核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用Word文件下载.docx
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必须对50copies/ml的病毒核酸的检出率>
95%。
相当一部分国产荧光定量PCR检测试剂或许能在某些标本上获得20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足95%检出低病毒载量标本的要求。
相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的NAT血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。
2.2 转录介导的扩增方法
包括转录介导的扩增系统(transcriptionmediatedamplification,TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleicacidssequencebasedamplification, NASBA)。
TMA是一种利用Money鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶和T7RNA多聚酶2种酶的共同作用,在等温条件下来扩增RNA或DNA的反应系统,主要扩增原理为:
目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录,逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后,合成双链的DNA,并在T7RNA多聚酶作用下,转录出成千上万个目标RNA序列,这些RNA又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。
NASBA的原理与TMA相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。
这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在1个试管中进行,也减少了污染。
2.3其它NAT技术
包括支链DNA检测技术(branchedDNAsignalamplificationassay,bDNA)、环介导的等温扩增技术(loopmediatedisothermalamplification,LAMP)、连接酶链技术(ligasechainreaction,LCR)和链置换扩增(stranddisplacementamplification,SDA)等。
这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。
如bDNA技术,在1995年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。
bDNA技术对待测DNA无扩增,特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。
但也正因为bDNA技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将bDNA技术用于HBV或HCV病毒滴度的定量分析。
3. NAT在国内外血液筛检中的应用
3.1开展NAT检测的国家及所用的技术
NAT是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的研究,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检[12],例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行HBV、HCV、HIVNAT筛检的国家[13],新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行NAT筛检;
德国和荷兰从1997年起就开始NAT筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从2000年起开始了NAT血液筛检;
美国则从1999年3月开始在FDA新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。
开展NAT检测的国家及其所采用的技术见表1:
表1. 开展NAT检测的国家及所用技术汇总
国家或地区
技术
混合检测/单检
•Germany德国 (1997年起部分,
1999年4月起,全部)
•Netherlands荷兰 (1997年起)
•U.K.英国 (2000年起)
•Switzerland瑞士
•Japan日本(1997年1月起对原料浆;
1999年初起献血者)
•Canada加拿大
•USA美国 (1999年3月起)
•NewZealand新西兰
•Australia澳大利亚
•Singapore新加坡
•Portugal葡萄牙
•France法国(2000年起)
•Spain西班牙
•Italy意大利
•HongKong香港
•台湾(2005年准备中)
•韩国(2005年1月起)
•PCR
•TMA/PCR
•TMA
•TMA
•TMA/PCR
•Pool
•pool
•pool/IDT
•IDT
•pool/IDT
•Pool/IDT
各国采用的技术各不相同(参见表1)。
日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的AmpliNATTMNPX系统(为荧光PCR技术,可同时联合检测HBV,HCV和HIV),目前正在考虑使用Chiron公司的TMA技术;
美国ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技术;
美国血液中心(ABC)系统则使用罗氏COBASAmpliScreen;
荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens全自动核酸提取方法同罗氏的COBASAmpliScreen扩增体系结合起来使用;
而英国和法国的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自动核酸提取系统与罗氏的COBASAmpliScreen扩增体系结合起来的方法,随后部分血站又更换成Chiron的TMA技术。
各血站根据自身特色,正在对各种不同的技术组合进行评估,目的是寻求一种最适合的NAT技术,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。
3.2国外献血员中NAT检测结果
从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一,具体检测结果见表2。
表2 国外献血员中NAT检测结果汇总
国家
试剂
检测方式
血清学阴性、NAT单独阳性检出情况
文献
美国
ChironProcleixTMAHIV-1/HCVassay;
Roche CobasAmpliScreenHIV-1andHCVtests
Chiron:
16人份,TMA,化学发光检测;
Roche:
24人份混合,PCR-ELISA
1999.03-2002.03:
HCVNAT+:
170/39,721,404,即1/23万;
HIV-1NAT+:
12/37,164,054,即1/310万
文献14
日本
MultiplexHBV/HCV/HIV-1reagent(Roche与日本共同研制)
1999年7月1日-2000年1月31日,500人份;
2002年2月1日起,50人份混样;
合格血液检测
–2000.4:
HBVNAT+
:
26/2560977,即1/9.8万;
HCVNAT+
9/2560977,即1/28.4万;
0/256.1万。
–2002.12.31:
HBVNAT+:
308/16012175,即1/5.2万;
46/16012175,即1/34.8万;
6/1601217
文献15,16
澳大利亚
2个点单人份,3个点16人份,TMA,化学发光检测;
2000.-2004:
HCVNAT+-:
9/4,489,550,即万;
1/4,489,5504,即万4,489,550
文献17及个人交流(文献18)
中欧
HCVPCR:
RocheCobasAmplicon;
HIVPCR:
自己研制的PCR
96人份混合
6/360万,1/60万;
HIVNAT+:
2/360万,1/180万
文献19
法国
ChironProcleixTMAHIV-1/HCV;
或RocheCobasAmpliscreenHIV-1andHCV结合theOrganonNuclisens核酸提取仪
单检,或8人份,或16人份,不考虑血清学
2001.07-2003.12:
3/614万,即1/205万;
2/614万,即1/307万
文献20
新加坡
单人份检测
.10:
4/304,715,即万;
0/304,715,即万
个人交流(文献21)
韩国
16人份
2004,前期评估:
单采献浆者24599,献血者15597:
HCVNAT+:
1/40196;
HIVNAT阳性:
2005起,常规检测
个人交流(文献22)
南非
单人份
1999年:
HIVNAT+:
2/19709,即1/1.0万;
HCV NAT+:
0/19709
文献23
我国核酸筛查技术应用研究情况
3.3.1我国核酸筛查技术应用
我国有关NAT血液筛检研究的报道还比较少见。
比较规范的血液筛检研究更少,有的单位利用国产PCR试剂加电泳检测的方法进行检测,其实验室交叉污染的问题很难控制。
有关我国献血者及原料浆中NAT检测工作的情况总结于表3和表4。
表3国内血液中心开展NAT检测研究的情况
单位
NAT阳性
深圳保安区中心血站
美国BiotronicsTech HBV,HCVAmpliSensor试剂盒
20人份混合15000rpm离心浓缩,半自动荧光定量PCR检测
HCVNAT+:
1/8805
(ALT390U/L);
HBVNAT+:
抗-HBc阳性中:
1/946;
单项抗-HBc阳性中:
5/495(1%)
文献24
厦门血液中心
自行设计引物,HCV
50人份混合,NucliSensExtractor提取核酸,NASBA技术,混扩增,ECL检测
2/10000,即
1/5000
文献25
江苏省血液中心
华美HCVRNA试剂盒
单人份,PCR,电泳
2/750,即1/375
文献26
上海血液中心
美国ChironProcleixHIV-1/HCV
8人份或24人份混合;
TMA技术;
化学发光检测
0/103539;
文献7
北京血液中心
匹基HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂
24人份混合,26000g离心浓缩,Roche核酸提取柱,荧光PCR
0/34373;
0/34373
文献27
多单位参加的国际合作
美国ChironProcleixHIV/HCV
16人份混合;
无菌采血管EDTA抗凝,TEAN自动混样;
2/80259
(其中1个ALT254IU/ml)
HIVNAT+:
0/80259
文献28
深圳血液中心
RocheAmpliscreenHBV/HCV/HIV
24人份混合,STAR2000自动混样;
RocheMPLC自动提取核酸;
RocheCOBASAmplicor扩增和检测
0/16512;
HIVNAT+:
HBVNAT+:
8/16512,即1/2064
文献29及个人交流(深圳血液中心,王良华,2005年5月)
沈阳血液中心
匹基HCV荧光PCR核酸检测试剂
万
个人交流(沈阳血液中心,李剑平博士,2005年6月)
中山中心血站及芜湖中心血站
厦门长城,无锡三星,上海正业HCVPCR
77/28098(1/365)
文献30
表4 国内原料浆开展NAT检测研究情况
中国药品生物制品检定所
0/19196;
0/19196
文献31
上海莱士血制品
匹基HBV/HCV/HIV-1荧光PCR核酸检测试剂
48人份混合,26000g离心浓缩,Roche核酸提取柱,荧光PCR
1/1401718(1/140万);
万);
万)
文献32
ChironProcleixHCV/HIV-1Assay
16人份混合,TMA技术;
HCVNAT+:
1/10032;
0/10032
个人交流(检定所,白坚石博士,2005年1月)
3.3.2我国核酸筛查技术应用工作小结:
1)NAT检出率:
有限的研究数据表明,我国献血者血液NAT检出率
HCV NAT+ 检出率结果差异很大, 从1/365(国产试剂,电泳)~万~不等;
HIVNAT+检出率<
万;
HBVNAT+为1/946(anti-HBc+献血者中)~1/2088。
我国原料浆NAT检出率:
HCVNAT+万~万;
HIVNAT+:
万;
1/140万(48人份混合)。
2)必须重视核酸检测的质量控制体系:
✧注重避免交叉污染:
⏹检测方法:
传统的电泳检测为开放式,不适合;
⏹严格的核酸检测实验室设置和管理。
✧注重试剂质量:
为适应血液混样检测对灵敏度的要求,一些国产血筛试剂在临床诊断试剂的基础上已做样品处理的改良,灵敏度(如匹基)在考察期间不错。
但仍有待完善,表现在:
⏹灵敏度、重复性、特异性:
进口NAT血筛试剂质量稳定,各批质量波动小;
国产试剂批间差异问题;
特异性问题。
⏹内标:
进口试剂每个检测管均有内标,保证阴性结果的可靠性;
国产试剂由于尚无法解决加入内标后灵敏度降低的问题,未加内标,因此存在假阴性问题。
⏹自动化:
进口试剂已有配套的检测系统和软件,便于大规模筛查;
国产试剂尚在起步阶段,尚不能实现自动化,没有配套软件。
✧标本留样和处理:
也是核酸检测质量控制体系中的重要环节,否则在检测之前病毒核酸已降解,造成假阴性检测结果。
根据我们的研究结果,用于NAT检测的标本应用无菌留样管采集。
4.血液核酸筛查发展趋势
4.1NAT检测先从原料浆开始实施,再在献血者中实施:
NAT血液筛检方法总是从血浆制品的原料浆的筛检开始的,积累了充分的经验后,才逐步应用到血站的采供血系统。
例如,日本从97年11月起在原料浆中进行NAT筛检,1999年7月在东京都试用于献血者中[33];
欧洲医疗产品规范委员会(CPMP)规定从1999年7月起所有的血浆制品的原料、中试产品和最终产品都应进行HCVPCR检测,当时NAT只在少数血站进行评估,而大部分血站供血系统至今仍未进行NAT筛检;
美国早在1994年FDA就曾提出血浆蛋白生产的原料浆必须进行NAT筛检,而血站系统则从1999年才开始全面进行NAT的可行性评估[34]。
自动化,集中化检测
以地域为单位建立几个大型的集中式的NAT血筛中心,既便于质量管理,又能节省检测成本。
例如,全日本只设3家NAT检测中心,分区域对77家血液中心的标本进行HCV、HBV、HIV核酸检测和分析[35]。
又如美国红十字会(ARC)在全美成立了3个NAT检测中心,每天将所有ARC血站采集的血液集中到这3个检测中心进行NAT检测,据测算,尽管血液标本的冷链运输消耗一部分费用,但集中检测的成本仍低于各个血站单独检测。
我国香港地区将血液标本送到澳大利亚进行NAT检测也是这个道理。
目前,欧洲各国的血站正在进行或已经完成整合,也正是顺应了集中化管理的潮流。
4.3混合样本数逐渐减少
为降低成本,在保证灵敏度的前提下,NAT往往将一定数量的血液标本混合起来检测。
NAT检测最初在欧洲普遍流行96人份样本混合检测,随后逐渐更换成48人份,直至目前的24人份混合。
TMA刚开始在美国ARC进行评估时,将128份血液标本混合起来检测,随后改成16人份混合[34]。
日本1999年7月起用于献血者筛查,2000年2月起由原来的500份混合检测改为50份混合检测[33];
新加坡从一开始就使用单人份血液标本进行NAT检测。
这样更改的原因一是可以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检,二是混合样品增多,一旦发现阳性检测结果,进一步拆分混合样品,最终找到阳性血液标本的工作变得复杂耗时,有时还会影响正常的血液供应。
4.4应考虑考虑成本-效益比
NAT对提高血液安全确实有帮助,从各国公布的NAT检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一,虽然从经济学角度考虑,为了保障每年如此少数几个人的安全而投入大量的人、财、物进行NAT血液筛检,不太经济,然而对于受血者来说,一旦输入感染病毒的血液,被感染的概率就是100%。
因此大多数国家从人权角度考虑,仍然在经济允许的条件下开展NAT血液筛检;
但成本-效益的问题也是各国家所关心的[36-39]。
一些国家已在考虑加做HBVNAT
Chiron已开发Ultrio,可同时检测三项,初步临床试验数据表明,HBVNAT的检出率较高:
在新西兰:
检出HBVNAT+:
1/1991,单人份检测;
新加坡:
1/6000,单人份检测。
而在国内,尽管由于混合检测使HBVNAT的窗口期加长,HBVNAT+检出率仍比较高,为1/946(anti-HBc+献血者中)~1/2088[25,29]。
因此,如果在国内开展NAT临床服务工作,应考虑加做HBVNAT。
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