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2.4.2不同pH对叶片菌菌丝生长的影响6

2.4.3不同培养基对叶片菌菌丝生长的影响6

2.4.4不同碳源对叶片菌菌丝生长的影响6

2.4.5不同氮源对叶片菌菌丝生长的影响6

2.5药剂对病原菌的室内毒力测定7

3结果分析8

3.1病原菌回接发病率8

3.2分离纯化菌株的鉴定8

3.2.1叶片病原菌单菌落形态和显微镜观察图8

3.3生物学特性的研究9

3.3.1不同温度和PH对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长的影响9

3.3.2不同培养基对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）菌丝生长的影响10

3.3.3不同碳源和氮源对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长影响11

3.3.4药剂室内毒力测定结果11

4结论与讨论13

4.1结论13

4.2讨论13

参考文献14

致谢词16

独撰声明17

作者:

QY指导教师:

FG

（2010届生物科学专业）

摘要：

本试验利用组织分离法，从自然发病的麻疯树叶片上分离并得到了1种病原菌，经形态学鉴定初步鉴定一种为曲霉属（Aspergilus），暂命名为曲霉属Ⅰ（AspergilusⅠ）。

对该菌进行生物学特性研究表明：

曲霉属（Aspergilus）的菌丝最适生长温度为30℃，最适宜生长的pH值为6，最适宜的培养基査式培养基（CzapekAgar,CA），最适碳源糊精和甘露醇，最适氮源为硝酸铵和硝酸钾。

采用含药平板法研究6种杀菌剂对该病原菌菌丝的影响，结果表明60%纯白多菌灵、代森锰锌·

霜脲氰、30%醚菌·

啶酰菌和60%唑醚·

代森联的抑菌效果最好，抑制率为100%。

80%烯酰吗啉的抑制率相对较差。

关键词：

麻疯树病原菌（pathogen）曲霉属（Aspergilus）生物学特性　室内毒力　

Jatrophayellowleafpathogenidentificationanddeterminationoffungicidesindoortoxicology

Author:

QY　Tutor:

Fg

（majorin:

biologicalscience,graduatein2010）

Abstract:

Bytissueisolation,apurecultureofthe1fungiisolatedfromthenaturalincidenceofdiseasedleavesofplum，wasidentifiedtobeasaNosophyte，namedAspergilusⅠ,basedonitsmorphologicalcharacteristics．ThebiologicalcharacteristicofAspergiluswerestudied．Theresultsshowedthat:

Theoptimumoftemperatureis30℃．WhenpH6，itisfavourableforSyncephalastrumSchrotergrowth.GrowthmediumismostsuitableforCzapekAgar.Theoptimumcarbonsourcearedextrinandmannitol,theoptimumpotassiumnitratearepotassiumnitrateandammoniumn.Thecontainingplatemethodresearchof6kindsofFungicidesonthehyphaeffect.Thereitrate.sultsshowthat60%whitecarbendazim、mancozed·

cymoxanil、Eherbacteria·

pyridineacidbacteriaandtriazoleether·

metirambacteriostaticseffectbest,theinhibitionratewas100%.Effectof80%dimethomorphwasrelativelylow.

Keywords:

JatrophacurcasL.NosophyteAspergilusBiologicalCharacteristicsIndoorvirulence

前言

麻疯树（JatrophacurcasL.）是目前全世界研究最为广泛的能源植物。

麻疯树又称小桐子，膏桐、臭桐树、黄肿树、芙蓉树、假花生等，属于大戟科（Euphorbiaceae）麻疯树属（Jatropha）植物[1],为落叶灌木或小乔木，广泛分布于热带及亚热带地区，在我国云南、四川、贵州、广西、广东、福建、台湾和海南等地有大量分布。

麻疯树是一种多用途的经济植物，除了将其种子榨取能源油外，其油渣、油饼可以作饲料肥料等；

茎、叶、树皮均含有白色乳汁，研究表明内含有大量的毒蛋白、麻疯酮等抗病毒、抗AIDS、抗肿瘤成分，可广泛应用于医学和生物防治方面另外，麻疯树还可以作为防护林树种，它对改善生态环境和恢复植被有重要作用[2-4]。

至2014年，我国发现了在人工林中常见的叶片病害有[2]:

麻疯树白粉病（Oidiumleucoconium）,其病原为白尘粉孢（Oidiumleucoconium）;

麻疯树叶斑病（Mycosphaerellaaleuritidis）,其病原为油桐叶斑球壳菌（Mycosphaerellaaleuritidis）;

麻疯树炭疽病（Colletotrichumsp.）,其病原为刺盘孢菌（Colletotrichumsp.）。

麻疯树赤枯病（Pestalotiopsisheterocornis）,其病原为异角状拟盘多毛孢（Pestalotiopsisheterocornis）。

灰霉病（Botrytiscinereapers），其病原为灰葡萄孢菌（BotrytiscinereaPers.exFr）等。

攀西地区麻疯树人工林中常见叶片染病，迅速枯萎，先变黄后变褐，最后干枯，严重时整株死亡，干枯叶悬挂于枯枝上而不脱落，与黄叶病的症状相似，严重影响了麻疯树存活[5]。

现在有文献尚未记载，为了给麻疯树的该病害研究及防治提供科学依据，笔者对西昌黄水的麻疯树黄叶病采用组织分离法[3]进行分离鉴定，并采用含药平板法[6]选用6种杀菌剂对病原菌进行了室内毒理测定，以筛选低毒、高效杀菌剂做进一步研究。

1材料

1.1试验材料

1.1.1供试材料和培养基

麻疯树（JatrophacurcasL.）采自西昌市黄水乡，由方志荣老师提供感病叶片。

分离纯化培养基：

（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PotatoDextroseAgar，PDA）：

马铃薯（去皮）200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g,纯化水1000ml。

鉴别培养基：

（1）查氏培养基（CzapekAgar,CA）：

蔗糖30g,NaNO33g,KCl0.5g,MgSO40.5g,Fe2（SO4）30.01g,KH2PO41g，琼脂粉20g,纯化水1000ml。

（2）马铃薯蔗糖培养基（PotatoSugerAgar,PSA）：

马铃薯（去皮）200g,蔗糖20g,琼脂粉20g,纯化水1000ml。

（3）牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NS）:

牛肉膏5g,蛋白胨10g，NaCl5g,琼脂粉20g，纯化水1000ml。

1.1.2试验器材

ECLIPSE80i手动型高级研究型尼康显微镜（eclipse80i,北京冠普佳科有限公司）

立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-30KBS，上海申安医疗器械厂）

微机霉菌培养箱（MJ-250B，上海悦丰仪器仪表有限公司）

酸度计（PHS-2C型，成都方舟科技开发公司）

2试验方法

2.1病原菌的分离

按照常规组织分离法[3]分离菌株，在感病黄叶片切取小块叶片组织，用75%酒精表面浸泡10秒，再用0.1%升汞消毒3分钟，然后用无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸去多余水分后将组织块在无菌操作条件下接种到PDA培养基平板上于25℃恒温培养箱内培养。

待培养基内长出菌落后，用接种针挑取菌株接种到新的PDA培养基平板上，分离4次至平板上出现单一菌体。

2.2菌株的单胞分离与纯化

取分离得到的菌株于PDA培养基上活化产孢后，用无菌水洗下孢子，于灭菌后的空试管中，加入3-4ml的无菌水，并盖上棉塞，用手振荡数次后制成孢子悬浮液。

用灭菌玻棒蘸取孢子悬浮液涂布于画好有0.3×

0.3㎝大小方格的水琼脂平板上，在无菌操作条件下，于10倍物镜下标记只有单个孢子的水琼脂小块，然后将标记好的单孢水琼脂小块反面接种于PDA培养基中，于25℃恒温培养箱中待菌落长出后，将单孢纯化的菌株保存于PDA斜面上置4℃冰箱内贮存备用[7-9]。

2.3致病性测定

2.3.1菌饼的离体叶片接种

在无菌操作的条件下，将采集的麻疯树健康叶片进行以下消毒：

先用75%乙醇浸泡叶2min，再用浓度为0.1%的升汞溶液浸泡15min，用无菌水漂洗4次，无菌纱布吸干水分。

用镊子夹取上述处理的感病黄叶片放入事先铺有湿润滤纸的灭菌培养皿中，每个培养皿放1片，重复20次。

用直径7mm的灭菌打孔器在培养7d后的PDA上沿外缘打成菌饼，分别接种于叶片中央。

置30℃恒温培养箱中培养，7d后观察发病情况并统计致病率。

2.4病原菌的生理特性测定

活化2.2分离纯化所得病原菌，划线培养7d后，用7mm的打孔器将病原菌接种到新的PDA培养基上，第3d观察菌落的形态特征（包括形状、大小、颜色、边缘形态、生长速度、质地等方面），进行初步确认。

然后，挑取病原菌在显微镜观察菌丝形态、孢子和分生孢子梗的形态，并进行拍照和记录[10]。

最后，采用《真菌鉴定手册》[11]对所分离的病原菌进行检索，确定所分离的内生真菌的种属。

2.4.1不同温度对病原菌菌丝生长的影响

共设5种温度梯度：

15℃、20℃、25℃、30℃、35℃[12,13]。

用直径7mm的灭菌打孔器在培养7d后的PDA培养基沿外缘打成菌饼，分别接种于PDA平板中央，置于上述5温度梯度的恒温培养箱中。

第3d用十字交叉法测量菌落的直径，记录数据，观察并记录菌落的形态[13]。

试验结果用方差分析法（SPSS16.0软件）和曲线图来分别表示不同温度对内生菌菌丝生长影响之间的差异显著性及直观性比较[14,15]。

2.4.2不同pH对病原菌菌丝生长的影响

共设6种pH梯度：

pH4、pH5、pH6、pH7、pH8和pH9[12]。

在无菌操作条件下，用盐酸和氢氧化钠调节pH值，PDA培养基常规灭菌，再倒入培养皿制成平板，用PH计调节培养基pH值分别为4、5、6、7、8和9。

直径7mm的灭菌打孔器在培养7d后的PDA培养基沿外缘打成菌饼，并接种于平板中央，置于30℃恒温箱中培养2d。

与2.4.1相同的方法测量菌落直径，数据分析。

2.4.3不同培养基对病原菌菌丝生长的影响

共设4种培养基：

PDA，PSA，NS，查氏培养基。

将配制好的各培养基灭菌制成平板备用。

与2.4.1相同的方法打饼培养，测量菌落直径，数据分析。

2.4.4不同碳源对病原菌菌丝生长的影响

碳源对菌丝生长的影响：

以査氏培养基为基础，用等摩尔质量的葡萄糖、甘露醇、木糖、糊精、可溶性淀粉代替蔗糖配置成不同碳源的培养基，空白不加任何碳源，灭菌后制成平板。

2.4.5不同氮源对病原菌菌丝生长的影响

以査氏培养基为基础，用等质量硝酸钾、硝酸钙、蛋白胨、尿素代替硝酸钠配置成不同碳源的培养基，空白不加任何氮源，灭菌后制成平板。

2.5药剂对病原菌的室内毒力测定

采用含药平板法[6]研究6种农药对病原菌菌丝生长的影响，通过预备试验结果确定6种药剂的浓度梯度（如表1）。

再将6种农药用移液枪分别吸取规定的量与已灭菌的PDA混合，充分摇匀倒入培养皿中，制成含药平板培养基，分别标为A、B、C、D、E、F，设置空白对照CK。

用直径7mm的灭菌打孔器在培养7d后的PDA培养基沿外缘打成菌饼，并接种于含药平板和CK中央，置于30℃恒温箱中培养7d。

每种药剂每个浓度设置3次重复。

7d后用十字交叉法测量菌落直径。

试验结果用方差分析法和曲线图来分别表示不同农药的不同浓度对内生真菌菌丝生长影响之间的的差异显著性及直观性比较[15]。

3结果分析

3.1病原菌回接发病率

把分离获得的菌回接到健康的麻疯树叶片上接种3天后开始发病，其症状：

先变黄后变褐，迅速枯萎，发黄率100%。

图1自然感病叶片图2病原菌回接发病

3.2分离纯化菌株的鉴定

3.2.1叶片病原菌单菌落形态和显微镜观察图

菌落呈圆形或内圆形，疏松，边缘可见绒毛状白色菌丝，菌丝发达，表面湿润；

菌落颜色黄绿色，培养3-4天后，菌落中间颜色加深为绿色，从背面看有两圈颜色，最外圈呈白色，中间呈黄绿色（如：

图3）。

在PDA培养基上有孢子产生，在显微镜下观察：

子囊壳球形，黄色；

子囊孢子双凸镜形。

分生孢子绿色，辐射状或集成圆柱形。

小梗单层；

分生孢子椭圆形至亚球形，表面粗糙（如：

图4），《真菌鉴定手册》初步鉴定一种为曲霉属（Aspergilus）。

图3叶片病原菌曲霉属Ⅰ（AsⅠ）单菌落形态图4叶片病原菌曲霉属Ⅰ（AsⅠ）菌孢子梗

形态（20×

）

3.3生物学特性研究

3.3.1不同温度和不同PH对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长的影响

试验结果：

曲霉属Ⅰ（AsⅠ）在15℃～35℃范围内均能生长，SPSS分析结果显示，30℃菌落直径显著大，且与其他组间差异显著（如：

图5），结果说明该病原菌的最适生长温度为30℃。

该菌在PH4-9上均能生长，在pH6最有利于该菌丝的生长，最适PH为6，PH6与PH7差异不显著，与其他组差异显著（如：

图6）。

图5不同温度对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）的影响状况图6不同PH对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）的影响状况

*注：

字母表示p在0.05水平的差异显著性，下同

3.3.2不同培养基对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）菌丝生长的影响

该病原菌菌丝在所有处理中均能生长，SPSS分析结果说明，査氏培养基上菌落的生长直径显著大（如：

图6），与其他组间差异显著，说明査氏培养基为该菌生长的最适培养基。

图7不同培养基对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长影响状况

3.3.3不同碳源和氮源对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长影响

该病原菌菌丝在不同供试碳源中均能生长，SPSS分析结果说明，供试碳源为糊精和甘露醇的菌落直径显著大（如：

图8），且与其他组间差异显著，说明最佳供试碳源为糊精和甘露醇。

供试氮源为硝酸钾和硝酸铵的菌落直径显著大（如：

图9），且与其他组间差异显著，说明为最佳供试碳源。

图8不同碳源对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长影响状况图9不同氮源对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）生长的影响状况

3.3.4药剂室内毒力测定结果

6种药剂的室内毒力测定的试验表明，60%纯白多菌灵、代森锰锌·

代森联,对该病原菌有很强的抑菌效果，在低浓度时的抑菌率均达到100﹪，80%烯酰吗啉在不同浓度时的抑菌率均低于20﹪（如：

表1）。

表1供试试剂和使用浓度

序号

药剂名称

有效成分

生产厂家

使用浓度/（µ

g/ml）

菌种直径/cm

抑制率/%

A

烯酰吗啉WG

80％烯酰吗啉

山东青岛瀚生生物科技有限公司

10

20

30

40

7.8

7.2

6.9

6.8

2.74%

10.95%

15.06%

16.44%

B

醚菌酯WG

50%醚菌酯

德国巴斯夫（中国）有限公司

50

100

150

200

5.8

5.7

5.5

5.4

30.14%

31.51%

34.25%

35.62%

C

唑醚·

代森联WG

5%吡唑醚菌酯

55%代森联

300

400

0.7

100%

D

纯白多菌灵WP

60%纯白多菌灵

山东青岛好利特生物农药有限公司

100

E

代森锰锌·

霜脲氰WG

80%代森锰锌·

霜脲氰

德国巴斯夫（中国）有限公司

F

醚菌·

啶酰菌SC

10%醚菌酯

20%啶酰菌胺

0.06ml/l

0.12ml/l

0.18ml/l

0.24ml/l

CK

无菌水

——

8.0

*注：

WG水分散粒剂SC悬浮剂WP可湿性粉剂菌饼直径0.7cm培养皿内皿直径8.0cm

4结论与讨论

4.1结论

本试验利用组织分离法[3]，从自然发病的麻疯树叶片上分离并得到了1株真菌纯培养，经形态学和生长特性等研究，《真菌鉴定手册》初步鉴定一种为曲霉属（Aspergilus），暂命名为曲霉属Ⅰ（AsⅠ）。

对曲霉属（AsⅠ）进行生物学特性研究表明：

曲霉属（AsⅠ）的菌丝最适生长温度为30℃，最适宜生长的pH值为6，最适宜的培养基査式培养基（CzapekAgar,CA），最适碳源为糊精和甘露醇，最适氮源是硝酸铵和硝酸钾。

黄叶病致病率为100%,为麻疯树黄叶病。

采用含药平板法[6]研究6种杀菌剂对该病原菌菌丝的影响，结果表明60%纯白多菌灵、代森锰锌·

4.2讨论

（1）该致病菌在培养过程中出现大量水珠，可能培养箱或培养基的湿度过大，还需要进一步研究

（2）此试验采用含药平板法[16]研究6种农药对曲霉属Ⅰ（AsⅠ）菌丝生长的影响，其中四种菌的抑制率为100%，有可能我们的预试验的浓度梯度未达到最适合的浓度梯度，现使用的浓度过高，抑菌试剂浓度的选择还需进一步研究，毒力测定只是室内PDA平板上抑菌试验结果，药剂的田间防治效果还需要通过大田小区试验证实。

（3）对于曲霉属Ⅰ（AsⅠ）致使麻疯树感病，先变黄后变褐，然后枯萎，现有文献尚未记载，曲霉属Ⅰ（AsⅠ）属于新型致病菌，与香蕉黄叶病相似，还需要做ITS进一步研究分析，在观察黄叶病的症状时，我们只观察了叶片，并未对病株茎，枝条进行细致的观察和记录，可能遗失了部分病症。

（4）由于该菌的最适生长温度为30℃，西昌属于干热气候，因此有利于该菌的蔓延。

该菌成熟时会产生孢子，随风或雨水扩散，因此建议发现病株时及时将病叶清除如烧毁，并喷施农药，60%纯白多菌灵、代森锰锌·

代森联,对黄叶病都有很好的抑制效果，但这只考虑了温度，对湿度未探究，还需要进一步研究。

参　考　文　献

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（1）：

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致谢

首先感谢我的导师QT老师，谢谢她对我的悉心指导。

在论文的选题和研究方法及思路方面，都得到了方老师的悉心指导，使我获益非浅，方老师严谨治学的态度、丰富的知识、诲人不倦的精神都给我留下了深刻的印象，是我学习的榜样。

借此机会，谨向方老师表示我真挚的谢意。

其次要感谢10级生物科学班的所有老师。

最后要感谢我的试验搭档GH，没有她的包容，帮助