枯草芽孢杆菌的分离及筛选教学文案Word文档格式.docx

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后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽抱杆菌。

再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。

3实验材料

3.1选择培养基

本次实验进行产淀粉酶的枯草芽抱杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基。

配方:

牛肉膏5.0g

蛋白胨10.0g

氯化钠5.0g

可溶性淀粉10.0g

琼脂20g

蒸馏水1000ml

调整pH至7.2

配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。

3.2溶液或试剂

牛肉膏1.25g

蛋白胨2.5g

氯化钠1.25g

可溶性淀粉2.5g

琼脂5g

碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠

45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钻25克，重铬酸钾3.34克，100毫升0.01NHCL。

3.4仪器或其他用品

平板培养皿10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。

4实验流程

倒平板f制备梯度稀释液f涂布f培养f初筛f复筛f纯化f保存

5实验步骤

实验前准备

制备淀粉培养基，无菌水，在121摄氏度下灭菌20min。

倒平板。

把接种

工具，培养基，和其他用品全部在超净工作台上摆好，进行紫外线灭菌

30min。

5.1制备土壤稀释液

取土样时最好选取如花坛等地方的土样，选好采样地点，铲产去表层

5cm,取5〜15cm处。

用无菌器具规范采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。

采样后应尽快分离。

振摇约二十分钟，使土样与水充分混合，将细胞分散。

放入盛有99ml无菌水三角

瓶中，常压80度的水浴处理样品1小时后，取出。

用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推，制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀释度的土壤溶液。

5.2涂布

将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-3、10-4、10-5三种

稀释度，然后用无菌吸管分别由10-3、10-4、10-5三管土壤稀释液中各吸取0.2ml，小心地滴在对应平板培养基表面中央位置。

用无菌涂布器涂布。

右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。

室温下静置5〜10min，使

菌液浸入培养基。

5.3培养

将淀粉培养基平板倒置于30°

C培养箱中培养1〜3d。

5.4初筛

观察菌落表面粗糙不透明，呈污白色或微黄色，将这样的菌种单个菌落分别挑取少许细胞接种到培养基上，置于30°

C的培养箱中培养，若发现有杂菌，需要再一次进行分离纯化。

（如不能用肉眼更好的观察，可对其进行革兰氏染色，在显微镜下观察，与标准菌种比较。

）

5.8复筛

测定其淀粉酶活。

5.8.1试剂和器材

1、试剂:

（1）碘原液：

称取碘11克，碘化钾22克，加水溶解，稀释至500毫升。

（2）稀碘液：

取碘原液2毫升，加碘化钾20克，稀释至500毫升，此试剂随配随用。

（3）2%淀粉液：

称取干燥过的可溶性淀粉2克，加5毫升蒸馏水，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的蒸馏水中。

继续煮沸2分钟，冷却至室温，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH为6）

（4）柠檬酸缓冲液：

称取磷酸氢二钠（Na^HP04•12H2O）45.23克，柠檬酸（C6H8O7・H2O）8.068克，加水溶解，稀释至1000毫升。

（5）标准比色液：

称取氯化钻（C0CL2•6H2O）25克和重铬酸钾3.34克溶于100毫升0.01NHCL，其五倍稀释作标准。

（6）样品：

细菌-a淀粉酶

2、器材

（1）电热恒温水浴

（2）试管

（3）量筒（4）吸量管（1ml）

5.8.2操作方法：

1、取试管1支，加20毫升2%淀粉，混匀，在30E水浴中，使管内温度达到30r。

2、将淀粉酶0.5ml加到30r的淀粉液中，混匀，在30r水浴中保温，自加入记时，经5分钟后取反应液1毫升，加入盛有5毫升稀碘液的试管中。

混匀，目测比色，每隔一定时间重复测定，直至呈色与标准比色颜色相同为止，

记录反应进行的时间。

3、计算。

在上述条件下，每一小时催化1毫升2%可溶性淀粉水解的酶

量，定为一个酶活力单位。

5.9纯化并保存

菌种保存时一般都需要不受杂菌污染，菌种变异很少，并能尽量保持细菌的形态和生理性状不发生变化。

同时，做好以下工作：

（1）做好菌种保存记录，注明菌种名称，分离年月日、分离者姓名、分离地点等。

（2）防止杂菌污染及意外事故，把菌种保存在2—3只试管中备用。

（3）原始菌种妥善保存。

6结果与分析

6.1分离到枯草芽抱杆菌菌的株数

6.2枯草芽抱杆菌产酶活性大小及形态观察鉴定结果

【注明参考文献，格式参考学术论文样式】

枯草芽抱杆菌的鉴定实验

1、形态的观察（形状、颜色、质地、透明度等）

（1）单个菌体的形态

（2）群体形态的观察

2、革兰氏染色

3、芽抱染色

4、菌体大小测量

5、枯草芽抱杆菌的生理生化鉴定：

一、过氧化氢酶测定

1、原理：

过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和氧

2、试剂：

3〜10%过氧化氢

3、操作步骤：

将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30培养1〜2天。

取一

干净载玻片，在上面加一滴3〜10%的过氧化氢，挑取一环培养1〜2天的菌苔，在过氧化氢溶液中涂抹，若有气泡（氧气）出现，记作过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。

也可将液直接加入斜面上，观察气泡的产生。

二、需氧性试验

不同种类的芽抱杆菌对氧气的需求性常有差异，因此本实验可作为鉴定芽抱杆菌的一个较重要指标。

2、培养基：

半固体培养基3、操作步骤：

用一小环的肉汤菌液穿刺接种到上述培养基中（必须穿刺到管底），一般于30

培养3—7天观察结果。

若芽抱杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿着穿刺线

上生长者为厌氧菌或兼性厌氧菌三、乙酰甲基甲醇实验1、原理：

本实

验是测定芽抱杆菌（或其他细菌）发酵葡萄糖的变化。

有些芽抱杆菌发酵葡萄糖产酸，并将产生的酸进一步转化为中性化合物，如乙酰甲基甲醇或的胍基

起作用，生成红色化合物，即表示2,3-丁二醇。

乙酰甲基甲醇在碱性环境中可被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中精氨酸所含V.P.试验阳性。

若

在培养基中加入少量肌酸以补充胍基，可加速反应。

反应式如下：

2丙酮酸一

—＞乙酰甲基甲醇+2二氧化碳；

-2H乙酰甲基甲醇＞二乙酰；

+KOH

缩合二乙酰+NH=C（NH2）2＞红色化合物2、培养基和试剂培养

基：

蛋白胨5g,葡萄糖5g,NaCl5g，蒸馏水1000ml。

调节PH6.5,每管分装4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min灭菌试剂：

3、步骤：

1.接种与培养将芽抱杆菌测试菌接种于上述培养液中，一般于30摄氏度培养4天。

2.

结果观察在培养4天后，取培养液（约2ml）和等量的40%NAOH相混合，如少量肌酸（约0.5—1mg），充分振荡，2—5min后如培养液呈红色，即为V.P.试验阳性，有时须放置更长时间才出现红色反应。

四、淀粉水解1、原

理：

许多芽抱杆菌产生淀粉酶，能将培养基中的淀粉水解成无色糊精等小分子

物质或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖，淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

2、

培养基及试剂：

培养基：

在肉汤琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装于三角瓶。

0.1MPa（15lbf/in2）20min灭菌备用。

试剂：

将培养

基融化后，冷却至50摄氏度左右，倒成平板，凝固后取菌种点钟于平板上

（每皿点钟2点），一般于30摄氏度培养2—4天，形成菌落后，在平板上滴加卢哥尔氏碘液，以铺满菌落为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有五色透明圈出现，说明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。

卢哥尔氏

碘液40%NAOH（或KOH），肌酸。

附表：

培养基的配方

肉汤琼脂培养基

牛肉膏5克

蛋白胨10克

氯化钠

5克

琼脂

18克

蒸馏水

1000毫升

葡萄糖10克

pH121C灭菌20min7.0-7.2淀粉培养基牛肉膏

5克蛋白胨

10克氯化钠5克可溶性淀粉

2克琼脂

15—20克蒸馏水

（半固体培养

1000毫升121C灭菌20minV—P.实验培养基

基）葡萄糖

5克氯化钠

5克蒸馏水

1000毫升pH

6.5121C灭菌20min