免疫印记手册第六版Word文件下载.docx

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（2）快速的免疫检测方法

4.膜剥离再生操作

5.蛋白质消化&

印迹保存操作

六、故障排查：

1.故障排查

2.印迹失败的例子和原因

一、膜的选择

摘要：

PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜，各有什么特点？

我们该如何选择？

近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领先供应商。

它目前提供三种PVDF膜。

这三种膜有何不同，分别适合哪些应用呢？

详见本文。

印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素：

•蛋白质结合能力

•是否需要用醇预湿

•开展多次剥离（stripping）和再生检测（reprobing）实验的能力

•蛋白质观察

•长期印迹保存

•信噪比

聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素（NC）是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。

硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。

表1.PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较

与硝酸纤维素膜相比，电转到PVDF膜上有许多优点。

PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性（Pluskal等，1986）。

其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。

使用PVDF膜的另一个优点是，单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中，如考马斯蓝染色，接着切割条带进行N端测序，蛋白质水解/肽段分离/内部测序，以及免疫检测（Kurien等，2003）。

市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80–100μg/cm2，而PVDF膜的结合能力是100–200μg/cm2。

在检测血清中人免疫缺陷病毒（HIV）时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，结果表明，PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测（Lauritzen和Pluskal，1998）。

Immobilon®

PVDF转印膜

默克密理博提供三种PVDF膜：

•Immobilon®

-P膜（0.45μm）是一种通用的基质，适用于一般的免疫印迹应用。

-PSQ膜（0.2μm）适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。

它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45μm膜更高的截留率。

-FL膜（0.45μm）是为荧光免疫检测而开发的。

它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。

转印膜以卷膜和方片膜形式提供。

预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。

转印膜的性质详见表2。

表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon®

预切膜的尺寸。

表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon®

表2.Immobilon®

PVDF转印膜的性质和应用

表3.Immobilon®

PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统

表4.Immobilon®

PVDF预切转印膜和匹配的预制胶

二、蛋白质结合

一旦膜被浸湿，蛋白质结合可通过蛋白质与膜的接触而实现。

由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度（深度），结合能力是由孔的内部表面积来决定的。

-P与Immobilon®

-PSQ转印膜在蛋白结合能力上有何差异？

影响蛋白质结合的因素有哪些？

PVDF本质是一种疏水性的聚合物，在水溶液中不会浸湿。

为了在水性缓冲液和系统中使用PVDF膜，首先必须将其浸泡在50%（v/v）或更高浓度的醇溶液中。

甲醇、乙醇和异丙醇都适合浸泡这种膜。

随着膜的外观从不透明到半透明，完全浸湿是显而易见的。

之后必须用水反复冲洗，以去除醇类，再将膜直接放入转印缓冲液中平衡。

-Pvs.Immobilon®

-PSQ转印膜

由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度（深度），结合能力是由孔的内部表面积来决定的（Mansfield，1994）。

-PSQ转印膜的内部表面积大约是Immobilon®

-P转印膜的三倍，使其吸附能力更高（表2）。

表2中所列的数值代表了膜表面在非变性缓冲液中饱和后蛋白质结合的上限。

在任一指定的应用中，都可以预期Immobilon®

-PSQ转印膜能比Immobilon®

-P转印膜结合更多的蛋白质。

然而，分析中可实现的最大结合能力往往取决于所采用的具体操作步骤，这是由于蛋白质构象的差异，所使用缓冲液的化学性质，以及样品上样所用方法的限制。

-PSQ转印膜之间结合差异的例子如图1所示，其中蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶上电转过来。

部分蛋白质穿过Immobilon®

-P转印膜，被第一张膜后面的第二张膜所捕获。

相比之下，所有蛋白质与Immobilon®

-PSQ转印膜结合，而未穿过。

在这种情况下，紧密的孔结构和聚合物较高的内部表面积有助于所有转移蛋白的完全吸附。

不过，Immobilon®

-PSQ转印膜上的免疫检测可能产生较高的背景，需要更严格的清洗条件。

因此，膜的选择是由实验目标决定的：

对于>

20kDa蛋白质的高灵敏度检测，使用Immobilon®

-P转印膜，但如果分析较小的蛋白质，或必须捕获100%的蛋白质进行肽段测序，则要转换成Immobilon®

-PSQ转印膜。

图1.利用Immobilon®

-P和Immobilon®

-PSQ转印膜进行蛋白质的延长电转。

分子量标准品（第1、3、5、7泳道）和小牛肝裂解液（第2、4、6、8泳道）通过槽转印法转移到Immobilon®

-P或Immobilon®

-PSQ膜，并用考马斯亮蓝染色。

在第一张Immobilon®

-PSQ转印膜的后面再放一张，以捕获穿过的蛋白质。

（第5和6泳道在Immobilon®

-P后面；

第7和8泳道在Immobilon®

-PSQ后面。

）

影响蛋白质结合的因素

在分子水平，蛋白质吸附至少部分源于疏水氨基酸侧链与聚合物表面疏水区的相互作用。

Matsudaira（1987）观察到，在疏水残基被切割之后，小肽的测序效率下降80%，这可能是由于残余肽段被洗脱。

同时，在肽段消化降解时，人们也观察到疏水肽段往往不能像亲水肽段那样高效洗脱（如Iwamatsu，1991；

Fernandez等，1992）。

McKeon和Lyman（1991）表明，转印缓冲液中添加的Ca2+离子可增强钙调蛋白与Immobilon®

-P转印膜的结合。

钙的结合导致蛋白质分子结构中形成一个疏水袋。

原理与优化

1、印记原理与优化

过滤（抽滤）

过滤是将蛋白质上样到膜上的直接方法。

一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。

蛋白质吸附到膜上，而样品的其他组分则穿过膜（图2）。

或者，将样品直接点在表面上，并让其干燥。

固定在膜上的蛋白质随后可用于分析。

斑点印迹（图3）和狭缝印迹是过滤方法的两个版本，它们采用多管吸印仪（manifold），将样品以斑点状或狭缝状上样到膜上。

这些技术被作为快速筛选大量样品的定性方法，或分析相似样品的定量技术。

它在测试实验设计参数是否适用于更复杂分析时特别有用。

过滤方法的另一个版本是网格免疫印迹，当样品量非常有限，无法用ELISA等传统技术来开展分析时，这种技术很有用，适合高度并行的样品分析。

例如，网格免疫印迹已用于过敏原特异的抗体应答鉴定，只需要极少量的患者血清（Reese等，2001）。

在制备过滤法印迹时，请注意以下方面：

• 

去污剂会抑制蛋白质吸附到膜上。

样品溶解和清洗所用的缓冲液中的去污剂应不超过0.05%，且只在需要时添加。

样品量应足够大，以覆盖每孔中暴露的膜，但又不能超过膜的结合能力。

颗粒负载高的样品可能会堵塞膜，而那些高粘度的样品会降低流速。

颗粒应通过预过滤或离心来去除，并只将上清上样到膜上。

粘稠的样品应用缓冲液稀释。

图2.利用过滤的印迹系统。

图3.利用Immobilon®

Western化学发光HRP底物在人血清的斑点印迹上检测转铁蛋白（详见操作步骤1.4斑点印迹，第40页）。

利用山羊抗转铁蛋白抗体（稀释度1:

10,0000）和兔抗山羊HRP结合的二抗（稀释度1:

50,000），在Immobilon®

-P膜上检测连续稀释血清中的转铁蛋白，重复两次。

2.WB之蛋白分离

Western印迹包含下列步骤：

在聚丙烯酰胺凝胶上分辨一个复杂的蛋白质样品。

将分辨好的蛋白质转移到膜上。

膜上特定蛋白质的鉴定。

对于一个成功的Western印迹，必须满足四个要求：

从凝胶上洗脱–在转移过程中蛋白质必须从凝胶上洗脱。

如果它仍保留在凝胶上，则无法开展印迹分析。

吸附到膜上–在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上。

如果蛋白质不吸附，则无法开展印迹分析。

处理过程中的蛋白截留–在转移后的印迹处理过程中，蛋白质必须仍然吸附在膜上。

处理过程中蛋白的可及性–吸附的蛋白质必须能与检测它的化学试剂接触。

如果蛋白质被掩蔽，那它就无法被检测。

下面将讨论Western印迹中所涉及操作的理论和实际考虑。

在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白质混合物

在印迹之前分离复杂蛋白质混合物的最常用方法是一维（1-D）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），其中蛋白质是根据其分子量分离的（图4）。

在某些情况下，使用非变性条件来分离天然蛋白。

尽管这种方法通常不及变性电泳的分辨率，但是在一抗只识别非变性蛋白或必须在膜上保留蛋白质的生物活性时，这特别有用。

二维（2-D）凝胶电泳是分析细胞类型、组织和体液中蛋白质组成的理想技术，也是蛋白质组学的核心技术。

2-D凝胶的免疫印迹提供了分子量和等电点的信息，在区分翻译后修饰所产生的蛋白质异构体上很有用（Celis和Gromov，2000）。

在某些情况下，通过等电聚焦的一维分离后的免疫印迹可实现蛋白质分型（Poland等，2002；

Eto等，1990）。

二维印迹的例子如图5所示。

分子量标准品

凝胶中包含分子量（MW）标准品，或marker，有助于在电泳分离后估计感兴趣的蛋白质的大小。

目前有两种类型的标准品，未染和预染。

未染的MWmarker通常包含已纯化的分子量已知的天然或重组蛋白。

观察它们在凝胶或膜上的定位需要借助一个染色步骤。

预染的MWmarker如图4所示。

使用预染marker既有优点，也有缺点。

预染marker可实现在电泳过程中监控凝胶上的蛋白质分离。

它们也能指示后续转印步骤中的转移效率。

然而，它们相对较贵，且染料的添加可能影响蛋白质迁移率。

在确定分子量时，预染marker没那么准确，因为蛋白质上结合的染料会改变印迹过程中它们吸附到膜上的能力。

图4.TrailMix™蛋白标准品（货号70982）上带有三个预染marker和八个未染marker（它们都带有HisTag和S•Tag），实现了电泳过程中蛋白质迁移的直接观察以及任一Western印迹上准确的大小判定。

图5.通过二维电泳分离的蛋白质的化学发光检测。

大鼠成纤维细胞系的银染2-D凝胶（左）和同一张凝胶的印迹（右），在Immobilon®

-P膜上用小鼠单克隆抗体杂交，并通过化学发光法观察。

聚丙烯酰胺的浓度

凝胶上聚丙烯酰胺的浓度可以是均匀的，也可以是梯度的。

最常用的聚丙烯酰胺浓度，10%，最适合10-150kDa范围内蛋白质的分离。

如果正在分析未知的蛋白质，或需要更广泛的分离，建议使用梯度胶。

例如，4-12%的Tris甘氨酸凝胶适合30至200kDa范围内的蛋白质，而10-20%的凝胶能成功分离6至150kDa的蛋白质。

SDS-PAGE凝胶的厚度通常为1.0和1.5mm；

不过，对于印迹而言，较薄凝胶（=1mm）的蛋白质转移最好。

凝胶电泳缓冲液

最常用的凝胶电泳缓冲液是由Tris甘氨酸或Tris-tricine组成的。

缓冲液中可能含有0.1%的去污剂，通常是SDS。

Tris甘氨酸缓冲液系统适合分离分子量范围广（6-200kDa）的蛋白质，并与变性或非变性条件兼容。

Tris-tricine系统最适合分离较小的，需要在上样之前还原和变性的蛋白质（<

10kDa）。

两种缓冲液系统都与蛋白转移到PVDF膜上兼容。

Tris醋酸缓冲液有时用于较大蛋白的分离。

3.WB之蛋白转移

电泳洗脱，或电泳转印是迄今为止使用最广泛的转印方法。

与扩散或真空转印相比，主要优点是速度和转移完全。

两种常用的电泳转印技术是槽转印和半干转印。

它们都基于相同的原理，只是容纳凝胶/膜堆积层所用的机械装置和电场的施加不同。

蛋白质从凝胶转移到膜上

蛋白质从凝胶转移到膜上，同时维持其相对位置和分辨率的过程被称为转印。

转印可通过三种不同的方法来实现：

简单扩散（Kurien和Scofield，1997）是在凝胶上依次放置膜、一叠干滤纸，并在滤纸上放上重物以促进扩散过程而实现的（Kurien和Scofield，2003）。

这种方法可将一块凝胶上的蛋白质转移到多块膜上（Kurien和Scofield，1997），获得同一块凝胶的几个印迹。

扩散方法的主要缺点是转移不是定量的，与电泳转印相比只能转移25-50%的蛋白质（Chen和Chang，2001）。

真空辅助的溶剂流（Peferoen等，1982）利用泵的抽吸能力，将凝胶上分离的蛋白质吸到膜上。

高分子量和低分子量的蛋白质都可用这种方法转移；

不过，分子量低于20kDa的蛋白质需要使用较小的孔径（0.2μm），因为它们不易被0.45μm的膜吸附（Kurien，2003）。

蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上的真空转印不大常见，主要用于核酸从琼脂糖凝胶上的转移。

电泳洗脱，或电泳转印（Towbin等，1979）是迄今为止使用最广泛的转印方法。

与扩散或真空转印相比，主要优点是速度和转移完全（Kurien等，2003）。

电泳转印技术

槽转印（图6）是一种传统的技术，其中凝胶/膜堆积层被完全浸湿在缓冲液槽中，并施加电流。

这是一种有效但缓慢的技术，使用大量缓冲液。

槽转印系统一般在恒定电压下运行；

转移过程中缓冲液的混合让电流保持相对恒定。

图6.槽（湿式）转印系统。

半干转印（图7）以一叠经缓冲液浸湿的滤纸取代了缓冲液槽。

由于板电极直接接触滤纸，通过凝胶的场强最大化，利于快速、高效的转移。

这种技术同样有效，且比槽转印快得多（15-45分钟）。

大多数半干转印方法使用不止一种缓冲液系统，来实现大蛋白和小蛋白的高效转移。

不过，半干转印系统有着较低的缓冲能力，因此不适合长时间转印。

半干转印是大的2-D凝胶转印的首选方法。

半干转印仪通常在恒定电流下运行；

在转移过程中电压会增加。

对于半干转印系统，滤纸和膜必须切成与凝胶同样大小，这样电流才被迫穿过凝胶。

否则，电流会通过凝胶周围的重叠滤纸而短路。

在两种类型的转印系统中，需要格外小心，以避免在滤纸、凝胶和膜之间引入气泡。

气泡阻碍转移，引起转印膜上的“秃斑”（即无转移区域）。

图7.半干转印系统。

4.转印缓冲液

转印缓冲液提供了电极之间的电连续性，必须是导电的。

它还提供了一个化学环境，能维持蛋白质的溶解度，又不妨碍转移过程中蛋白质吸附到膜上。

对于大多数蛋白质样品，常见配方可实现这些功能。

至于添加到缓冲液中的甲醇，它有什么功能呢？

请看本文。

转印缓冲液

大部分缓冲液在转移过程中发生焦耳加热。

基于这个原因，许多槽转印系统都配有内置的冷却管。

转印槽还可以放在冷室内，而缓冲液可以在使用前经过预冷。

在半干转印系统中，电极板还可作为散热片。

但它们的散热能力有限，因此半干系统一般不用于长时间转印。

传统的转印缓冲液包含缓冲系统和甲醇。

Towbin缓冲液（1979），Tris甘氨酸缓冲液，常用于槽转印系统中。

这种缓冲液的pH值为8.3，比大多数蛋白的等电点（pI）要高。

在凝胶上分离的蛋白质带负电荷，向阳极迁移。

由于槽内的缓冲液是混合的，故转移过程中的离子分布保持相对恒定。

半干系统可利用单一或三重缓冲液系统（Kyhse-Anderson定义，1984）来运行。

使用三重缓冲液，是因为转移是个等速电泳的过程，其中蛋白质在领先离子和尾随离子之间移动（Schafer-Nielsen等，1980）。

在某些情况下，三重缓冲液系统可实现更好的定量转移。

这三重缓冲液分别为：

阳极缓冲液I：

0.3MTris，pH10.4

阳极缓冲液II：

25mMTris，pH10.4

阴极缓冲液：

25mMTris和40mMε-氨基己酸，pH9.4

阳极缓冲液I中和阳极板表面产生的过量质子。

阳极缓冲液II与阳极缓冲液I的pH值相同，但Tris浓度低至25mM。

阴极缓冲液包含ε-氨基己酸，作为转移过程中的尾随离子，并在阴极缓冲液中逐渐耗尽，因为它穿过凝胶向阳极移动。

对于半干系统中采用单缓冲液，请查询制造商的建议。

尽管上面定义的缓冲液系统适用于大多数蛋白转印，但文献中包含许多变化，适用于不同的应用。

最明显的变化之一是在蛋白测序应用中，建议使用10mMCAPS缓冲液（pH11）（Matsudaira，1987）。

Towbin缓冲液中使用以及凝胶电泳缓冲液中残留的甘氨酸导致采用Edman原理的自动蛋白测序仪中出现高背景。

通过改变转印缓冲液的配方，这种假象明显减少。

缓冲液强度及组成的任何修改应小心进行，以确保转印装置不会过热。

转印缓冲液甲醇的功能

添加到转印缓冲液中的甲醇有两个主要功能：

稳定凝胶的尺寸。

从蛋白质分子上解离出复合的SDS。

聚丙烯酰胺是一种水凝胶，具有吸收水分的能力。

在纯水中，各个维度的凝胶尺寸都有相当量的增加。

溶胀度也取决于凝胶中所使用的丙烯酰胺的浓度。

高浓度的凝胶比低浓度的凝胶溶胀得更多。

梯度胶会明显突出这种影响，其底部高浓度的区域比顶部溶胀得更多。

开始时是矩形的凝胶可能会变成梯形。

添加到转印缓冲液中的甲醇能最大限度地减少凝胶溶胀，而转印操作通常也包括一个平衡步骤，以达到凝胶尺寸的稳定性。

当甲醇浓度为10%-20%时，尺寸稳定性可相当快速地实现。

当甲醇浓度较低时，平衡需要更长的时间才能实现。

如果在转移过程中发生尺寸改变，蛋白质的分辨可能会损失。

对于在甲醇中溶解度有限的高分子量蛋白质，甲醇的减低会导致蛋白转移效率明显提高，但这可能需要更长的平衡时间来确保尺寸稳定性。

甲醇的第二个功能对于蛋白质从包含SDS的凝胶上转移很关键。

甲醇可帮助从蛋白质分子上解离所复合的SDS（Mozdzanowski和Speicher，1992）。

尽管SDS对凝胶上单个蛋白质的分辨很必要，但是对于有效印迹却是极为不利的。

首先，SDS的结合给蛋白质分子带来高的负电荷密度，导致蛋白质分子非常快速地穿过膜，减少在孔结构内的停留，从而降低分子间相互作用的机会。

其次，通过包被蛋白质分子，SDS限制蛋白质与PVDF进行分子接触的能力。

这些影响随着蛋白质的分子量降低而增加。

甲醇通过解离SDS，并提高蛋白质分子与膜结合的可能性，从而减少这两方面的影响。

5.影响转印的因素

影响蛋白质成功转移的因素有哪些？

本文提到了四点：

SDS的存在、电流和转印时间、转印缓冲液的pH值，以及平衡时间。

SDS的存在

一些研究表明，在SDS-PAGE凝胶的背景下，蛋白质与SDS分子结合，因此不能有效地与转印膜结合。

具体来说，在两小时内监控BSA在标准槽转印系统中的转移，数据表明，在单个蛋白条带中，分子分成多批从凝胶上转移（图8，第20页）。

在最初60分钟内，约90%的BSA从凝胶上洗脱，在之后60分钟内还有7%。

在最初15分钟内，部分洗脱的BSA被Immobilon®

-P转印膜吸附，而剩余的穿过，被Immobilon®

-PSQ转印膜吸附。

而15分钟后洗脱的BSA几乎全被Immobilon®

-P转印膜吸附。

图8.BSA的电转移。

25pmol125I标记的BSA在10-20%的梯度胶上通过SDS-PAGE来分辨。

平衡后5分钟，在槽转印系统中将BSA转移到Immobilon®

-P转印膜，并用Immobilon®

-PSQ转印膜来备份，利用25mMTris、192mM甘氨酸和10%甲醇作为转印缓冲液。

系统以8V/cm极间距离运行。

在15、30、60和120分钟，取出凝胶/膜转印夹。

切下BSA条带并计算。

最简单的解释是与高水平残留SDS结合的BSA从凝胶上快速洗脱，无法被Immobilon®

-P转印膜所吸附。

较慢洗脱的BSA能够被Immobilon®

尽管去除凝胶上的SDS通常被认为是常规印迹的最好方法，但也有一些情况，说明在转印缓冲液中添加少量SDS也是值得考虑的。

一种情况是待转移的蛋白质在缺乏SDS时溶解度很低。

与细胞膜相关联或不可缺少的蛋白质可能是非常疏水的，当SDS被去除后，在聚丙烯酰胺中会沉淀。

高分子量蛋白质也在缺乏SDS时表现出溶解度的问题，特别是当暴露在样品缓冲液的变性条件以及转印缓冲液所使用的甲醇下。

转印缓冲液中补充SDS可帮助维持足够的溶解度，以便允许从凝胶上洗脱（如Towbin和Gordon，1984；

Otter等，1987；

Bolt和Mahoney，1997）。

转印缓冲液中的SDS浓度不应超过0.05%，且应有足够的平衡时间，以去除凝胶上过量的SDS。

改善高分子量蛋白质的转印效率的其他方法包括延长转印时间，最多21个小时（Erickson等，1982），或使用包含SDS和尿素的复合琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶（Elkon等，1984）。

电流和转印时间

适当的电流和转印时间对成功的转印至关重要。

电流过低和/或时间不足将导致转印不彻底。

相反，如果电流过高，蛋白质分子可能太快穿过膜而来不及被吸附。

这对于较小的蛋白质来说可能是个值得注意的问题。

通常，转印系统都会附带制造商关于电流和转印时间的建议，它们应被作为参考指引。

优化条件可能仍然需要，这取决于丙烯酰胺的比例、缓冲液组分，以及感兴趣蛋白质的分子量。

一般来说，长的转印时间最适合槽转印系统，它通常需要冷却装置和转印缓冲液的内部循环。

然而，对于半干式转印，延长转印时间可能导致缓冲液耗尽、过热和凝胶变干。

如果太干，装置可能被电极板之间的电弧损坏。

转印缓冲液的pH值