增进胰腺内分泌干细胞的分化。
在16d小鼠胚胎的胰岛细胞团中nestin很丰硕,并普遍存在于60d小鼠的胰岛和胰腺导管,且nestin阳性的细胞在体外培育8个月后仍具有增生能力。
最近,Kedees等[4]依照胰高血糖素信号能操纵nestin的表达的原理,通过度析小鼠胰腺上皮祖细胞和胰腺外分泌细胞的胰高血糖素信号,结合免疫组织化学染色和mRNA检测,最终确信nestin确实在胰腺上皮细胞中表达,以为nestin能够作为胰腺干细胞的标志物。
Bernardo等[5]通过用增强绿色荧光蛋白技术(EGFP)结合免疫组织化学染色方式和RTPCR技术来分析转基因小鼠nestin阳性胰岛细胞,结果显示nestin阳性胰岛细胞具有多向分化的潜能,体外培育条件下可分化为胰腺内、外分泌细胞。
说明胰岛nestin阳性细胞是胰腺干细胞,nestin是胰腺干细胞的重要分子标志物。
胰腺十二指肠同源盒1(PDX1)
人PDX1蛋白由283个氨基酸组成,相对分子质量为31×
103D。
在成年胰腺组织中,PDX1仅存在于胰岛中分泌胰岛素的B细胞和分泌生长抑素的D细胞上。
在胚胎发育进程中,PDX1最先在时即显现于原肠胚胰芽萌生处,继而胰芽萌出,发育成胰腺。
PDX1纯合缺点的小鼠胚胎不能形成胰腺组织,杂合缺点小鼠诞生后将进展为糖尿病。
在胰岛再生进程中,老是先有PDX1的表达,再有胰岛的新生。
在胰腺发育的初期,胰腺内、外分泌细胞上均有PDX1表达。
发育成熟后,PDX1仅在胰岛B细胞和D细胞中显现[6]。
在胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的体外诱导进程中也发觉,在胚胎干细胞时期和分化的初期(拟胚体)时期均无PDX1的表达。
通过特异性诱导以后,显现PDX1的表达,然后有胰岛素分泌细胞显现[7]。
在胰腺导管上皮细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导进程中,也是先有PDX1表达,再有胰岛素分泌细胞显现[8]。
因此,PDX1是胰腺干/祖细胞的特点性标志之一。
细胞角蛋白19(CK19)
CK19是细胞角蛋白的片段,是上皮细胞骨架的一种中间丝状物,是一种酸性蛋白。
在胰腺发育进程中,胰腺内分泌细胞来源于角蛋白阳性的内胚层上皮细胞,有高水平的角蛋白表达。
Feng等[9]从胎猪胰岛取得导管上皮细胞中分离取得表达CK19的细胞,其体外的生长行为有类似胚胎干细胞样生长形态,细胞体外增殖活力很强,现已传至18代,细胞经诱导后分化为分泌胰岛素的胰腺内分泌细胞,而且伴随着细胞超微结构的改变。
最近,Chen等[10]通过研究证明人的胰腺导管上皮细胞表达CK19阳性,是胰腺干细胞的要紧来源,并证明这种CK19阳性细胞能诱导分化为胰腺的内分泌细胞。
因此说明CK19也是胰腺干细胞的重要分子标志。
ABCG2
ABCG2是ABC转运蛋白(ATPbindingcassettetransporter)家族成员ABCG2/Bcrpl。
这种蛋白的功能目前还不清楚,但有人以为可能属于细胞膜上的泵蛋白,和多药耐药基因MDR相似。
膜上表达ABCG2的细胞能够把进入细胞的荧光染料hoechst33342泵出细胞,使细胞内的核酸不被染色,细胞呈现微弱的兰色荧光。
在流式细胞仪检测时,这些细散布于要紧细胞的一侧,因此被称为侧群细胞(sidepopulation,SP细胞)。
SP细胞最先在作造血干细胞研究时被发觉,后来发觉包括肿瘤在内的多种组织中都有SP细胞,是一类原始幼稚的未分化细胞[11]。
来源于胰腺的SP细胞具有形成胰岛样细胞团的能力,也能够视为胰腺干细胞。
但ABCG2不仅限于在胰腺组织中表达,可能是所有干细胞共有的一个“通用标志”[12]。
咱们正在进行的实验发觉,从人胚胎胰腺取得的细胞通过纯化扩增后,在流式细胞仪检测时86%以上的细胞都能够表达ABCG2。
这些细胞有很强的增殖能力,在体外能被诱导形成具有胰岛素分泌功能的类胰岛样结构——胰岛样细胞团(资料待发表)。
胰腺干细胞的其它分子标志物
已知胰腺干细胞的标志物还有神经元蛋白3(Ngn3)、波形蛋白(Vimentin)等[1314],或许还有很多的标志物尚未被发觉,挑选胰腺干细胞的标志物的新方式也还在不断探讨当中。
由于胰腺干细胞标志物的多样性,在确信胰腺干细胞时,需多种标志物综合考虑才能确信。
2胰腺干细胞的取得
作为一种存在于已分化组织中的成体干细胞,自然状态下的胰腺干细胞只存在于胰腺组织,主若是胰腺导管、胰岛和胰腺腺泡中。
由于干细胞的多向分化特性,在特定情形下其他组织的多能干细胞也可能“转分化(transdiffetentiation)”为胰腺干细胞。
因此,取得胰腺干细胞的方式主若是从胰腺组织中分离或从其他多能干细胞“转分化”而来。
胰腺导管
绝大多数研究者以为,胰腺干细胞存在于胰腺的导管中。
Ramiya等[15]最先报导从分离的小鼠胰腺导管培育中取得了胰腺干细胞,在体外培育条件下传代了3a。
该细胞可培育分化为胰岛样细胞团,将该细胞团移植到NOD鼠(nonobesediabeticmice,非肥胖型糖尿病鼠)可显著降低其血糖,能够逆转NOD鼠的糖尿病病症。
最近,乔海等[16]从胎儿胰腺中采纳胶原酶消化法分离出胰岛样细胞团(ICCs),并对其进行贴壁培育,从中纯化分离出具有自我更新能力的上皮样细胞,为导管来源,免疫组织化学染色显示其表达胰十二指肠同源异型盒基因1(PDX1)、CK1九、神经Nestin,不表达胰岛素,具胰腺干细胞特性。
胰岛
胰腺干细胞存在于胰岛本身愈来愈受研究者关注。
Yang等[17]从大鼠胰腺中采纳胶原酶V消化法分离出胰岛样细胞团,依照胰岛细胞的纯度分为3个品级组,A为低品级±
%,B为中品级±
%,C为高品级±
%。
然后提取细胞RNA,再进行RTPCR测定细胞的CK19和PDX1的表达,结果显示不同纯度的胰岛中均有CK19及PDX1蛋白和mRNA的表达,说明在纯化胰岛中均有胰腺干细胞存在。
胰腺腺泡
有些研究者以为胰腺干细胞也可能存在于胰腺腺泡中。
Ku等[18]报导胰腺腺泡中也存在胰腺干细胞,尽管数量较少,但其诱导后产生β细胞的比例高于导管中的胰腺干细胞,在葡萄糖刺激反映中分泌胰岛素的量更大。
多能干细胞的“转分化”
胚胎干细胞(ESC)和胚胎生殖嵴干细胞(EGC)是目前发觉的具有“全能性”的干细胞。
自2000年有胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞(insulinproducingcell,IPC)的报导以后,ESC在糖尿病医治中的研究一直是干细胞研究的热点。
咱们也成功将ESC诱导成了IPC,优化了实验条件,简化了实验方式,缩短了诱导时刻,在STZ诱导的糖尿病小鼠的实验性医治中取得了初步疗效。
但所能取得的IPC数量太少,胰岛素分泌功能差是目前存在的要紧问题[19]。
EGC是从胚胎内胚层迁移到胚胎生殖嵴中的原始细胞,保留了与ESC相似的“全能性”,能够分化为肝细胞、心肌细胞、血细胞、神经细胞等多种组织细胞,但目前尚未EGC分化为IPC的报导。
骨髓间充质干细胞在体外诱导情形下能够分化为IPC。
由于骨髓间充质干细胞相对容易取得,其最大优势还在于取自自身的骨髓间充质干细胞用于自体移植时可排除免疫排斥那个器官移植的最大难题,因此骨髓间充质干细胞被以为是最有应用前景的IPC来源[20]。
十二指肠、空肠上段组织中的“K”细胞在体外有很强的增殖分化能力,也能够转分化为IPC[21]。
在某些情形下,肝脏组织中能够看到胰腺组织的“化生”现象,说明肝脏中也有能分化为胰腺组织的细胞。
在胚胎发育上,肝脏、胰腺和小肠的同源性很高。
因此,从理论上来讲,这些组织中残留的干细胞是最有可能转分化为胰腺组织的,但目前为止尚未看到从肝、肠干细胞转分化为IPC的报导。
3胰腺干细胞的分离及纯化
胰腺干细胞的分离及纯化方式要紧包括:
(1)胶原酶解离法(多用V型胶原酶)结合密度梯度离心分离技术;
(2)离解组织法:
包括机械分离法(组织研磨、过滤等)与酶分解法;
(3)利用细胞表面的分子标志分离纯化,包括免疫溶解法、流式细胞结合荧光激活细胞分选术(FACS)、平面黏附分离法及免疫磁珠分选技术。
胶原酶解离结合密度梯度离心分离技术法
在酶学方式解离的方式中,经常使用的技术包括用胰蛋白酶消化、胶原酶消化等。
用酶学方式抵达部份分离纯化的要紧依据是不同的组织的细胞和间质的组成不同。
而利用细胞体积和密度进行分离纯化的技术均基于沉降作用。
其大体原理是,在离心力的作用下,细胞在必然介质中的沉降速度与细胞的体积及细胞密度和其周围介质密度之差成正比。
细胞的体积越大,其与分离介质的密度差越大,那么细胞的沉降速度就越快。
对与特定的待分离细胞来讲,其体积和密度是固定的,能够选择的只是具有必然密度与黏度的分离介质。
使之沉降的细胞密度应该比介质大,而使之漂浮的细胞的密度那么应比介质小。
因此,实施沉降技术分离细胞的关键在于选择密度梯度形成介质,故沉降技术也称为密度梯度离心技术。
陈维平等[22]用V型胶原酶消化小鼠胰腺组织(湿重),结合自然沉降技术形成不持续密度梯度离心。
别离从磷酸盐缓冲液/g/LPercoll液(第一界面)、g/LPercoll液/g/LPercoll液(第二界面)、g/LPercoll液/g/LPercoll液(第三界面)搜集细胞。
各界面细胞均加入含体积分数为胎牛血清的DMEM低糖培育基,置于经多聚赖氨酸处置的培育瓶中常规培育。
最终从胰腺内、外分泌部的组织中能成功获取胰腺干细胞特异性标志Nestin表达阳性的干样细胞。
最近,Noguchi等[23]采纳胶原酶消化小鼠胰腺组织,结合自然沉降技术形成不持续密度梯度离心,通过双硫腙染色技术和在显微镜下将消化后的胰岛细胞从多种细胞悬液中挑出来,剩余的细胞继续培育及诱导分化,最终能够取得分泌胰岛素的细胞。
因此,这种方式能够以为是一种专门好的分离胰腺干细胞的方式。
离解组织法
机械分离与酶学解离是将组织分散成单细胞经常使用的方式。
王贝斌等[24]无菌搜集胎猪胰腺,置于预冷的PBS中冲洗并除去周围的脂肪、筋膜等,后剪为组织块,加入两倍体积的胰酶,于37℃消化10min。
期间不时振荡,终止消化后过200目筛网,离心,并清洗2次。
细胞接种于12孔板,加入培育液(RPMI1640加入10%FBS、丙酮酸钠、β巯基乙醇、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、青链霉素),置于37℃,95%空气,5%CO2,饱和湿度培育箱中培育。
其实验方式要紧将搜集的胰腺经胰酶消化筛网后直接接种于培育板,免去了以往的利用密度梯度离心分段搜集不同细胞的繁琐程序,一样取得了能够多次传代的胰腺干细胞,用该方式已取得4株猪胰腺干细胞。
其它利用细胞表面的分子标志分离纯化的方式
流式细胞仪(FCM)是一种将流体喷射技术、激光技术、空气技术、射线能谱术及电子运算机等技术与显微荧光光度计紧密结合的仪器。
流式细胞技术(flowcytometry)确实是应用FCM检测、分析生物颗粒(包括细胞)的物理和(或)化学特性或借助这些特性进行分离纯化的技术。
分选细胞为流式细胞术应用的一个重要方面,它是用FCM将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来,取得高纯度的细胞制剂,以进行有关活细胞的特性及其功能的各类研究。
用荧光染料分离细胞的流式细胞仪也称荧光激活的细胞分选术(FACS)。
最近,Lin等[25]从成年人胰腺导管组织中分离纯化取得细胞后,对该细胞的细胞表面分子标志物PDX1和Nestin进行荧光染色,即以荧光抗体与细胞表面标志结合,然后用FCM进行分选。
最终分离出PDX1和Nestin表达阳性,具有胰腺干细胞的特性的细胞。
4胰腺干细胞研究存在的问题与展望
胰腺干细胞的研究起步较晚,但最近几年来进展迅速。
将ESC、骨髓间充质干细胞等在体外诱导分化为具有胰岛素分泌功能的胰岛样细胞团试用于糖尿病的实验性医治,为糖尿病的干细胞医治展现了良好的运用前景。
能够预见,除基因医治之外,干细胞移植医治最可能取得冲破的确实是内分泌疾病,其中受益最大的将是发病日趋增多的糖尿病。
但从目前情形看,糖尿病的干细胞医治从基础走向临床,还有相当长的路要走。
要紧问题是:
(1)ESC直接用于移植将会形成畸胎瘤。
先在体外将其诱导分化为具有胰岛素分泌功能的IPC后用于移植,能够幸免肿瘤形成。
但IPC是功能成熟的细胞,其寿命必然是有限的。
当这些移植的IPC“寿终正寝”之时,也将是疗效消失怠尽之日。
这显然有悖于咱们的初衷。
目前为止尚未人系统全面地观看IPC移植后在受者体内的排斥、存活、增殖和分化情形,因此干细胞医治的有效性和平安性都还有待证明。
(2)从胰腺外组织的干细胞诱导分化来的IPC,其胰岛素分泌功能较差,仅大约相当于正常胰岛β细胞的1/50左右,还难于一次性取得足足数量的可供移植用的IPC。
由于这些IPC数量少、功能差,因此难当大任,疗效有限。
(3)IPC的诱导方式复杂,诱导时刻长(4~5周),本钱高,效率低。
长时刻的体外操作更增加了结果的不确信性。
(4)来源于异体组织的干细胞分化来的IPC用于移植,仍然存在器官移植的最大难题——移植排斥。
与一般的器官移植不同的是,经常使用的抗排异药物对IPC有毒性作用,不能长期运用,不然IPC将显现药物积存中毒。
因此,IPC的抗移植排斥问题比其他器官移植更复杂。
(5)胰腺不像骨髓那样易于再生、易于取得,胰腺干细胞来源严峻匮乏,这是制约其临床运用的最大问题。
如何寻觅可替代的胰腺干细胞来源,是目前最为紧迫的问题。
(6)目前对胰腺干细胞的特点性标志、增殖分化潜能、体内存活情形、移植排斥等情形都了解不多,难于有效地纯化扩增胰腺干细胞。
从目前资料来看,胰腺组织来源的干细胞诱导生成的IPC,其胰岛素分泌功能比非胰腺来源者好,应用价值更大。
但正常情形下没有取得胰腺组织的可能性。
从流产胚胎取得胰腺干细胞是目前唯一途径。
这除数量有限外,伦理问题是最大障碍。
即便能够取得,胚胎期几克重的胰腺组织中存在的少量胰腺干细胞,关于等待移植的成年个体来讲,简直确实是无济于事。
如何有效分离纯化、大规模体外扩增这些稀有的种子细胞,是稀缺资源有效利用的最正确途径。
2006年,诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPS)的发觉[26],为干细胞的应用带来曙光。
除传统领域的干细胞“转分化(transdifferentiation)”和利用核移植技术使细胞“重编程(reprogramed)”外,成熟细胞“去分化(didefferentiation)”技术能使成熟细胞“返老还童”,成为有多向分化能力的干细胞。
这项技术的显现,不但能克服伦理限制,还能克服组织工程种子细胞来源匮乏和移植排斥几大难题,是再生医学的希望之光。
随着iPS技术的成熟完善和胰腺干细胞研究的深切,在特定组织细胞内导入操纵IPC分化的基因,使这些细胞向IPC分化以替代病损的胰岛细胞,将可能使糖尿病那个严峻危害人类健康的顽症完全治愈。
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