浅论抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备及其保护作用的鉴定Word下载.docx
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成功制备了具有保护和阻断作用的兔抗重组rVVC多克隆抗体,为以后rVVC促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
【关键词】创伤弧菌溶细胞素;
多克隆抗体;
保护作用;
阻断作用
Abstract:
Objective:
ToprepareandpurifyrabbitpolyclonalantibodyagainstrVVC,toevaluatetheprotectionofpolyclonalantibodybyobservingthemorphologyandactivitychangesofSMMC7721cellsactedbypurifiedrVVC,purifiedpolyclonalantibody,themixtureofrVVCandpolyclonalantibody.Method:
RabbitpolyclonalantibodyagainstrVVCpreparedbyimmunningrabbitwaspurifiedbypersulfate,SephadexG25andDEAE-SephadexG100followedbyanalysisofWesternBlothybridizationandantibodytiter.AfterSMMC7721cellswereactedbypurifiedrVVC,purifiedpolyclonalantibodyandthemixtureofVVCandpolyclonalantibody,rabbitpolyclonalantibodyprotectionwereobservedundermicroscopeandwithMTTmethod.Result:
RabbitpolyclonalantibodyagainstrVVCwaspurifiedsuccessfullybymethodsofPersulfate,SephadexG25andDEAE-SephadexG100.Polyclonalantibodyshowedhighimmunoreactivity.TheresultsofMTTandmicroscopeobservatienindicatedthatpolyclonalantibodycouldblockupthedamageofSMMC7721cellsactedbyrVVC.Conclusion:
RabbitpolyclonalantibodyagainstrVVCwithfunctionsofprotectionandblockadeispreparedsuccessfully,thustoprovideasignificantblockingagentforfurtherstudyonmechanismofinflammation,stressandsignaltransductionofrVVC.
Keywords:
vibriovulnificuscytolysin;
polyclonalantibody;
protection;
blockage
创伤弧菌是一种致病性极强的嗜盐性细菌,能引起严重的伤口感染和败血症,发病急、病死率高,发展到败血症,则病死率高达55%以上,其确切致病机制至今尚未完全阐明。
创伤弧菌溶细胞素作为创伤弧菌唯一分泌至细胞外、具有创伤弧菌种属特征性的外毒素,其活性和毒性都很强,现在认为它是创伤弧菌感染最重要的毒力因子,在创伤弧菌感染过程中发挥重要致病作用[1]。
此前,我们已经成功构建了原核表达载体pET28a(+)-vvhA,并对重组蛋白rVVC表达、纯化和复性条件进行优化。
本研究中,我们利用纯化重组蛋白rVVC免疫日本大耳兔,进行多克隆抗体制备并纯化,成功制备了兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体,并对其保护、阻断作用进行了评价,为后续rVVC的促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
1材料和方法
材料
载体与细胞:
重组原核表达载体pET28a(+)-vvhA为本课题组构建,肝癌细胞SMMC7721为温州医学院细胞与分子生物学研究所保存,日本大耳兔[4个月大小、雄性、健康,体重kg]由温州医学院实验动物中心提供,兔红细胞利用心脏采血法取自健康家兔心脏。
主要试剂与试剂盒:
IPTG、3SNTARESIN树脂、盐酸胍购于上海申能博彩生物科技有限公司。
羊抗兔HRP-IgG抗体、ECL发光试剂购于上海普飞生物技术有限公司。
DMEM高糖培养液购自吉泰科技有限公司。
胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。
青霉素/链霉素抗生素液为美国Invitrogen公司产品。
pH磷酸盐缓冲液、%胰蛋白酶、2%台盼兰染液自配。
方法
重组蛋白rVVC的表达、纯化、Westernblot分析和柱上复性:
参照本课题组已经建立的方法表达、纯化重组rVVC蛋白。
重组蛋白rVVC的Westernblot分析按文献进行。
将纯化重组蛋白rVVC用PBS溶液稀释成浓度小于1mg/ml,4℃条件下,取1ml样品加到Ni-NTA亲合层析柱中,流速控制在15ml/h左右,进行蛋白质挂柱。
层析用10倍NTA体积的NTA-0Buffer洗脱,流速控制在30ml/h左右。
再分别用3倍NTA体积的、、、、、、、、、、mol/L盐酸胍洗脱,流速控制在15ml/h左右。
3倍NTA体积的NTA-1000Buffer洗脱,收集洗脱液并用PBS溶液透析24h,期间要求多次更换透析液。
取透析好的蛋白溶液于4℃、12000r/min离心取上清液,以考马斯亮蓝进行蛋白质定量分析,滤过除菌,-70℃冻干保存。
重组蛋白rVVC溶血活性检测:
将一定量复性重组rVVC蛋白加入1ml%兔红细胞悬液中,再加PBS-BA缓冲液至2ml,37℃水浴20min,显微镜观察细胞形态学变化。
2500r/min离心5min,取上清于545nm处测吸光度值,以使%兔红细胞悬液中的血细胞溶血一半时所需的蛋白质的量定义为一个溶血单位来计算其溶血活性。
兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备、提纯、Westernblot和抗体效价分析:
纯化重组rVVC蛋白与完全福氏佐剂充分混匀,皮下多点免疫日本大耳兔,2周后,再与不完全福氏佐剂混匀,皮下加强免疫,1周后,收集血清,ELISA法检测抗体效价。
免疫血清经饱和硫酸铵、50%硫酸铵、33%硫酸铵溶液盐析沉淀。
盐析纯化后的免疫血清再经SephadexG25除盐纯化、DEAE-SephadexG-100柱层析纯化。
纯化后的兔抗重组rVVC多克隆抗体参照文献进行Westernblot分析。
选取10μg/ml纯化重组rVVC蛋白包被酶标板,兔抗重组rVVC蛋白多克隆抗体和免疫前阴性对照血清均按1:
50、1:
100、1:
200、1:
400、1:
800、1:
1600、1:
3200、1:
6400、1:
12800、1:
25600、1:
51200等浓度倍比稀释,采用ELISA法于450nm处检测其效价。
SMMC7721细胞培养和活性检测:
SMMC7721细胞用DMEM高糖培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞密度达到80%~90%后,用%胰蛋白酶消化10min,加DMEM培养液终止消化,收集细胞并用DMEM培养液吹打为单细胞悬液,调整细胞浓度为1×
106/ml,加于96孔培养板,每孔100μl,置于37℃、5%CO2条件下培养12h后,再分别加入重组rVVC蛋白,使其浓度分别为、、、、、、、HU/ml,并设阴性对照和培养液对照,置37℃、5%CO2条件下培养12h后,加入10μlMTT(5mg/ml),37℃继续培养4h后,小心吸弃培养液,每孔加入100μlDMSO溶解formazon,用波长630nm检测各孔吸光度值(每一组设3个重复孔)。
MTT法检测兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的保护和阻断作用:
选择对数生长期SMMC7721细胞,用%胰酶消化10min,调整细胞浓度为1×
106/ml,加于96孔培养板,每孔100μl,于37℃、5%CO2条件下培养12h后,分别用上述不同浓度重组蛋白rVVC与1:
1000纯化多克隆抗体混合物、不同稀释度纯化多克隆抗体(1:
1、1:
10、1:
1000、1:
10000)作用SMMC7721细胞,并设置阴性对照和培养液对照。
于37℃、5%CO2条件下培养12h后,加入10μlMTT(5mg/ml),37℃继续培养4h后,小心吸弃培养液,每孔加入100μlDMSO溶解formazon。
在波长630nm处检测各孔吸光度值。
2结果
2.1重组蛋白包涵体的复性和溶血活性分析纯化重组蛋白rVVC经Ni-NTA亲合层析柱柱上复性后,其复性得率高达96%。
利用VVC蛋白的溶细胞特性,将纯化复性的重组rVVC蛋白作用于兔红细胞,并检测其溶血活性,结果发现,复性重组rVVC蛋白具有较强的溶血活性。
将测得吸光度值与溶血标准曲线比较,得出rVVC蛋白的溶血活性为μg/HU(见图1、图2)。
兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的制备、提纯和Westernblot分析兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体经盐析法、分子筛和阴离子交换层析法纯化后,得到较纯的IgG分子。
经Bandscan软件分析,多克隆抗体经过硫酸铵盐析纯化,其纯度达70%,再经SephadexG25除盐、DEAE-SephadexG100纯化后,其纯度高达到85%以上(见图3)。
免疫印迹分析证实纯化多克隆抗体具有较好的免疫反应性(见图4),其效价为1:
12800(见图5)。
SMMC7721细胞活性检测SMMC7721细胞分别被不同浓度的重组rVVC蛋白作用12h,利用MTT法检测吸光度值。
细胞活性百分率用被作用细胞和阴性对照细胞吸光度平均值的比值来表示。
利用GraphpadPrism软件进行制图。
从图6可知,肝癌细胞SMMC7721被HU/ml的活性rVVC蛋白作用12h后,细胞活性百分率仍大于50%,其IC50小于HU/ml。
兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体的保护、阻断作用检测SMMC7721细胞分别被不同浓度的重组rVVC活性蛋白、重组rVVC活性蛋白和多克隆抗体混合物作用12h后,MTT法检测SMMC7721细胞OD值,利用GraphpadPrism软件进行作图分析。
结果显示,兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体完全阻断了重组rVVC活性蛋白对SMMC7721细胞的损伤。
单独兔抗重组蛋白rVVC多克隆抗体对SMMC7721细胞无损伤作用,为保护性抗体。
3讨论
创伤弧菌溶细胞素作为创伤弧菌感染重要的毒力因子之一,在感染过程中通过多种机制发挥重要的致病作用。
经研究发现,VVC不仅具有很强的溶细胞作用,诱导内皮细胞产生大量超氧阴离子、在靶细胞膜上形成微孔,介导钙离子内流及刺激细胞形成的NOS(一氧化氮合酶)大量释放,引起细胞凋亡,而且也可以诱导肥大细胞中组胺释放,造成皮肤和肺组织的损害,但其确切致病机制至今尚未完全阐明[4-7]。
我们的研究也发现,复性重组rVVC活性蛋白能够对肝癌细胞SMMC7721造成损伤,这种损伤随重组rVVC活性蛋白浓度增加而加强。
为了进一步弄清对肝癌细胞SMMC77212造成损伤只是重组rVVC活性蛋白本身而非其他因素所致,本研究利用纯化重组rVVC蛋白为抗原,免疫日本大耳兔,成功制备了兔抗重组rVVC蛋白多克隆抗体,利用过硫酸铵盐析、SephadexG25除盐、DEAE-SephadexG100柱层析进行了纯化,得到纯度较高的多克隆抗体,该抗体经ELISA法检测其效价为1:
12800。
通过Westernblot分析证实该纯化多克隆抗体具有较好、较特异的免疫反应性。
利用纯化多克隆抗体单独作用肝癌细胞SMMC7721,发现其对肝癌细胞并没有损伤作用,将其和复性rVVC活性蛋白共同作用肝癌细胞SMMC7721,其完全阻断了复性rVVC活性蛋白对肝癌细胞SMMC7721的损伤。
这说明对肝癌细胞SMMC造成损伤的就是复性rVVC活性蛋白,同时也说明纯化兔抗重组rVVC多克隆抗体是具有保护和阻断作用的抗体。
此多克隆抗体的成功制备,为后续的rVVC的促炎症、促应激作用机制和信号传导机制研究提供一个重要的阻断剂。
【参考文献】
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- 浅论抗 重组 蛋白 rVVC 克隆 抗体 制备 及其 保护 作用 鉴定