生物技术大实验实验指导书Word格式.docx
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实验八PCR法快速鉴定重组载体……………………………………...22
实验九限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒…………………………...24
实验十外源基因在大肠杆菌中的表达及其检测……………………….28
实验十一RNA的提取及其纯度检测……………………………………32
实验十二逆转录PCR(RT-PCR)扩增基因特异片段…………………..35
实验十三DNA探针制备……………………………………………..…38
实验十四Southern印迹杂交……………………………………………41
实验十五Northern印迹杂交……………………………………………44
实验十六荧光原位杂交(FISH)技术…………………………………47
实验十七外源基因在哺乳细胞中的表达及其检测…………………...50
实验十八生物芯片技术………………………………………………...53
实验十九RNAi技术……………………………………………………56
实验二十蛋白质组技术………………………………………………...58
附录基因工程基本技术路线…………………………………………….60
实验一质粒的提取和纯化
实验目的:
了解碱裂解法制备质粒的原理,掌握质粒的小量制备方法。
实验原理:
质粒DNA的抽提是基因工程操作中最常用与最基本的技术,现已有多种成熟的方案可供选择。
最常用的有利用碱性条件下质粒DNA与染色体DNA变复性的不同进行分离的碱法;
利用酸性、低离子强度时超螺旋在水相中,开环、线型分子在酚相中进行分离的酸酚法;
利用羟基磷灰石在特定的条件下(8mol/L尿素,0.24mol/L磷酸缓冲液pH=6.8)只吸附双链DNA的羟基磷灰石法(在上述条件下染色体DNA均成单链,质粒DNA保持双链)等。
本实验选做的是碱法。
1.裂解细胞裂解细胞是指通过溶菌酶、去污剂等试剂破裂细胞壁与膜的过程。
对于不同的菌要选用不同的方法,通常有煮沸法、非离子型去污剂法、碱性SDS法(简称碱法)等。
三种方法比较而言,非离子型去污剂法较温和,适用于抽提10kb左右的质粒;
而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈,只能抽提小于10kb的质粒。
常用的离子型去污剂是SDS、非离子型去污剂有TritonX-100等。
2.分离即将质粒DNA和染色体DNA分离。
碱法的分离原理如下:
大肠杆菌的染色体约有4700kb长,在处理细胞过程中都断裂成不同长度的双链DNA片段。
当溶液的pH调到大于12时双链DNA中的氢键被破坏,于是染色体DNA的双链分离成单链;
而超螺旋状态的质粒DNA仅仅是氢键被破坏,并只发生部分双链解离成单链的变化。
再当pH调回中性时单链DNA互相缠绕且与蛋白质结合生成网络状大分子,而超螺旋的质粒发生复性反应后仍是小分子,通过离心的方法很容易将二者分开,达到分离的目的。
3.纯化细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外还有各种细胞壁、膜碎片、蛋白质、脂质类物质及RNA。
纯化的步骤就是有针对性地将它们去除。
RNA可用牛胰RnaseA分解除去。
蛋白质可通过酚、酚/氯仿、氯仿/异戊醇,使蛋白质变性剂而除去,同时,氯仿有强烈的溶脂倾向,对于在除去蛋白质的同时去除脂质类杂质很有好处。
氯仿还能将微量的、溶于DNA水溶液的酚抽提掉,而微量的酚对于以后的酶切、转化等过程都会产生不利影响。
氯仿/异戊醇的蛋白质变性能力较弱,主要用于含酚试剂处理后的抽提。
正确的去除蛋白质杂质的过程应该是酚一酚+氯仿((1:
1))一氯仿(或氯仿/异戊醇24:
1),处理,根据实验情况也可考虑省略第一或第二步,但切记不可将氯仿(氯仿/异戊醇)的处理步骤省略掉。
抽提过程完成后的水溶液中仍有痕量的酚、氯仿等,可用乙醇沉淀的方法将它们除去。
用无水乙醇沉淀的特点是能将DNA进行浓缩,且同时也更换了整个缓冲系统,但DNA也有一定的损失。
实验内容:
试剂
1.LB培养液(1L)
细菌培养用蛋白胨10g
细菌培养用酵母粉5g
NaCl10g
用10mol/LNaOH调至pH7.0,高压蒸气灭菌,4℃贮存.
2.溶液Ⅰ,可成批配置,灭菌后4℃贮存。
葡萄糖
50mmol/L
Tris-C1(pH8.0)
25mmol/L
EDTA
10mmol/L
3.溶液Ⅱ(新鲜配制)
NaOH0.2mol/L
SDS1%
4.溶液Ⅲ
5mol/LKAc
60ml
冰醋酸
11.5ml
水
28.5ml
配制好的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐,5mol/L醋酸(pH4.8)
卡那霉素(Kana):
50mg/ml,过滤除菌.
5.重蒸酚市售苯酚蒸馏纯化(收集179~181℃之间的酚)后,用TE饱和,使水相的pH在7.5以上,4℃保存。
6.氯仿异戊醇(24:
1)
7.无水乙醇
8.RNaseA(10mg/ml)
9.3mol/LNaAc(pH5.2)
10.TE10mmol/LTris-C1(pH8.0)1mmoI/LEDTA
材料
含有质粒(pNTE-EGFP,pEGFPN3)的大肠杆菌DH5a.
操作步骤
1.挑取琼脂培养板上的含有pNTE-EGFP,pEGFPN3质粒的单菌落,接种至5mlLB培养液(含Kana50μg/m1),37℃振荡培养过夜。
2.取出1.5ml培养液至1.5ml离心管中,12000r/min离心2min,弃上清。
3.将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液工中,强烈振荡混匀。
4.加入200μl溶液Ⅱ,盖严管盖,轻轻颠倒混匀5次,冰浴5min。
5.加入150μl预冷的溶液Ⅲ,温和振荡10s,冰浴5min。
6.12000r/min室温离心5min,取上清至一个新的无菌的1.5m1Eppendorf管中。
7.加入等体积酚/氯仿(1:
1),振荡混匀,12000r/min离心2min,上清转移至另一个Eppendorf管中。
【注意】酚具有腐蚀性,操作时小心。
8.加人等体积氯仿,振荡混匀,12000r/min离心2min,上清转移至另一个Eppendorf管中。
10.加入2倍体积预冷无水乙醇-20℃沉淀10min。
11.12000r/min离心10min,去上清,沉淀用70%乙醇洗涤一次,空气中晾干。
12.加入20μlTE溶解质粒DNA,加入RNaseA,终浓度20μg/m137℃水浴0.5h。
13经0.7%琼脂糖凝胶电泳,EB染色后观察抽提结果。
【注意】EB为致癌物,操作时一定要戴乳胶或一次性手套。
14.将该管质粒保存于-20℃备用。
注意事项
1.该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净,获得一定得率的质粒DNA。
去掉染色体DNA最为重要,也较困难,因为在全部提取过程中,只有一次机会去除染色体DNA,其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时,控制变性与复性操作时机,既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性,又要使染色体DNA不断裂解成小片段,从而能与质粒DNA相分离。
这就要求试剂与溶菌液充分摇匀,摇动时用力适当,一般来说当溶液Ⅰ加入时可用力振荡几次,因为此时细菌还没有与碱和SDS作用,染色体DNA尚未释放,不必担心其分子断裂,加入SDS后,则要注意不能过分用力振荡,温和混匀,但又必须让它反应充分。
加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液溶液III,同样处理!
2.加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.
2.加乙醇沉淀DNA时,要把离心管加盖倒翻摇动4~5次,注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后,才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。
3.乙醇沉淀DNA离心后,要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。
否则,用TE缓冲液溶解DNA时,既困难又不完全。
4.为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带,加入1μlRNA酶,将管置50℃水浴箱内30min,消化RNA。
6.抽提产物经电泳分离、EB染色后,在紫外线灯下可观察到三个条带,自前往后分别为:
超螺旋、线性及开环质粒DNA。
【思考题】
碱法提取质粒的原理是什么?
【课外阅读】
高纯度质粒DNA的提取,参阅Qiagen公司说明书,网站:
实验二质粒DNA的电泳和纯度检测
掌握DNA琼脂糖电泳技术,了解紫外分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理。
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。
其中,凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点,使它成为分离、鉴定和提纯核酸的首选标准方法。
与蛋白质分子类似,核酸分子也是两性解离分子。
在pH3.5时,碱基上的氨基基团解离,而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离,整个分子带正电荷,在电场中向负极泳动;
在pH值为8.0~8.3时,碱基几乎不解离,磷酸全部解离,核酸分子带负电荷,向正极移动。
不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同,在自由泳动时,各核酸分子的迁移率区别很小,难以分开。
所以采用适应浓度的凝胶介质作为电泳支持物,发挥分子筛的功能,使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异,达到分离的目的。
值得注意的是,等长度的单链DNA和双链DNA在中性或碱性凝胶中的迁移率大致相等。
1.影响泳动的四大因素
(1)影响泳动的首要因素是电泳样品的物理性质:
包括电荷多少、分子大小、颗粒形状和空间结构。
一般来说颗粒带电荷的密度愈大,泳动速率愈快;
颗粒物理形状愈大,与支持物介质摩擦力越大,泳动速度越小。
即泳动率与颗粒的分子大小,介质粘度成反比;
与颗粒所带电荷成正比。
在检测未知DNA分子量时,DNA分子的空间构型不同,即使相同的分子量其迁移率也不同。
如质粒DNA存在闭环(Ⅰ型,CC),单链开环(Ⅱ型,OC)和线性(Ⅲ型,L)。
三者之间的迁移速率,一般为Ⅰ型>
Ⅲ型>
Ⅱ型,但是有时也会出现相反的情况,因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及溴乙锭染料含量有关。
当胶浓度较高或电场强度较大时,Ⅰ型DNA与Ⅲ型DNA互换位置,而Ⅱ型DNA总是迁移最慢。
(2)支持物介质:
DNA的凝胶电泳常使用两种支持材料:
琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。
通过这两种介质的浓度变化调整所形成凝胶的分子筛网孔大小,分离不同分子量的核酸片段。
琼脂糖凝胶的孔径大,可以分离长度为100bp至近60kb的DNA分子;
聚丙烯酰胺凝胶的孔径小,可分离小片段(5~500bp)DNA,效果最好。
因此,选用不同的凝胶种类和浓度可以分辨大小不同的DNA片段。
(3)电场强度:
电泳场两极间单位支持物长度的电压降即为电场强度或电压梯度。
电场强度愈大,带电颗粒的泳动速率愈快,但凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。
在低电压时,线性DNA分子的泳动率与电压成正比。
一般凝胶电泳的电场强度不超过5V/cm;
对于大分子量真核基因组DNA片段的电泳常采用0.5~1.0V/cm电泳过夜,以取得较好的分辨率和整齐的带型。
电压1000~2000V,电场强度20~600V/cm的电泳为高压电泳,必须用聚丙烯酰胺做介质。
(4)缓冲液离子强度:
缓冲液是电泳场中的导体,它的种类、pH值、离子浓度直接影响电泳的效率。
Tris.C1缓冲体系中,由于Cl—的泳动速度比样品分子快得多,易引起带型不均一现象,所以常利用TAE、TBE和TPE三种缓冲体系。
缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度,缓冲液pH值与DNA样品的等电点相距越远,样品所携带电荷量越多,泳动速度越快。
DNA电泳缓冲液,常采用偏碱性或中性条件,使核酸分子带负电荷,向正极泳动。
缓冲液的离子强度与样品泳动速度成反比,电泳的最适离子强度一般在0.02~0.2之间。
2.指示剂
电泳过程中,常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。
核酸电泳常用的指示剂有是溴酚蓝,溴酚蓝呈蓝紫色,分子量为670Da,在不同浓度凝胶中,迁移速度基本相同,它的分子筛效应小,近似于自由电泳,故被普遍用作指示剂。
在0.6%,1%,2%的琼脂糖凝胶中,溴酚蓝的迁移率分别与1kb,0.6kb和0.15kb的双链线性DNA片段大致相同。
指示剂一般加在电泳上样缓冲液中,为了使样品能沉人胶孔,还要加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重。
3.染色剂
核酸需经过染色才能显示出带型,最常用的是溴乙锭染色法。
溴乙锭(ethidiumbromide,EB)是一种荧光染料,这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间,在紫外线激发下,发出红色荧光。
EB-DNA复合物中的EB发出的荧光,比游离的凝胶中的EB本身发出的荧光强大10倍,因此不需要洗净背景就能清楚地观察到核酸的电泳带型。
通常,可以在凝胶中加入终浓度为0.5μg/m1的EB,这样在电泳过程中可以随时观察核酸的迁移情况,这种方法适用于一般性的核酸监测。
也可以在电泳结束后用0.5μg/m1的EB溶液染色10-15min后进行紫外观察,由于EB在可见光下易分解,故应存棕色瓶中于4℃条件下保存。
[注意]:
EB有潜在的致癌危险,操作时必须戴乳胶手套或一次性手套。
(1)质粒pNTE-EGFP。
(2)琼脂糖。
(3)10mg/ml溴乙锭溶液。
(4)DNA分子量参照物(marker)。
(5)50×
TAE电泳缓冲液。
(6)10×
溴酚蓝上样缓冲液。
2.器材
(1)恒温水浴
(2)电泳槽
(3)电泳仪
(4)微波炉
(5)紫外线检测仪
(6)移液器;
100-1000μl,10-100μl,0.5-10μl
电泳
(1)称取1.0g琼脂糖,加入100ml1×
TAE电泳缓冲液中。
(2)加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。
(3)凝胶冷至60℃左右,加入溴乙锭至终浓度为0.5μg/m1。
(4)将琼脂糖溶液倒人模具,凝胶厚度一般为0.3~0.5cm,检查有无气泡。
室温下15~30min后,琼脂糖溶液完全凝固。
(5)连接电泳槽与电泳仪之间的电源线,正极为红色,负极为黑色。
(6)取掉模具两端的胶布,放入电泳槽,加样孔在负极端。
(7)加入1×
TAE电泳缓冲液至电泳槽中,液面高于胶面1mm,小心取出梳子。
(8)取5μl实验一制备的质粒DNA,在DNA样品中加入1/10的上样缓冲液并混匀。
(9)用移液器将DNA样品加入梳孔中。
(10)接通电源,DNA样品往正极移动。
电压选择为3~5V/cm。
注意:
长度以两个电极之间的距离计算。
(11)根据指示剂迁移的位置,判断是否终止电泳;
切断电源后,含EB的凝胶可以直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。
浓度和纯度分析:
1取10μlDNA用TE缓冲液稀释至1ml,混匀。
以无DNA的TE为空白,测定样品在260nm和280nm波长下的光密度吸收值,每个样品重复3次,取3次结果的平均值作为最终结果。
2换算出OD260/OD280的比值,较纯的DNA,该值在1.6-1.8之间。
3根据双链DNA1OD260nm=50g,计算出样品DNA的浓度,计算公式为所测的OD260nm×
50/10(g/l)
附录一、核酸换算数据
dsDNA
10kb=6.60106Dalton
1OD260nm=50g
ssDNA
10kb=3.30106Dalton
1OD260nm=40g
RNA
10kb=3.45106Dalton
附录二、琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的最适分辨范围
琼脂糖凝胶浓度
线性DNA的最适分辨范围(bp)
0.5%
0.7%
1.0%
1.2%
1.5%
2.0%
1,000-30,000
800-12,000
500-1,000
400-7,000
200-3,000
50-2,000
实验三PCR产物的TA克隆
掌握通过TA连接克隆PCR产物的原理和方法。
通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中,由于往往不清楚目的基因的DNA序列,获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法,重组到T-载体中,通过序列测定清楚DNA序列。
由于在PCR过程中,使用的DNA聚合酶不同,往往分为2种情况:
(1)使用不同的Taq酶,在PCR扩增循环结束后,加上72℃10分钟一个过程,Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A,因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。
(2)使用高保真的DNA聚合酶,如pfu酶,由于其不能在扩增产物的3末端加上A,得到的DNA序列为钝端,因此,需要在回收纯化后进行加A的过程,通常是以PCR回收产物为模板,加上一定量的普通Taq酶和反应液,加入dATP(或dNTP),72℃10分钟,然后将加A产物直接用于TA连接。
下图是大连宝生物公司的T载体及其说明书。
pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。
它是TaKaRa独自研究开发,由pUC18载体改建而成的。
在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点,用EcoRV进行酶切反应后,再在两侧的3'
端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在PCR产物的3'
末端添加一个“A”的特性,所以使用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
本制品是以最为常用的pUC18载体为基础研制而成,所以它具有同pUC18载体完全相同的功能。
此外,本制品中的高效连接液LigationSolutionI可以在极短的时间内(30分钟-1小时)完成连接反应,大大地方便了实验操作。
另外,本制品中还含有ControlInsert(500bp),可用于Control反应。
用途:
克隆PCR产物。
对克隆后的PCR产物用M13Primers进行DNA测序。
α互补和蓝白筛选的原理:
许多载体(包括pMD18-T)都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子和编码其N端氨基酸(α肽链)的片断基因。
宿主具有编码β半乳糖苷酶的C端基因。
当二者产物组合在一起,就具有活性酶的产生,此现象称为α互补。
由α互补形成的具有功能活性的β半乳糖苷酶,可以用X-gal显色测定出来,它能将无色的化合物Xgal切割成半乳糖和蓝色底物。
当外源DNA片断插入到多克隆位点后,就会破坏α肽链的阅读框,从而不能合成与受体菌内的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽链,而导致不能形成功能活性的β半乳糖苷酶,因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色的,而没有插入外源片断的则是蓝色的。
pMD18-TVector试剂盒,或自己PCR扩增回收纯化的片段,T4DNA链接酶。
IPTG,X-gal,LB培养基等。
200mg/ml的IPTG过滤除菌
20mg/ml的X—gal溶于二甲基甲酰胺,避光保存。
1.在微型离心管中制备下述连接反应液,全量为10l。
*取0.5l进行实验也可得到满意的结果。
实际操作时,可按实验需要使用适量的T载体。
2.16℃反应30分钟(过夜反应也不影响连接效率)。
3.全量(10l)转化至JM109感受态细胞(100l)中。
4.在含有40l20mg/ml的X-Gal、4l200mg/ml的IPTG、50-100g/mlAmp的L-琼脂平板培养基上培养,形成单菌落。
计数白色、蓝色菌落。
5.挑选白色菌落,使用PCR法确认T载体中插入片段的长度大小。
注意事项:
1.LigationSolutionI请于冰中融解。
2.在进行克隆时,VectorDNA和InsertDNA的摩尔比一般为:
1:
2~10。
在本制品中,pMD18-TVector1l(50ng)的摩尔数约为0.03pmol,ControlInsertDNA1l(50ng)的摩尔数约为0.15pmol。
3.克隆时使用的InsertDNA片段(PCR产物)尽量进行切胶回收纯化,PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆的效率。
4.按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20l。
当进行转化的DNA用量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。
5.连接反应请在16℃下进行,温度升高(>
26℃)较难形成环状DNA。
6.连接效率偏低时,可适当延长连接时间至数小时。
7.感受态细胞可使用适合于pUC系列载体的感受态细胞,如:
JM109,DH5a等。
相关问题
怎样提高pMD18-TVector的克隆效率?
1.纯化PCR产物。
切胶回收的PCR片段最好
2.除去残存的引物等杂质。
3.DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都
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