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因此,在临床试验或治疗监测中,应用不同的测试系统对药物效率或治疗成功的评价可能会产生不一致的结果。
因此,更灵敏的测试系统将允许对这些问题的更深入的看法。
在用于检测的NAT-方法和提供HCV-RNA的定量方法之间,实时反转录(RT)-PCR(实时RT-PCR)是最常见的。
作为适用于所有方面的NAT-方法,该实时RT-PCR检测的诊断灵敏度严格依赖于应用的上游目标纯化程序的效率。
除了从高浓度血浆样品中直接分离RNA,另一种提高血源性病毒基因组检测的灵敏度的有效方法,是在血浆样品的离心分离之前进行核酸纯化。
然而,在HCV感染的情况下,这种方法的表现是有限的,因为HCV颗粒结合到(非常)低密度脂蛋白(VLDL/LDL)上,具有宽的密度分布,因此不作为有效丰富像B型肝炎或人类免疫缺陷病毒的底部馏分的方法。
另外,该方法是费时的,限制了它在常规的测试中的使用。
先前已表明,除其它(模型)的病毒,细胞培养的HCV结合了阳离子聚乙烯亚胺(PEI)后能在微米尺度与磁珠共价结合。
据推测,这种结合是基于PEI-分子与病毒和/或形成的免疫复合物的带负电荷的表面的脂质或蛋白质的相互作用。
因此,我们假设,正向包覆的纳米微粒,由于其高表面积与体积比,可能是一种有效的用于从像人血浆一样的复杂的样品中分离和浓缩丙型肝炎病毒的替代品。
超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)是由共沉淀的铁和三价铁盐合成的,并经过柠檬酸稳定保持表面上的净负电荷(见ESI†的方法细节)。
因此,CNPS被发现能作为稳定的胶体溶液存在(图S1,ESI†)。
柠檬酸化SPIONS(许可证)的傅里叶表征变换红外光谱(FTIR)表明了预期的结构完整性,同时用透射电子显微镜(TEM)分析表明,平均粒径
11纳米,表示从8纳米至14纳米(图窄幅S2和S3,ESI†)。
为了提供一个阳离子涂料,并就拟成本效益和易用性,我们决定测试高度正电荷的盐酸鱼精蛋白(鱼精蛋白)的简单的被动吸附产生的纳米颗粒。
虽然其它正电荷的蛋白质可能也能达到这个目的,但我们还是决定使用鱼精蛋白,因为其规模相对较小(3-5kDa的),它的高的等电点(10-13)及其在高浓度的医用级的可用性,能确保高批量一致性。
众所周知的,具有一个净正或负的表面电荷的纳米粒子能有效地吸附不同种类的血浆蛋白。
然而,潜在的机制,这也取决于颗粒大小,都还没有解决,而且似乎不但包括静电,还有疏水和/或亲水性相互作用。
为了监测吸附阳离子鱼精蛋白的带负电荷的纳米颗粒的效率和稳定性,我们使用了α-凝血酶(凝血酶),凝血级联的关键酶。
除了它的活性位点和定义了底物特异性酶凝的凝血酶的两个阳离子外部位点。
以前也已表明,凝血酶在生理pH中拥有净正电荷。
相应地,我们发现,在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH值7.4)中纯化的凝血酶能有效地结合到带负电荷的纳米颗粒上,在培养和纳米颗粒的磁选后进行残余凝血酶的酶活性的测定(后上清液作为测定图1A)。
图1CNPS和PaNPs的表征。
(一)在指定的终浓度中结合凝血酶(10ng/ml)和CNPS。
(B)接种于磷酸盐缓冲液(pH7.4)中具有或不具有在鱼精蛋白的存在或不存在0.1%的BSACNPS(1mg/ml)。
洗涤后,把颗粒在凝血酶的结合测定法进行了引进。
残留凝血酶活性的磁选相比于对照后的百分比显示在ý
轴。
(C)鱼精蛋白涂层的稳定性。
鱼精蛋白吸附在CNPS而检测凝血酶结合之前不同生产批次的PaNPs水洗了0-5次。
(D)CNPS和PaNPs分别在有或无血浆前孵化的凝血酶结合测定时引入。
当CNPS在pH为7的磷酸盐缓冲液与阳离子鱼精蛋白(ESI†)预孵育,凝血酶的结合强烈减少,这表明正电荷,鱼精蛋白吸附CNPS(PaNPs)已经形成,而高效的凝血酶的结合被相应地阻断(图1B)。
因此,当提高施加的CNP浓度为1mg/ml,鱼精蛋白的250至1000U/ml的终浓度(2.5至10mg/ml)被发现是最佳的(图S4,ESI†)。
但应注意的是,预孵育CNPS与牛血清白蛋白(BSA)并没有阻止凝血酶的结合CNPS(图1B)。
然而,牛血清白蛋白的存在在一定程度上提高了CNPS的鱼精蛋白基涂层(图1B),因此一般会添加它。
使用用于进一步表征PaNPs的以凝血酶为基础的读出系统,观察到,在几个洗涤步骤中鱼精蛋白涂层保持稳定(图1C)。
为了得到附加证明,对吸附了经过表面电荷修饰的鱼精蛋白的CNPS,一个短的荧光标记的结合,单链(ss)DNA分子进行了检查。
如图S5(ESI†)所示,这些分子有效地结合到准备好的PaNPs而与CNPS的结合被认为是微不足道的。
最后,我们还能够表明,长时间(30分钟),在未稀释的正常血浆中经PaNPs孵化后的鱼精蛋白涂层保持稳定(图1D)。
因此,制备PaNPs能为从血浆样品隔离的所需的HCV提供足够的稳定性。
为了评估PaNPs浓缩HCV的可行性,使用了一个经过验证的基本测试系统,包括使用HCV-实时检测和RT-PCR检测的商业结合等离子病毒RNA隔离设备。
对于提出的在血浆中浓缩和检测HCV的一般方法已示意性地示于图S6(ESI†)。
在第一组实验中,往PaNPs或CNPS(10ml15mg/ml的原液)中加入未稀释(140微升)或稀释(1至3中,用磷酸盐缓冲液,pH7)的HCV+血浆样品(含480IU/ml)中的HCV-RNA(ESI†)),并温育下振摇20分钟。
温育后,进行磁分离,除去上清液血浆。
然后,所收集的级分再悬浮于140微升0.9%NaCl溶液(在所使用的RNA分离试剂盒中导入一定体积的标准样品,ESI†)和病毒的裂解缓冲液中的溶液。
温育在室温下10分钟后,加入磁分离的纳米颗粒,应用如前所述上清液中的标准总RNA的分离和随后的实时RT-PCR的丙型肝炎病毒。
引入未稀释的血浆对照样品(140微升含480IU/ml的HCV-RNA)进行平行运行。
如图2A所示,三个稀释血浆样品中1的最终PANP浓度接近在生理pH中的浓度,在0.35mg/ml缓冲液稀释将能从样品中最有效地隔离HCV,而较低的稀释,得到较差的结果。
相比之下,应用带负电荷的CNPS在每个稀释测试中都显示了较差的结果(见图S7,ESI†为放大收集的数据的细节图)。
图2从血浆样品分离丙型肝炎病毒后,平均CT值由丙型肝炎病毒实时RT-PCR检测产生。
(一)血浆稀释对丙型肝炎病毒结合到纳米粒子的效率的影响。
(稀释缓冲液:
pH值为7)。
(二)稀释缓冲液的pH值对测定结果的影响(样品稀释:
13)。
(C)最后引入的PANP的浓度的影响(样品稀释:
13;
pH=7)。
(D)用从4倍体积的血浆PaNPs和测定其浓度作为对照组控制HCV的分离(3个稀释的样品中的1,pH为6,,0.18mg/ml的HCV最后的分离浓度)。
全矩阵样品中样品稀释所观察到的可能需要经过更有效的合作竞争吸附血浆蛋白,可经过说明分化相当的丙型肝炎病毒颗粒的结合来解释。
由于实际的原因,要避免等离子体的更高稀释度,还进一步分析优化了pH值和添加到样品里的稀释缓冲液和PaNPs的量。
根据不同的5至8中的磷酸酯类的稀释缓冲液的pH,以5和6的pH值检测和改进PaNPs的性能,而CNPS没有表现出这样的效果(图2B和图S8,ESI†)。
这些结果都是按照以前的研究结果,即酸性条件下表现出更有效的HCV结合PEI偶联磁珠。
然而,观察(但效果较差)CNPS的负面性能收取可能是背后不同一般机制的迹象裴珠和丙型肝炎病毒纳米粒子的结合。
一方面,这似乎是由于在所施加的颗粒大小的绝对差值。
另外,由于纳米粒子的多种蛋白质相互作用,纳米粒子与血浆蛋白的相互作用可能在从样品中分离HCV起关键作用。
PaNPs进一步优化测定表明,在1中,在pH=7的三个稀释的样品钟增加的PANP-浓度并没有导致更好的结果。
然而,与此相反,减少到0.18mg/ml会使样品中存在的丙型肝炎病毒更有效地结合,而较低的浓度表现出较差的结果(图2C和图S9,ESI†)。
根据收集到的结果,随后的实验中,使用pH为6的稀释缓冲液和最终浓度为0.18mg/ml的PANP实验。
再次,PaNPs和CNPS这些优化条件下直接比较(±
BSA)揭示了纳米颗粒的性能较差,而PaNPs能完全捕获HCV(图S10,ESI†)。
为了评估从更高的样品量集中的HCV中PaNPs分离RNA的能力,在560微升包含导入480,120,或30IU/ml的HCV-RNA的血浆中(4-叠起规模),测定并与对照组(140微升在相应的浓度的血浆)比较了结果。
如图2D和图S11(ESI†)所示,PaNPs从4倍血浆容量和之前的核酸分离丙型肝炎病毒浓度产生的-1.9±
0.2阈值循环(CT)平均差异。
经过PaNPs浓缩后对血浆丙型肝炎病毒有100%的回收率。
但应注意的是,在分析时发现在114IU/ml和28IU/ml的HCV-输入浓度时,得到了先前验证的HCV-实时RT-PCR的95%和50%阳性命中率。
因此,每个样品控制在30IU/ml的HCV-RNA的浓度范围内观察阳性反应(图2D),发现有
50%的机会。
为了进一步评估的PANP介导对在体积按比例放大的样品中浓缩HCV的影响,对较低浓度的血浆HCV-RNA(30,15,和7.5IU/ml)进行了测试。
如图S12(ESI†)所示,从4倍体积的血浆经过PaNPs浓缩产生了100%的命中率,而传统的方法有50%的病例出现故障。
然而,该方法的全面验证是需要确定的LOD和临床标本检测的允许。
综上所述,我们证明了PaNPs是从经过NAT下游分析的血浆样品中捕捉和浓缩丙型肝炎病毒的有用工具。
其中,该方法的主要优点是与它的易用性及其成本效益。
比如,它表明,鱼精蛋白(盐酸盐)简单的被动吸附到CNPS,得到相应的PaNPs有足够的稳定性,回避了精心制作的需要,如EDC基,偶联化学。
这方面很重要,因为新批次的PaNPs能够由常规的工作人员根据稳定的CNP解决方案新鲜制取。
在这种情况下,对所述凝血酶结合试验也证明是一个有用的和简单的工具来评估吸附和PANP稳定的效率。
另外,PaNPs用于从等离子体捕获其它病毒效率的评估似乎是可取的。
这项工作获得了德国学术Austauschdienst(DAAD)(阿卜杜拉·
亚辛GERSS奖学金)的支持。
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化学学习与研究学习感想
不知不觉就过了一个学期,老实说,虽然这门课的作业很早就布置下来了,我却是在最后的几天才完成的。
只是翻译一篇论文,听起来很简单,但真正动手了才发现并不是自己想的那么随便的。
一开始找文章时很混乱,不能超过三页,而且最好又要自己喜欢的,不然没兴趣,坚持不了。
找了好几篇都不满意,最后才找到现在这篇”吸附了鱼精蛋白的磁性纳米粒子能从人体血浆样本中高效分离和浓缩丙肝病毒”。
而选择这篇文章的理由很简单。
我喜欢医学,最初进中大原来想读的便是临床医学,可惜最后来了化学专业。
可是从小就想当个医生的我,还是很喜欢医药方面的东西,而其实我最感兴趣的是”乙肝”,可是在网站上,没有找到有关乙肝的文章,只找到了这篇有关丙肝的。
上网查了一下发现乙肝和丙肝是很像的,于是下定决心就这篇了。
可是翻译过程中我不止一次后悔,想要换一篇来翻译。
因为这属于有机方面的内容,因此里面有很多很生僻的词汇,有一些甚至是XX上也找不到的词。
而舍友告诉我,她翻译的是无机的,很简单,让我也找一篇无机的翻译。
可是最后,我还是坚持了下来,一来我觉得我对这篇文章很感兴趣,另一方面,我也想挑战一下吧,不想自己那么简单就放弃了。
最后还是坚持完成了,完成是感觉真的好开心,既是因为完成了作业,也是因为自己的坚持!
因此,以后遇到困难我也会像今天一样,努力坚持!
还有,想说一下在这门课上学到的东西。
一:
礼貌,例如不能够随便迟到,不要在课堂上讲话;
二:
自主学习,在大学里要懂得自己找资源,例如老师上课提供的那些网址还有介绍的杂志等;
三:
科研不是开玩笑,要认真严肃吧,其实老师上课时说的科研人员不应该有的品质我身上还是有不少的,例如怕吃苦,可是我会努力改进!
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