微生物限度检查方法验证方案Word格式文档下载.docx
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微生物验证实施小组主要成员:
部门
姓名
职位
验证领导小组审查汇签:
职务或岗位
签字日期
企业负责人
经理
生产部
设备部
QC主管
QA主管
物料部
1.概述
药典微生物限度检查法中要求在建立药品的微生物限度检查法时,应进行方法的验证,以证明所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查。
所以对感冒灵颗粒微生物限度检查进行方法的验证。
2.目的
为了保证检验质量,对所用的检验方法必须经过验证,才能确保检验结果的准确可靠。
3.适用范围
本方案适用于感冒灵颗粒微生物方法学的确认与验证。
4.验证人员职责
4.1.验证小组:
组长:
质量管理部经理
成员:
QC主管、微生物操作人员
4.2.职责及分工:
QC主管组织起草该验证方案,并组织实施该方案;
微生物操作人员具体实施该方案;
质量管理部经理协助和监控该方案的实施。
4.3.验证方案批准后,应进行培训。
由验证小组指定人员负责对小组成员及和验证有关的人员进行培训。
5.验证依据
中国药典2015年版通则“1105”、“1106”
6.感冒灵颗粒微生物限度检验方法验证风险分析
序号
项目
潜在的风险分析
潜在的失败后果
原因分析
严重程度
发生频次
风险等级
措施结果
采取的措施
1
验证方案编写人员
编写人员未按照《ZYCWJ-SOP-10008-01微生物限度检查法标准操作规程》编写方案。
验证方法错误,导致验证结果不可靠。
人员培训考核不到位
F2
P3
ALARP
对验证编写人员进行培训和考核,合格后方可编写
P5
ACC(可接受)
2
试验人员
试验人员未按照编写的验证方案进行操作
操作不正确,导致试验结果不可靠
按照验证方案进行培训,培训合格后方可操作
3
培养箱、净化工作台
仪器未经校验或不在校验期内。
导致检验环境和培养环境不符合要求,最终导致验证失败。
使用人员使用前未对校验期进行检查
设备人员使用前对设备进行检查。
F3
4
干热灭菌烘箱、压力蒸气锅
导致试验结果出现异常。
5
对照培养基、检查用培养基、检定菌
对照培养基、检查用培养基、检定菌失效
导致验证失败
使用前未对对照培养基、检查用培养基、检定菌有效期进行核查。
对管理人员进行培训,严格按照《ZYCWJ-SMP-10020-00培养基及检定菌管理规程》进行管理,使用前使用人对有效期进行确认。
6
培养基、缓冲液、消毒剂
培养基、缓冲液、消毒剂配制不正确
严格按照标准要求制备缓冲液和消毒剂
对实验人员进行验证培训
7
灭菌器具、洁净服
已灭菌器具和洁净服过效期
使用前未对已灭菌器具和洁净服有效期进行确认
使用前对已灭菌器具和洁净服有效期进行确认
8
验证方法不正确
1、验证方案编写不正确;
2、未严格按照验证方案开展验证工作
验证方案未经批准
对验证方案进行审核
9
控制菌检验结果不合格
实验组无菌落生长,供试品可能有抑菌性
1、供试品可能对试验菌存在抑制作用
2、检验员判断失误。
采用培养基稀释法消除抑菌性
10
实验组菌种回收率不达标
各试验组回收率低于或高于标准范围
2、检验人员计数错误。
11
样品储存环境
样品储存环境、温度异常。
导致样品被污染或失败
样品存放不当
严格控制样品存放环境的温湿度
12
洁净区环境
1、洁净区温湿度、压差异常
2、洁净区环境被污染
1.洁净区温湿度、压差控制不当
2.未定期对洁净区进行清洁和消毒;
3.未定期监测洁净区的环境
1.每天定期监察洁净区的温湿度;
2.按照SOP规定对洁净区进行消毒;
3.严格按照《洁净度监测管理规程》对洁净区环境进行监测。
6.1结果分析:
通过以上采取的措施,风险均控制在可接受范围内。
7.人员培训确认表
培训时间
培训内容
培训对象
培训地点
培训讲师
主办部门
被培训人员签名
姓名
部门及岗位
设备部经理
设备管理员
生产部经理
质量管理部QC检验员
8.验证方法
6.1仪器及设备名称
仪器及设备名称
型号
生产厂家
是否校验
备注
生化培养箱
是□否□
恒温培养箱
净化工作台
超净工作台
立式压力消毒器
立式压力灭菌器
6.1验证用样品:
感冒灵颗粒规格:
批号:
感冒灵颗粒规格:
6.2.验证用培养基:
胰酪大豆胨琼脂培养基生产厂家:
批号:
配制批号:
沙氏葡萄糖琼脂培养基生产厂家:
配制批号:
营养琼脂培养基生产厂家:
胰酪大豆胨液体培养基生产厂家:
批号:
麦康凯液体培养基生产厂家:
麦康凯琼脂培养基生产厂家:
6.3验证用菌种:
金黄色葡萄球菌(CMCC(B)26003)、大肠埃希菌(CMCC(B)44102)、枯草芽孢菌(CMCC(B)63501)、白色念珠菌(CMCC(F)98001)、黑曲霉菌(CMCC(F)98003)
6.4菌液制备:
6.4.4取经30℃~35℃培养18~24小时的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌营养肉汤液体培养物1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5~10-7为不大于100cfu/ml备用。
6.4.2取经20~25℃培养2~3天的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml,加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5为不大于100cfu/ml备用。
6.4.3将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上,20〜25℃培养5〜7天,使大量的孢子成熟。
加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液,将孢子洗脱。
然后,采用适宜方法吸出孢子悬液无菌试管内用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液依次稀释至,制成每1ml
含孢子数小于100cfu
的孢子悬液。
6.4.4上述菌悬液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用;
若保存在2~8℃,可在24内使用。
6.5供试液制备:
取样品10g,加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,为1:
10供试液。
7.计数方法的验证:
7.1需氧菌、霉菌及酵母菌计数(平皿法)
所加菌液的体积不得超过供试液体积的1%。
为确认供试品中的微生物能被充分检出,首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性检查。
7.2试验组
取上述制备好的供试液,加入试验菌液、混匀,使每1ml供试液或每张滤膜过滤的供试液中含菌量不大于100cfu。
7.2.1取的供试液9.9ml和小于10000cfu的铜绿假单胞菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。
平行制备2个平皿。
7.2.2取的供试液9.9ml和小于10000cfu的金黄色葡萄球菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。
7.2.3取的试液9.9ml和小于10000cfu的枯草芽孢杆菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。
7.2.4取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。
7.2.5取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。
7.2.6取的供试液9.9ml和小于10000cfu的白色念珠菌菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于20~25℃倒置培养5天点计菌落数。
7.2.7取的供试液9.9ml和小于10000cfu的黑曲霉菌悬液0.1ml混匀后,吸取1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基15~20ml,混匀,凝固,于20~25℃倒置培养5天点计菌落数。
7.3菌液组
7.3.1取小于100cfu的铜绿假单胞菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液、枯草芽孢杆菌菌悬液、白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约15~20ml,混匀,凝固,于30~35℃倒置培养3天点计菌落数。
各平行制备2个平皿。
7.3.2取小于100cfu的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌悬液各1ml,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基各
15~20ml,混匀,凝固,于20~25℃倒置培养5天点计菌落数。
7.4供试品对照组
7.4.1取的供试液1ml,注入平皿中,分别立即倾注15~20
ml温度不超过45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,胰酪大豆胨琼脂培养基30~35℃倒置培养3天点计菌落数,
沙氏葡萄糖琼脂培养基20~25℃倒置培养5天点计菌落数。
各组平行制备2个平皿。
7.4计算公式:
稀释剂对照组的回收率=稀释剂对照组菌落数-供试品对照组菌数×
100%
菌液组菌落数
试验组菌数回收率=试验组菌落数-供试品对照组菌数×
7.5判定标准:
实验组、稀释剂对照组的菌数回收率应在0.5~2之间。
若各试验菌的回收率均符合规定,照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
7.6试验结果
表1平皿法验证结果1#批号:
实验组别
试验菌种
供试液对照组
菌液组菌数
试验组菌数
回收率(%)
1号
2号
金黄色葡萄球菌
大肠埃希菌
枯草芽孢杆菌
黑曲霉
白色念珠菌
表2平皿法验证结果2#批号:
表3平皿法验证结果3#批号:
结果说明:
8.控制菌检查方法验证
(1)大肠埃希菌
取1:
10供试液10ml两份,分别加入两瓶100ml胰酪大豆胨液体培养基,其中一瓶加入1ml大肠埃希菌液(不大于100cfu/ml)为试验组;
一瓶为供试品;
另取一瓶100ml胰酪大豆胨液体培养基加入10ml无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液为阴性对照。
取上述培养物1ml,接种至含100ml
麦康凯液体培养基内培养,42~44℃培养24~48小时。
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上30~35℃培养18~72小时。
表10大肠埃希菌常规法验证结果1#批号:
步骤
实验组
阳性对照组
阴性对照组
胰酪大豆胨液体培养基,30~35℃培养18~24小时
麦康凯液体培养基,42~44℃培养24~48小时
取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上,30~35℃培养18~72小时。
若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长,应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验
确证是否为大肠埃希菌;
若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长,或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性,判未检出大肠埃希菌。
表11大肠埃希菌常规法验证结果2#批号:
表13大肠埃希菌常规法验证结果3#批号:
9、结论:
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- 微生物 限度 检查 方法 验证 方案