细胞培养基质量标准及检验方法Word格式.docx
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澄清度
澄清
中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。
pH值(每升标示量/L)
pH允许偏差范围为±
0.30
中华人民共和国药典2010年版附录ⅥH进行。
渗透压(mOsm/kgH2O)
渗透压允许偏差范围为±
5%
中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨG渗透压摩尔浓度测定法进行。
干燥减量的质量分数(%)
≤5.0
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅧL干燥失重测定法进行。
细菌内毒素(EU/ml)
≤10
按中华人民共和国药典2010年版附录ⅪE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。
微生物限度
细菌数(CFU/g)
≤200
按中华人民共和国药典2010年版附录ⅪJ微生物限度检查法进行,检查项目为细菌数、霉菌数。
检查法采用平皿法。
霉菌数(CFU/g)
≤50
细胞生长试验(vero细胞)
细胞形态
成纤维样贴壁生长,形态正常无变异
按中华人民共和国化工行业标准《哺乳类动物细胞培养基》HG/T3935-2007第7.7条进行。
细胞数量
培养72h细胞数量不低于1×
105cells/ml;
继续维持48h细胞数量不低于1×
105cells/ml
牛血清白蛋白
不得检出
依据中华人民共和国药典2010年三部附录ⅧI牛血清白蛋白残留量测定法进行,不得检出牛血清白蛋白。
抗生素
依据中华人民共和国药典2010年三部附录ⅨA抗生素残留量测定法进行,不得检出青霉素、链霉素及庆大霉素。
二、检验方法
除非另有说明,检验中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2010年版中规定的纯化水。
2.1澄清度的测定
称取每升标示量的实验室样品,置于1000ml烧杯中,加水950ml,搅拌至溶解,补加水至1000ml,搅拌均匀。
按中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅨB进行。
2.2pH值的测定
称取每升标示量的实验室样品,置于1000ml烧杯中,加水950ml,搅拌至溶解,补加水至1000ml,搅拌均匀。
按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤA进行。
2.3干燥减量的测定
按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅦL干燥失重测定法进行。
2.4渗透压的测定
按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤH渗透压摩尔浓度测定法进行。
取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果,两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。
2.5细菌内毒素的测定
按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅫE细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。
2.6微生物限度的测定
按中华人民共和国药典2010年三部附录ⅫG微生物限度检查法进行,检查项目为细菌数、霉菌数。
2.7细胞生长试验
2.7.1贴壁型细胞生长试验
2.7.1.1方法提要
1)本试验所用容器具及溶液均为无菌,试验操作过程均为无菌操作。
2)细胞在37℃恒温条件下,在含体积分数3%或10%的小牛血清的细胞培养液中生长72h,观察细胞形态并进行细胞计数;
细胞生长72h后,更换不含小牛血清的细胞培养液,继续培养48h,观察细胞形态并进行细胞计数。
2.7.1.2试剂和材料
1)牛血清:
符合中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅩⅢD。
2)平衡盐溶液:
称取氯化钾0.2g,精确至0.01g;
无水磷酸二氢钾0.2g,精确至0.01g;
氯化钠8.0g,精确至0.01g;
无水磷酸氢二钠1.15g,精确至0.001g;
加纯化水1000ml,混匀,测pH值,pH值应在7.5±
0.3,过滤除菌即得。
3)细胞:
vero细胞(或根据不同的细胞培养基种类选择适应的细胞):
细胞代次不超过150代。
4)细胞培养液:
按产品使用说明书要求配制;
3)胰蛋白酶溶液:
称取胰蛋白酶(1:
250)2.5g,精确至0.01g,加1000ml平衡盐溶液,混匀、测pH值,用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调pH值7.6~7.8,过滤除菌即得。
2.7.1.3仪器
1)医用净化工作台:
洁净级别为百级.
2)二氧化碳恒温培养箱:
能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为(5±
0.1)%,能在(37±
1)℃恒温。
3)细胞培养瓶:
T25型、无菌。
4)显微镜:
倒置、相差。
5)血球计数板。
6)盖玻片:
无水乙醇浸泡并擦干。
2.7.1.4试验步骤
1)制备细胞悬液
A取长成致密单层的细胞种子,将原细胞培养液从细胞培养瓶内吸出,用适量平衡盐溶液洗细胞一次,弃洗液(去除死细胞)。
B向细胞培养瓶内加入胰蛋白酶溶液1ml,消化一定时间,在显微镜下观察,当细胞变圆接近脱壁时,将胰蛋白酶溶液倒掉。
C根据细胞数量加入一定量细胞培养液,用吸管吹打,使细胞脱壁制成细胞悬液A。
2)细胞培养
A吸取一定量的细胞悬液A,加到细胞培养瓶内。
B向细胞培养瓶内加至10ml含体积分数为3%或10%的小牛血清的细胞培养液,使细胞接种数量为5×
104细胞/ml。
C将细胞培养瓶送入培养箱,在(37±
1)℃温度条件及(5±
0.1)%二氧化碳条件下进行培养。
D培养72h,观察细胞形态,按照2.7.1.4步骤1)方法制备细胞悬液,进行活细胞计数。
E培养72h后,更换不含牛血清的细胞培养液10ml,继续培养48h,观察细胞形态,按照2.7.1.4试验步骤1)方法制备细胞悬液,进行活细胞计数。
3)细胞计数
A将需要计数的细胞按按照2.7.1.4步骤1)方法制备细胞悬液B。
B吸取细胞悬液B100μl转移至离心管中,视细胞量确定是否稀释及稀释倍数。
C将盖玻片盖于计数板中心的计数室上方。
调整计数板中的细胞数量在(100~300)个。
沿盖玻片边缘点加细胞悬液使其通过毛细作用自然渗入,不要留有气泡,不要外溢,显微镜下计数。
D观察计数板四角大方格中的细胞数,细胞压中线时,一般遵循“计左不计右,计上不计下”的原则。
将计数板观察细胞数代入下列公式:
计数板观察细胞数×
104×
稀释倍数/4=细胞数/ml
2.7.1.5分析结果的表述
培养72h的细胞,细胞形态应正常,活细胞数量应达到1×
105个/ml以上。
继续维持培养48h的细胞形态应正常,活细胞数量应不小于1×
2.7.2悬浮型细胞生长试验
2.7.2.1方法提要
本试验所用容器具及溶液均为无菌,试验操作过程均为无菌操作。
细胞在37℃恒温条件下,在细胞培养液中悬浮生长72h,观察细胞形态,进行72h细胞计数。
2.7.2.2试剂和材料
1)细胞:
已适应待检细胞培养基的悬浮细胞株。
2)细胞培养液:
2.7.2.3仪器
1)医用净化工作台:
洁净级别为百级;
2)恒温震荡培养箱:
能在(37±
1)℃恒温;
3)细胞培养瓶:
250ml摇瓶,应无菌;
4)显微镜:
倒置、相差;
2.7.2.4细胞培养
1)用方瓶或摇瓶扩增细胞;
2)离心细胞,用待测细胞培养液重悬细胞,计数,计算出所需要的细胞数;
3)将细胞转至摇瓶中,细胞数量接种数量为2.5×
105个/ml,加液量20ml左右;
4)将摇瓶细胞移至恒温培养箱中培养,转速90~100rpm,温度37℃;
5)培养72h,记录细胞数量和活率(采用0.4%的台盼蓝染色法计数及计算活率)。
2.7.2.5细胞活率计算
1)细胞染色:
取吸管1支,伸入培养瓶中,轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后,立即吸细胞悬液少许,向另一离心管中滴入细胞悬液1份,再滴入台盼蓝染液1份,混匀,置2~3分钟。
2)计数:
按2.7.1.4步骤1)进行。
镜下观察可见细胞分散各处,健康细胞胞体完整,透明不着色,凡着色细胞均为死细胞。
记录活细胞数及细胞总数。
3)活率计算细胞活率%=(活细胞数量/细胞总数)×
100%
2.7.2.6分析结果的表述
悬浮培养72h的细胞形态应正常,培养72h细胞数量应达到1.0×
106个/ml以上,活率应达到90%以上。
2.8牛血清白蛋白残留量
依据中华人民共和国药典2010年三部附录ⅧI牛血清白蛋白残留量测定法进行,不得检出牛血清白蛋白。
2.9抗生素残留量
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