质谱定量原则系列讲座Word格式文档下载.docx

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质谱数据如何在一个LC/MS实验中表达？

典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。

在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；

在选择离子监测SIM时，质量扫描范围较窄。

依赖于扫描的类型，一个独立的质量扫描时间可以从10ms到5秒。

在一次LC/MS分析中可获得许多个扫描。

LC/MS数据的表示方法为：

把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。

总离子流图非常像HPLC的紫外图，见图1。

。

下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。

最常见的LC/MS数据模式为：

（1） 

总离子流图

（2） 

选择离子监测（SIM）

（3） 

选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：

MRM和SRM本质上是同样的实验模式。

全扫描分析

图1

图1.gif（2.85KB）

2007-7-1717:

00

从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像HPLCUV图，除了：

质谱能检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。

总离子流是一个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。

当一个小分子或小肽流出HPLC色谱柱时，相对强度上升，在TIC图上出现了一个峰，横轴是时间。

每个质量的化合物都被记录在TIC图上。

找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。

化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。

设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度会比下面介绍的SIM实验中的强度低。

（注意：

TIC指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。

例如，我们可以在SIM或SRM实验中获得TIC图。

然而，为简单起见，我们将把这些图称为SIM和SRM图，而不是SIMTIC图。

）

SelectedIonMonitoring选择离子监测

在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。

选择的质量宽度越窄，SIM的确定度越高。

SIM图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。

只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM图中。

图1和图2是同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。

原因是在SIM图中，画的是TIC图中较少的组分。

SIM图是比TIC图更确定的图。

图2

然而，SIM图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣的化合物。

一个复杂的样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的SIM图。

许多化合物有同样的质量，在ESI中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的m/z值。

SIM实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。

SelectedReactionMonitoring选择反应监测（SRM）

SRM被大多数科学家在质谱定量中使用，见图3。

SRM中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。

SRM图非常简单，通常只包含一个峰。

这种特征性使SRM图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。

图3

图3.gif（2.36KB）

SRM的过程：

选择一个特征的母离子做MS/MS，在其碎片中选择一个特征的子离子作为监测离子。

可以把SRM理解为碎片离子的SIM。

这种特征性的实验被成为“transition”（跃迁），可以表示为：

母离子→子离子，举例：

534→375

质谱定量的原则03——建立一个SRMTransition534→375

一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。

在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。

在建立一个感兴趣的化合物的MS/MS碎片transition的时候，一种优化transition的方法是用注射泵进样（syringepump）该化合物来优化。

先在全扫描方式中优化母离子信号。

因为MS/MS的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非CID响应的MS信号。

然后优化碰撞能CE和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。

不能使用太大的碰撞能CE，因为太大的CE会丢失稳定的、有价值的碎片峰。

“我应如何优化碎片峰？

”可以用注射泵进样化合物，进行MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。

最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。

现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。

图4.gif（3.32KB）

09

从优化好的MS/MS谱中，选择一个合适的碎片峰用于定量监测。

如图A所示，母离子质量为534，似乎从图B中可以很容易选择一个碎片峰做Transition。

一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。

非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia）峰，例如：

534－517＝17。

我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia）峰做SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。

这里，Transition534→375是一个好的选择。

另外要注意的是：

要选择一个稳定的峰。

当直接进样化合物时，被选择做Transition的峰必须每次扫描响应都一致。

提示：

当优化MS条件时，最好能模拟实际做样的条件。

例如：

实际做样时色谱流速是400ul/min，化合物在30%有机相时流出，用注射泵进样优化MS条件时最好模拟这个条件，即设置HPLC流速为400ul/min，30%有机相；

然后用三通注入化合物。

同时，第一次优化实验时，我们可以选择60/60的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在C18反相柱上的色谱行为。

如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。

注：

60/60梯度的意思是：

梯度从近100%水相开始，在60分钟内到达60%有机相。

质谱定量的原则04——内标

在做MS定量时应该使用内标。

选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC进样和离子化的多样性造成的差异。

在复杂基质的分析中，在SRM积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：

两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。

只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。

一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。

我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样3次。

没有内标的情况下，重现性％RSD常常会高于20%；

而当使用内标时，%RSD能降低到近2%。

我要如何选择一个内标?

最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。

同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI离子化响应，和相似的色谱保留时间。

如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素标记的内标，是非常昂贵和耗时的。

通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。

这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。

尽量不要使用去甲基化（－14）或者是氧化的（＋16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。

常见的做内标的类似物是氯代的化合物。

氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。

我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。

我该如何使用内标？

首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血浆crash或固相萃取之前。

内标应用同一浓度水平添加（包括标样）。

内标应给出可靠的质谱响应。

应该注意的是：

内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。

“我应该添加多少量的内标？

”这是一个重要的问题。

通过做一些试分析：

早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。

这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。

举例来说：

如果待定量的样品浓度范围是100fg～25pg，检测限是100fg，你应该添加5～10pg的内标。

一个好的经验法则是：

内标物的量大概是标准工作曲线浓度最高点的1/3。

这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。

见图1

图1内标的量（内标.gif）

质谱定量的原则05——液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发

更快就是更好！

在每一个药代动力学分析中更快就是更好！

样品组/系列包括：

重复的标准品，QC质控样品，和样品，加起来大概要进行300次分析。

如果每个样品实验耗时15分钟，整套分析要75个小时。

高要求的实验（加上质谱）总计要超过3天时间。

一些该领域的研究者可以只花1～2分钟分析一个样品；

而大多数的PK/MS的实验室一般很容易做到花3～4分钟分析一个样品。

如果对上面同样的300个样，4分钟一个实验的话，总分析时间可减少到20个小时。

所以，每分钟都是很重要的！

在2mm×

30～50mm反相短柱上可以获得快速的梯度和快速的平衡时间。

LC/MS的非药动实验中，流速一般为200µ

l/min.，而在LC/MS的药动实验中，流速一般设为400～1000µ

l/min。

更快的流速有助于加速洗脱和平衡。

下面是典型的LC/MS药动实验条件：

LC/MS药动实验方法：

色谱柱：

2.1X50mm,5µ

m,100Å

C18

柱温：

40℃

流动相：

A为水相（0.1%甲酸），B为乙睛（0.1%甲酸）

流速：

400µ

l/min

梯度：

Time（min.）　　　　%B

　　　　　0　　　　　　　　25

　　　　　2　　　　　　　　80

　　　　　2.1　　　　　　　25

　　　　　4　　　　　　　　25

Notes：

a）调节初始的％B使其适应该化合物

b）试着减少梯度时间到1分钟以缩短方法时间

优化梯度：

当然你要对每个化合物特别的进行方法优化。

我们推荐创建一个色谱数据库，详细地记录实验室接手的各个化合物的疏水性（可以运行60/60方法完成）。

当你需要挑选一个相似疏水性的内标时，这样的色谱数据库将非常有用。

在长时间的梯度中，％B的起始值一旦明确，那么在缩短时间时，就把％B的值降10%。

举例来说，如果％B初始值是40%，那么在运行液质药动方法时，起始值%B就是30%。

这种方法将确保你的化合物可以留在你的柱子上。

优化柱子和流动相：

在上面举例的液相条件中，一些化合物有可能响应得不好。

一些化合物可能要求不同的有机改性试剂或有机相。

一般，磷酸盐不适用于质谱。

有些人用10～20mM低浓度的醋酸铵作A相缓冲盐。

另一些人合并甲醇和乙睛在B相中。

如果你的化合物峰形不好，需要改变几个或者所有的实验参数。

必须选用合适的柱子去获得好的回收和好的峰形。

帮助提示：

1）一个质谱实验室可能要整日忙着做色谱方法开发，尤其是如果这个实验室每周要接5～10个新化合物样品。

在组合化合物和它们的内标，进行组合的色谱方法开发方面我们颇有心得。

并不是所有的化合物适用于这种方式，但是这个方法为我们节省了大量的方法开发的时间。

当我们发现做6个化合物混合样的方法开发时间，和一个化合物的几乎一样时，这个在新的组合给药（cassettedosing）方法开发中，该方法就变得非常有用。

cassettedosing是一种新的给药方法，称为盒式给药法，又称为组合给药技术，由Ber-man等提出，即给动物同时服用几种药物，按常规取样时间取血，运用HPLC联用技术进行样品处理分析。

2）加速方法开发。

许多常见化合物如布洛芬已经有人建立了方法，检索一下文献、互联网和USP的出版物，查到这些方法。

不要浪费时间从头开始!

3）组合给药技术常常加速化合物筛选过程。

许多研究者不愿做组合实验技术，是因为害怕药物-药物相互作用。

一种可取的方式是给药后合并化合物。

合并上述的方法开发方法，可以为任务重的实验室节省大量的时间。

4）HPLC自动进样器往往是出奇的慢，记得在平衡时间里考虑自动进样器，因为当自动进样器工作时，柱子是在初始化（initial）条件下被清洗的，必须在平衡时间里考虑这个时间。

你可以从方法里砍掉30～60秒的平衡时间。

要分秒必争嘛！

从300个样品分析中，每个砍掉30～60秒，就是5个小时啊！

质谱定量的原则06—样品的制备（适用于液质药动分析的样品制备）

样品一般在血浆或血清中。

离心去除血液里的血细胞获得血浆。

血液凝固后去除固体得到血清样品。

凝固血液清除血液细胞和凝血因子。

血清比血浆易于处理，因为凝血因子已经被去除。

当使用储存的血浆时，常会发现蓬蓬的凝块物，使样品很难进入吸液管pipette。

不管是血清还是血浆，在进入反相柱分析前都要作进一步的处理。

下面会讨论几种的方法用以制备可以用作液质药动分析的血浆和血清样品。

血浆破碎（crash）（有时称蛋白沉降）

血浆破碎/蛋白沉降是最常用的方法，因为它一般不要求特殊的仪器。

用乙睛或甲醇沉淀去除丰度的白蛋白。

一个典型的方法描述如下：

前处理血浆蛋白沉淀.jpg（26.75KB）

血浆破碎（crash）/蛋白沉降方法：

1）放50?

l血浆或血清在0.5毫升管中

2）加10?

l内标

3）添加140?

l冷（冻）的有机溶剂（乙睛或甲醇）然后涡旋

4）冷冻样品2小时

5）稍稍离心样品，分离出沉淀的蛋白

6）取150?

l上清液至一干净管，加150?

l液相的A相（水相）.

在这时，样品里含的有机相大概为38％。

如果你的化合物要求更低的有机相，来保留在色谱柱上，应增加第6）步添加的水相的量。

7）把6）项的样品，进行HPLC进样做液质联用的药动分析。

固相萃取：

许多人首选固相萃取法SPE。

在SPE中，血浆或血清被直接加入一个疏水的固相中，一般是C18小柱。

加入后，用有机相淋洗小柱，则感兴趣的小分子会被洗脱下来。

SPE可以是手动的，也可以是小批量的。

手动的SPE制备方法限制了样品的通量。

可以用96孔板做自动化。

一些人认为96孔板非常贵，一个96孔板大约为100美元，但是痕量成本时应该考虑易用性和最终产品的贡献。

一些人发现：

用于液质联用药动分析的最终洗提液（eluant）质量更好，反相柱的附着物和质谱信号的滚动（roll-off）发生在较低的速率。

液液萃取：

必须承认我们在这方面没有很多经验。

这里是我所知道的。

液液萃取只工作在那些可以分隔进入有机相的化合物。

它可能是一种样品净化的有效方法。

然后，这种技术很难自动化。

药代的各种样品处理

药代的各种样品处理.jpg（97.48KB）

2007-7-1723:

29

这是一个补充的图，一种列表的方式，介绍各种前处理。

各课题组，都根据自己的需要选择方式。

梦想的方法是：

简单的沉淀、离心蛋白法。

这时候可能有堵的问题，因为处理非常简单，也许会堵。

所以各个用户买液质的时候会问卖液质的销售一个sillyquestion：

你们的仪器是不是可以直接做沉淀蛋白的，而不堵啊？

问的可爱，答的“精彩”！

质谱定量的原则07——质谱药动定量分析的标准物和创建标准曲线

简介

完整的定量分析依赖于参考标准的质量。

一种合格的参考标准，应能通过（pass）一系列定性参考标准的测试。

参考标准的定性测试要设计为：

充分地表征参考标准的质量和含量。

如果参考标准的含量不对，那么建立在其上的定量分析一定是错的。

然而，当进行“研究性药动”时，可能没有足够的时间去充分地表征化合物，因为很简单，在一周内，实验室要做三种新化合物。

所以，当面临开发一种“研究型药动”方法时，实验室应努力建立一个假定的参考标准，在做整套化合物实验室保持不变，而且实验室能够永久地获得该假定参考标准，用于日后的参考。

这个步骤能确保：

每个相对于这个假定的参考标准的药动实验能够被测量。

创建标准曲线的步骤在定量分析中也至关重要。

为了使分析可靠，这个参考标准必须可靠，在创建标准曲线上的每一点时，每一次称重和取液都必须准确无误。

下面我们介绍，在液质药动定量分析中典型的创建标准曲线的方法。

创建标准曲线

汇集所有可能知道的关于未知样品浓度范围的信息，可以有计划地绘制标准曲线。

以前曾介绍过一个快速的估算方法，早、中、晚的时间点伴随着低、中、高浓度的标准。

鬼峰将允许创建一个更适当的标准曲线范围，并会告诉你应注入多少量的样品。

这些步骤可以使你免于重复长时间的开发。

有些时间点可能包含高浓度的目标化合物。

这个初步的分析可以告诉你是否稀释，例如，最早的时间点乘以10倍，让你建立一个更合适的标准曲线。

标准曲线稀释方法举例（你用的实际步骤可能与此区别很大，只把这个例子作为参考）

在下表中的稀释步骤描述了一个3X,（3X50µ

l）制备过程，以表达最能模拟未知样品制备的实际情况。

这个表包括了：

加入有机溶剂做蛋白沉降。

标准样品的制备和用于分析的注入的体积，应该反映未知样品的分析工作。

称出大约1毫克的参考标准,并重组为一个10ug/毫升，称量不到1毫克可能增大称重误差的可能性并传递误差。

一些疏水化合物可能要求两步的重组。

例如，一种疏水化合物可能不能溶于含水量高的溶液。

试着在少量的DMSO中溶解这种化合物，然后在含最低量有机溶剂的溶液（这时化合物是稳定和可溶的）中重组。

供应这些化合物用以评估的药用化学家，常常给出你关于溶解度和稳定性的建议。

（警告：

这种稀释方法可能会出错，你必须验证它。

参考标准浓度=10µ

g/毫升（在不含血清的溶液中制备）

溶液A=1µ

g/ml 

（100µ

l参考标准+900µ

l血清）

溶液B=100pg/ml（10µ

l参考标准+990µ

l血清）

溶液C=10pg/ml 

（10µ

l参考标准+9990µ

溶液D=1pg/ml 

l溶液B+990µ

图.jpg（36.36KB）

2007-7-1814:

13

下载标准曲线法

standardcurve.rar（4.23KB）

standardcurve.rar（4.23KB）

下载次数:

49

11

（注意这个稀释程序可能有错，你必须验证它）

方法注意：

1． 

在加入有机物沉淀蛋白前，内标应与样品充分混合。

尽可能地加入低浓度有机相的内标，这样不会引起永久的沉淀。

如果可能的话，用在血清中制备的内标储液最好。

2． 

溶液A，B，C和D应该在血清中制备，这样标准曲线的样品更接近未知的、在基质中的实际样品。

3． 

当创建标准曲线时，应避免系列的稀释。

因为如果在第一次稀释时，如果犯了一个错误，那么系列的稀释将造成错误漫步在整个标准曲线上。

4． 

在配置溶液时，不要吸取<

L的液体，更小的体积将导致更大的误差。

并且，确保你的移液管是校正过的。

10

5． 

用于这个步骤的血清总量是12.7mL。

运行标准曲线：

由于标准曲线常常跨越三个（浓度）数量级，通常，标准样品从低浓度～高浓度依次做样。

这个步骤保证不受高浓度标样的色谱交叉污染。

在标准曲线运行完后，要进几针空白，直到看不到明显的色谱的记忆效应。

同样的，样品组经常运行在相反的顺序，即：

先运行最后的时间点，最后运行最早的时间点。

因为，最早的时间点样品浓度最高，所以交叉污染的可能性最大。

药动时间段之间，应该进几针空白的含水溶剂分隔开来，以避免交叉污染。

标准和样品的随机化：

有些实验室在实验前，有样品随机化的方法。

这个步骤确保不歧视任何样品。

随机化的程序经常使用完全被表征和认证过的色谱方法。

如果你遵循随机化的程序，最后你一定确信有有一个稳健的（robust）色谱方法，而不会产生显著的交叉污染。

如果要使用随机化方法，认证方法中应包含随机化方法的适应性。

运行系统的适用性（systemsuitability）:

系统适应性是任何分析中一个最重要的组成部分。

在运行样品前，先要通过（pass）系统适应性。

系统适应性提供了在正式做大量样品前，HPLC，柱子，质谱充分运行的合理保证。

然而真实情况是，即使你通过了初始化的指标测试，你的系统也可能在分析的任何点死机。

所以，在没通过系统适应性以前永远不能开始做样！

系统适应性的测试回答了这个问题：

“我这样做分析对么？

我应该继续做样品分析么？

”不同的实验室、不同的分析，系统适应性都不同。

在我们的实验室，用于定量分析的系统适应性包括：

色谱峰形计量；

达到一个定义好的允许的检出限；

运行全部的标准曲线；

在进实际样品前通过一定的计量要求的％RSD，和最终通过空白样品测试。

由于色谱柱可能会在大量样品组运行的中间失效，我们制订了一条规则：

一旦运行了500次血浆沉淀进样的样品，就更换色谱柱。

大量的实验花费大量的时间和金钱，及时更换柱子确保了省时省钱。

我知道，很难丢掉一个好的HPLC色谱柱，但是最终，实验室将会花费较少的时间去做那些导致停止工作的故障诊断。

“质控”“QCs”

质控是指使用一系列标准品，去检查上面描述的标准曲线的准确度。

质控通常设置在标准曲线的低、中、高三个区域，和未知样穿插进行。

可以把质控看成是独立的衡量参考标准。

在最严格的意义上，质控应由第二个独立的分析人员衡量参考