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流动相：

0.01mol/L草酸溶液（pH=2.5）-乙腈（80：

20）；

流速：

1mL/min;

柱温：

室温；

紫外检测器：

检测波长：

355nm。

（2）将上述已制备好的不同浓度的四环素标准系列溶液一次进样20L，依据四环素的峰面积定量。

以标准系列溶液的浓度为横坐标，其相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。

（3）样品的测定：

取已处理好的样品溶液20L进样分析，根据峰面积带入回归方程中计算。

五、结果计算

按下式可计算出蜂蜜中四环素的含量

X=C×

V/m

式中：

X为试样中四环素的含量，单位为g/g;

C为从标准曲线计算得到的被测组分溶液浓度，单位为g/mL；

V为试样溶液定容体积，单位为mL；

m为试样溶液所代表的试样质量，单位为g。

六、注意事项

（一）流动相使用前必须经过脱气。

如果流动相中含有气体，在较高的柱压下会产生气泡，使流动相流动受阻，对分离样品产生不利影响。

（二）固相萃取柱使用前应用5mL甲醇和10mL水活化。

（凌云）

第二节液相色谱-串联质谱法测定水产品中的氟苯尼考

（一）基本熟悉现代食品安全检测技术中高效液相色谱-串联质谱联用技术的测定方法和特点；

（二）了解液质联用技术的基本原理以及在食品安全检测中的重要性。

氟苯尼考又名氟洛芬、氟甲砜霉素，分子式为C12H14Cl2FNO4S；

分子量为358.2127；

结构式为

。

氟苯尼考是一种兽用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。

样品中的氟苯尼考在碱性条件下，用乙酸乙酯提取，提取液经旋转蒸发挥干，残渣以水溶解，经正己烷液-液萃取脱脂。

液相色谱-串联质谱仪，以氘代氯霉素（d5-氯霉素）为标，MRM离子对方式检测，标法定量。

三、试剂和仪器

甲醇（HPLC）、乙酸乙酯（AR）、正己烷（AR）、氨水（AR，25%～28%）、无水硫酸钠（AR）、氟苯尼考和氘代氯霉素（d5-氯霉素）标准物质（纯度>

99%）、超纯水。

液相色谱-串联质谱仪（API4000Qtrap），配电喷雾电离离子源（ESI）；

分析天平，感量0.01mg和0.001g；

离心机，≥4000r/min；

小型台式离心机，≥13000r/min；

组织捣碎机；

匀浆机；

减压旋转蒸发仪；

涡旋振荡器；

聚丙烯离心管：

带盖，50mL，1.5mL；

鸡心瓶：

25mL；

具塞比色管等。

（一）标准溶液配制

1．100μg/mL标准储备液的配制：

称取适量氟苯尼考标准物质，用甲醇配成100μg/mL的标准储备液，于-18℃冰箱保存备用。

2.1μg/mL标准储备液的配制：

准确吸取1.00mL100μg/mL标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，于-18℃冰箱保存备用。

3.标标准溶液：

氘代氯霉素（d5-氯霉素），100μg/mL，溶剂为乙腈，氘化度≥98%。

4.1μg/mL标标准储备液：

准确吸取1.00mL标标准溶液于100mL容量瓶中，用甲醇稀释、定容至刻度，于-18℃冰箱保存备用。

5.20ng/mL标标准中间液：

准确吸取1.00mL标标准储备液于50mL容量瓶中，以超纯水稀释至刻度，于4℃冰箱保存备用。

6.标准工作溶液的配制：

分别准确吸取一定量的标准储备液和标标准中间液，以空白基质溶液配成10、50、100、200、500ng/mL，含标10ng/mL的标准工作溶液。

（二）样品的制备

1.标记：

从所取样品中，取出有代表性的可食部分约500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器，密封，并标明标记。

2.提取：

称取5g充分捣碎均匀的试样，精确至0.001g，置于50mL聚丙烯离心管中，加入标标准中间液75.0μL，加入25mL乙酸乙酯，0.75mL氨水，3g无水硫酸钠，匀浆提取30s，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中。

另取一50mL离心管，加入20mL乙酸乙酯，0.60mL氨水，洗涤匀浆刀10s，洗涤液转移至第一支离心管中，用玻棒搅动残渣，涡旋振荡提取1min，超声波振荡提取5min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL比色管，乙酸乙酯定容至50.0mL。

摇匀后移取10.0mL乙酸乙酯提取液于25mL鸡心瓶，45℃减压旋转浓缩至干。

3.净化：

鸡心瓶中的残渣用2.00mL水溶解，涡旋振荡混匀，超声5min，加入3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷涡旋振荡混合30s，静置分层，移取部分下层的水相至1.5mL的聚丙烯离心管中，13000r/min离心5min，0.2μm滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

4.空白基质溶液的制备：

称取5g空白样本，精确至0.001g，除不加入标标准中间液，其它按照样品制备、净化的步骤进行。

（三）液相色谱条件

1.色谱条件

安捷伦ZorbaxXDBC-18，5μm，150mm×

2.1mm；

柱温：

40℃；

甲醇-水（4/1）；

0.40mL/min；

进样量：

10μL。

2.质谱条件

离子源：

电喷雾电离离子源（ESI）；

扫描方式：

负离子；

检测方式：

多反应选择离子检测（MRM）；

质谱条件的优化：

以1μg/mL的氟苯尼考和氘代氯霉素标溶液，针泵直接进样，流速5μL/min，分别进行MS1、MS2的优化，确定相应质谱参数，选择合适的检测离子对。

电喷雾电压（IS）：

-4200V；

辅助气温度（TEM）：

600℃，其它参数见下表5-2-1：

表5-2-1氟苯尼考、氘代氯霉素（d5-氯霉素）质谱参数

名称

定性离子对

（m/z）

定量离子对

采集时间

（ms）

去簇电压DP

（V）

碰撞能量CE

氟苯尼考

356.0/336.0

200

-75

-15

356.0/185.0

-25

氘代氯

霉素

326.0/157.0

-55

-26

以标法定量，在优化的最佳条件下，对基质标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分的峰面积与氘代氯霉素峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分的浓度（或被测组分浓度与氘代氯霉素浓度的比值）为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，得提取液的含量C。

按下式计算出蔬菜中被测组分的含量

X——试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C——从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；

V——样品溶液最终的定容体积，单位为毫升（mL）；

m——称取试样的质量，单位为克（g）。

（一）样品采集要均匀、具有代表性；

（二）试样要捣碎、匀浆彻底；

（三）流动相要过滤、脱气，并现时配制；

（四）避免样品污染；

（五）色谱柱要充分平衡。

（马安德）

第三节电感耦合等离子体质谱法检测茶叶中铅、砷及镉含量

（一）掌握电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定元素含量的原理、分析过程中的各项干扰情况及其消除方法、基本分析步骤

（二）熟悉电感耦合等离子体质谱仪的基本构造及操作

（三）掌握元素（总量）分析的样品前处理方法

ICP-MS由进样系统、离子源和质谱仪三个主要部分构成。

样品溶液经过雾化由载气送入ICP炬焰中，经过蒸发、解离、原子化、电离等过程，转化为带正电荷的正离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离。

对于一定的质荷比，质谱积分面积与进入质谱仪中的离子数成正比。

即样品的浓度与质谱的积分面积成正比，通过测量质谱的峰面积来测定样品中元素的浓度。

（一）试剂

硝酸（优级纯）

H2O2（优级纯）

纯水：

电阻率大于18.0MΩ·

cm。

铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）混合标准使用溶液：

10mg/L。

锗（Ge）、铟（In）、铋（Bi）标溶液：

100μg/L

（二）仪器

ThermofisherXSeriesII电感耦合等离子体质谱仪

Millipore超纯水制备仪

美国CEMMars微波消解仪及配套消解管和架子

精确控温电热消解器

千分之一天平

100L、1mL、5mL可调移液器各一支，以及相应吸头若干

100mL容量瓶11个、1000mL烧杯1个、10mL量筒1个、1000mL量筒1个

（一）仪器开机预热

（以下步骤基于实验老师将仪器预先调整到Vacuumready状态下进行）

检查Ar气压力是否在0.6~0.7MPa围，排风是否正常，电源是否稳定；

打开计算机，启动Windows，打开循环冷却水的电源；

双击“PlasmaLab”图标，进入操作软件主窗口。

检查蠕动泵、ICP炬管、雾化室，关闭ICP等离子体发生器窗门；

点击on点火；

待仪器点火后，预热；

（二）标准溶液系列的制备

1.于1000mL烧杯中加入594mL去离子水，再定量吸取6mL浓硝酸加入烧杯中，搅拌、冷却，配制成（1+99）的硝酸溶液；

2.于5个100mL的容量瓶中分别加入0、50L、200L、1mL和2.5mL的铅（Pb）、砷（As）、镉（Cd）混合标准使用溶液（10mg/L），用（1+99）的硝酸溶液定容至刻度，配制成浓度浓度分别为0、5、20、100、250g/L标准溶液系列；

（三）样品处理

1.称取0.5g茶叶样品，记下样品具体重量（精确到小数点后第三位），平行样品数为三份

2.将称量好的三份平行样分别放入3支微波消解管中，再取3支微波消解管作制备试剂空白用；

每支消解管中分别加入5mL浓硝酸和1mLH2O2，盖上消解管瓶塞及盖子；

6支消解管对称放入微波消解架上，放入微波消解仪中，按照表5-3-1消解程序进行样品消解；

表5-3-1茶叶样品微波消解程序

功率

爬升时间

温度

保持

800W

5min

178℃

3.微波消解程序结束后，将消解管放到精确控温电热消解器上进行赶酸操作，温度设定100℃，加热10h；

4.赶好酸的试剂空白及样品分别转入6个100mL容量瓶中，每支消解管用少量超纯水清洗3~5次，清洗液也转移至容量瓶中，最后用超纯水定容至刻度，制备成样品溶液剂试剂空白。

（四）测定

1.使用调谐液调整仪器各项指标，使仪器灵敏度、氧化物、双电荷分辨率等各项指标达到测定要求，仪器参考条件如下：

RF功率为1400W，载气流量为0.93L/min，采样深度为150mm，雾化器为同心雾化器、采样锥类型为镍锥，具体仪器条件应该以实际调整所获条件为主；

2.编辑测定方法、干扰方程、选择各测定元素及标元素、选择校准方法、输入标准系列浓度；

3.引入在线标溶液，观测标灵敏度、待标信号稳定后分别测定试剂空白、标准系列、样品溶液；

4.绘制标准曲线、计算回归方程、获取试剂空白及样品溶液浓度

（五）关机

测定完毕，分别用5%硝酸溶液、超纯水冲洗样品管和标管直至仪器响应值回到基线；

点击off熄火，关闭循环水及Ar气，将进样系统的蠕动泵管放松，关闭计算机。

茶叶样品中各待测元素的含量由以下公式计算：

其中，W为茶叶样品中各待测元素的含量（g/g）；

C样为仪器所测定的样品溶液浓度（g/L）；

为仪器所测定的试剂空白浓度的平均值（g/L）；

m为茶叶样品重量（g）

最终茶叶样品中各待测元素的含量应以三个平行样品的含量均值来表示：

其中

为茶叶样品中各待测元素的含量均值；

SD为标准偏差。

（一）干扰及其消除

电感耦合等离子体质谱法测定复杂样品时常存在以下干扰，在试验过程中应该注意消除干扰影响。

1同量异位素干扰

相邻元素间的异位素有相同的质荷比，不能被四极质谱分辨，可能引起异位素严重干扰，选择待测元素时应避免选择有同量异位素干扰的元素。

2.丰度较大的同位素对相邻元素的干扰

丰度较大的同位素会产生托尾峰，影响相邻质量峰的测定。

可调整质谱仪的分辨率以减少这种干扰。

3.多原子（分子）离子干扰

由两个或三个原子组成的多原子离子，并且具有和某些待测元素相同的质荷比所引起的干扰，本实验中可能存在的多原子（分子）离子干扰见表5-3-2。

多原子（分子）离子干扰很大程度上受仪器操作条件的影响，通过调整或者干扰校正方程可以减少这种干扰。

表5-3-2常见的分子离子干扰

分子离子

质量

受干扰元素

40Ar35Cl+

75

As

ZrO

106~112

Cd

MoO

108~116

本实验中，氧化物的干扰可通过调整仪器参数、降低氧化物生成来减少干扰；

而As的干扰可以通过干扰校正方程来消除，校正方程为：

75As=75M－x[82M－y（83M-z83Kr）]

其中，x、y、z的参考值分别为3.1285、0.8740、1.0074，具体数值以77ArCl、82Se和83Kr的实际仪器响应来计算。

4.物理干扰

包括检测样品标准溶液的粘度、表面力和溶解性总固体的差异所引起的干扰。

用标物可校正物理干扰。

5.基体抑制（电离干扰）

易电离的元素增加将大大增加电子数量而引起等离子体平衡转变，通常会减少分析信号，称基体抑制。

用标法可以校正基体干扰。

6.记忆干扰

经常清洗样品导入系统以减少记忆干扰。

（二）仪器稳定性监测

测定过程中，应随时留意标元素的仪器响应情况，如标元素仪器响应出现大幅度波动，应查明原因再重新测定。

（三）样品制备

由于样品赶酸过程较长，样品制备应提前进行。

（洪涛）

第四节离子色谱法测定自来水中氟离子、氯离子含量

一、实验目的

（一）掌握离子色谱法测定自来水中氟离子、氯离子含量的基本原理及实验方法。

（二）熟悉离子色谱仪的测定方法。

（三）了解化学抑制的工作原理。

二、实验原理

样品通过进样阀注入仪器，并随碳酸盐-重碳酸盐淋洗液进入离子交换柱系统（由保护柱和分离柱组成），由于样品中各种阴离子对分离柱中阴离子交换树脂的亲和力不同，移动速度亦不同，从而进行分离。

已分离的阴离子流经阳离子交换柱或抑制器系统转换成具高电导度的强酸，淋洗液则转变为弱电导度的碳酸。

由电导检测器测量出各阴离子组分的电导率，以相对保留时间和峰高或面积定性和定量。

（一）仪器

1.离子色谱仪

2.全自动进样器

3.阴离子分离柱

4.超声波清洗器

5.超纯水系统

6.真空泵

7.过滤器

8.十万之一分析天平

9.滤膜：

0.22m

10.聚乙烯塑料容量瓶：

1000m1、100m1

（二）试剂

1.氟标准储备液（1000mg/L）

2.氯标准储备液（1000mg/L）

3.碳酸钠：

分析纯

4.碳酸氢钠：

5.硫酸：

优级纯

6.去离子水

（一）水样预处理

吸取10mL自来水样过0.22m孔径的微滤膜过滤除去浑浊物质，然后上机待测。

（二）溶液的配制

1..氟（10.0mg/L）、氯（100.0mg/L）混合标准使用液：

分别吸取将氟标准贮备液1m1，氯标准储备液10m1，置于100mL容量瓶中，然后用去离子水稀释至刻度，摇匀。

2.氟、氯标准溶液的绘制：

准确吸取1、2、5、10、20mL氟、氯混合标准使用液分别置于100mL容量瓶中，最后用去离子水稀释至刻度，摇匀。

3.淋洗液的配制（碳酸钠1.8mmol/L/碳酸氢钠1.7mmol/L）：

准确称取碳酸钠0.1908g/L、碳酸氢钠0.1428g/L（于105℃下烘干2小时，并保存在干燥器），溶于去离子水中，并转移到1000mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀，并经真空泵过滤、除气，备用。

4.再生液的配制（50mmol/L）：

准确吸取3mL硫酸到1000mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀。

5.冲洗液：

去离子水。

（三）仪器的条件

1.柱温：

室温

2.淋洗液流速：

1.0mL/min

3.进样量：

20l

（四）样品测定

1.装上淋洗液，依次打开全自动进样器、主机、连接色谱工作站的电脑开关。

2.调节淋洗液和再生液流速，使仪器达到平衡，并指示稳定的基线。

3.建立测定方法。

4.待基线走稳后，用氟离子、氯离子的混合标准系列溶液进样（可分别得到两种离子的工作曲线）绘制标准曲线。

5.将预处理后的自来水样品注入色谱仪进样系统，记录峰高或峰面积。

6.测量完毕后，冲洗柱子。

7.关泵。

根据测出的样品峰面积，仪器可直接在标准曲线上查得各阴离子的质量浓度（mg/L）。

如有稀释需乘以稀释倍数。

C样=C检×

稀释倍数

C样为样品的质量浓度，单位为毫克每升mg/L；

C检为在标准曲线上查出的质量浓度，单位为毫克每升mg/L。

（一）由于进样量很小，操作中必需严格防止纯水、器皿以及水样预处理过程中的污染，淋洗液应用去离子水配制，不宜配制太多、放置时间太长。

（二）为了防止保护柱和分离柱堵塞，样品必须过0.22m孔径的微滤膜。

（三）每次开机后，观察白色的再生液和冲洗液的废液管是否有液体流出，是否被堵。

（四）离子色谱仪长期不用时也要定期用超纯水清洗或将柱子卸下密封保存。

（梅）

第五节气相色谱-质谱法测定蔬菜中的敌敌畏和甲拌磷含量

（一）了解气相色谱-质谱联用仪的基本结构及原理；

（二）了解气相色谱-质谱仪使用的方法；

（三）了解蔬菜中有机磷农药的提取方法；

（四）熟悉气相色谱-质谱法的定性、定量的方法；

（五）掌握标标准曲线法的定量方法。

二、实验原理

样品用乙腈匀浆后过滤，滤液盐析后离心，取上清液经固相萃取柱净化，用乙腈+甲苯（3+1）洗脱，洗脱液浓缩后，用气相色谱-质谱仪测定。

气相色谱-质谱仪的工作原理：

样品中各组份经气相色谱分离后进入质谱仪，被离子源轰击成不同质荷比（m/z）的碎片离子。

碎片离子经过质量分析器后，由离子流检测器检测，并按照m/z的大小输出质谱图，以离子流强度为纵坐标，保留时间为横坐标输出色谱图。

利用组分的保留时间和质谱图进行定性分析，用峰面积或者峰高进行定量分析。

标标准曲线法：

将待测组分的纯物质配置成不同浓度的系列标准溶液（

），分别加入等量的标物质，在一定实验条件下分析，测得待测组分的峰面积

及标的峰面积

，以

对

作图得标标准曲线

再将同样量的标物加入到待测样品中，进样分析，测出

，由标准曲线求得待测组分的含量。

（一）仪器GC-MS（2010QPPlus，日本岛津公司）；

自动固相萃取仪或手动固相萃取仪；

均质器；

离心机，电子天平（精度分别为0.001g和0.00001g）；

氮气吹干仪；

100uL/1000uL可调移液器；

鸡心瓶；

微量进样器。

（二）试剂乙腈、甲苯、正己烷、氯化钠，均为优级纯。

Envi-18和Envi-Carb活性炭固相萃取小柱（3mL,0.5g）。

敌敌畏、甲拌磷和环氧七氯标准品（纯度>

95%，国家标准物质研究中心）。

敌敌畏、甲拌磷和环氧七氯标准母液（1.0mg/mL）:

精确称取10.00mg标准物质于10.0mL容量瓶中用正己烷定容。

准确移取敌敌畏和甲拌磷标准母液各1mL置10mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度，得含0.1mg/mL敌敌畏和甲拌磷的混合标准溶液。

准确移取该溶液0，0.0025，0.005，0.01，0.02，0.05mL于5mL容量瓶中由空白基质提取液定容，得标准工作液0，0.05，0.10，0.20，0.40，1.00g/mL。

环氧七氯标工作标准溶液（40.0g/mL）：

准确移取1mL环氧七氯母液于25mL量瓶中，用正己烷稀释至刻度。

（一）仪器操作步骤：

1.确认处于正常工作状态。

2.对仪器进行调谐，获得调谐报告。

3.编辑检测方法，将检测方法发送给仪器，等待仪器达到设定好的条件。

4.编辑样品测定序列，将标准溶液和样品溶液放于自动进样器样品盘中。

5.仪器稳定后，开始测试。

6.样品测定完毕后，进行数据分析。

（二）检测条件　色谱柱：

Rxi-5ms,30m×

0.25mm×

0.25m；

色谱柱温度程序：

50℃保持2min，然后以50℃/min程序升温至180℃，再以5℃/min升温至280℃，保持1min,在以50℃/min升温至300℃，保持1min；

载气：

氦气，纯度≥99.999%，流速：

1.0mL/min；

进样口温度：

250℃；

1μL；

进样方式：

无分流进样，4.5min后打开流阀和隔垫吹扫阀；

电子轰击源：

70eV；

离子源温度：

250℃。

GC-MS接口温度：

选择离子监测。

监测离子见下表5-5-1：

表5-5-1待测组分及标的定量离子和定性离子

化合物名称

定量离子（强度）

定性离子（强度）

驻留时间/s

敌敌畏

109（100）

185（22），145（6）

0.15

甲拌磷

260（100）

121（429），231（11