动物源性食品中托曲珠利砜残留量的测定 液相色谱串联质谱法试行Word下载.docx
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4.60.1%甲酸乙腈:
准确量取1.0mL甲酸,转移入1000mL容量瓶,用乙腈定容至刻度,混合均匀。
4.7含甲酸的10mmol/L甲酸铵水溶液:
准确称取0.63g甲酸铵,溶于水中,转移到1000mL容量瓶,加0.12mL甲酸,用水定容至刻度,混合均匀。
4.8含甲酸的10mmol/L甲酸铵甲醇溶液:
准确称取0.63g甲酸铵,溶于甲醇中,转移到1000mL容量瓶,加入0.12mL甲酸,加甲醇定容至刻度,混合均匀。
4.9托曲珠利砜(CAS69004-04-2)对照品:
纯度≥98.0%。
4.10托曲珠利砜(N-甲基-d3)同位素(CAS1346602-48-9)内标对照品:
4.111mg/mL托曲珠利砜标准储备液:
精密称取相当于10.0mg托曲珠利砜的对照品,用乙腈溶解并定容至10mL量瓶中。
在7℃或更低温度条件下保存,有效期3个月。
4.121mg/mL托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标储备液:
精密称取经折算相当于10.0mg托曲珠利砜(N-甲基-d3)的对照品,用乙腈溶解并定容至10mL量瓶中。
4.13托曲珠利砜标准工作溶液:
取1mL托曲珠利砜标准储备液,用乙腈稀释并定容至100mL量瓶中。
根据检测需要移取一定体积的标准储备液用乙腈逐级稀释成适当浓度的标准工作溶液。
4.14托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标溶液:
取1mL托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标储备液,用50%乙腈溶液稀释并定容至100mL量瓶中。
根据检测需要移取一定体积的内标储备液用50%乙腈逐级稀释成适当浓度的内标标准工作溶液。
4.150.1mg/L托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标提取液:
准确量取适量托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标溶液,用0.1%甲酸乙腈配制成浓度为0.1mg/L的内标提取液。
5仪器和设备
5.1高效液相色谱-串联质谱仪:
配电喷雾离子源。
5.2分析天平:
感量0.00001g。
5.3天平:
感量0.01g。
5.4涡旋混合器。
5.5高速冷冻离心机。
5.6组织匀浆机。
5.7摇床。
5.8超声波清洗机。
5.9微孔滤膜:
孔径0.2μm。
5.10移液器:
容量10μL、20~200μL、100~1000μL、1000~5000μL。
6试料的制备与保存
6.1试料的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎并使均质。
——取均质后的供试样品,作为供试试料。
——取均质后的空白样品,作为空白试料。
——取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准工作液,作为空白添加试料。
6.2试料的保存
-18℃以下保存。
7测定步骤
7.1样品前处理
称量试样2(±
0.01)g,置于50mL离心管中,加入20mL0.1mg/L托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标提取液,涡旋,剧烈震荡15s,超声浴5min,40r/min摇床振荡30min,于5℃、4000r/min离心15min。
取上清液经0.2μm微孔滤膜后,供液相色谱-串联质谱测定。
7.2基质匹配标准曲线的制备
在提取后的空白动物组织基质匹配液中,添加不同量的托曲珠利砜标准工作溶液,绘制托曲珠利砜的标准曲线。
牛肝脏基质匹配液中托曲珠利砜浓度为10、25、50、75、100、150μg/L,牛肾脏基质匹配液中托曲珠利砜浓度为5、10、12.5、25、50、70μg/L,牛肌肉基质匹配液中托曲珠利砜浓度为2、5、10、20、50、100μg/L,牛脂肪基质匹配液中托曲珠利砜浓度为2、5、10、15、30、50μg/L。
猪肝脏基质匹配液中托曲珠利砜浓度为10、25、50、75、100、120μg/L,猪肾脏基质匹配液中托曲珠利砜浓度为5、10、12.5、25、50、70μg/L,猪肌肉基质匹配液中托曲珠利砜浓度为3、5、10、15、20、30μg/L,猪皮肤+脂肪基质匹配液中托曲珠利砜浓度为5、7.5、10、15、30、50μg/L。
鸡肝脏基质匹配液中托曲珠利砜浓度为15、30、60、75、120、150μg/L,鸡肾脏基质匹配液中托曲珠利砜浓度为15、20、40、60、80、100μg/L,鸡肌肉基质匹配液中托曲珠利砜浓度为3、5、7.5、10、15、20、30μg/L,鸡皮肤+脂肪基质匹配液中托曲珠利砜浓度为7.5、10、15、20、40、50μg/L。
上述基质匹配液中,内标托曲珠利砜(N-甲基-d3)浓度均为100μg/L。
采用内标法计算,以测得的托曲珠利砜及内标托曲珠利砜(N-甲基-d3)的定量离子质量色谱峰面积之比为纵坐标,对应的托曲珠利砜浓度为横坐标,绘制标准曲线,求线性回归方程和相关系数。
7.3测定
7.3.1液相色谱参考条件
色谱柱:
C18(4.6×
150mm,5μm),或相当者;
流动相:
A相为含甲酸的10mmol/L甲酸铵水溶液;
B相为含甲酸的10mmol/L甲酸铵甲醇溶液;
流速:
0.5mL/min;
柱温:
60℃;
进样量:
5μL;
梯度洗脱:
梯度程序见表1;
表1梯度洗脱程序
时间(min)
流速(mL/min)
流动相A(%)
流动相B(%)
0.5
90
10
1.0
5.5
5
95
9.0
13.0
7.3.2质谱参考条件
离子源:
电喷雾离子源
扫描方式:
负离子扫描
检测方式:
多反应监测
电离电压:
4.0KV
雾化温度:
300℃
雾化气流速:
8L/min
测试药物定性、定量离子对及对应的裂解电压、碰撞能量见表2。
表2托曲珠利砜及其内标的定性、定量离子对及裂解电压、碰撞能量
化合物名称
离子对(m/z)
裂解电压(V)
碰撞能量(eV)
托曲珠利砜
456.0/399.0
120
456.0/42.2a
24
托曲珠利砜(N-甲基-d3)
459.0/42.2
20
(a定量离子对)
注:
以上参数为AgilentTechnologies6470测定托曲珠利砜的最适参数。
对于不同仪器,参数可能存在差异,测定前应将质谱参数优化到最佳。
另外,应对上述参数定期检查,如有必要,应相应调整。
7.3.3测定法
取试样溶液和相应的基质加标标准溶液,作单点或多点校准,按内标法以峰面积比计算。
对照溶液及试样溶液中托曲珠利砜和托曲珠利砜(N-甲基-d3)的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。
试样溶液中的离子相对丰度与标准溶液的离子相对丰度比符合表3的要求。
标准溶液和空白组织添加试样溶液的各特征离子的质量色谱图见附录B。
表3试样溶液中离子相对丰度的允许偏差范围
相对离子丰度
50%
20%至50%
10%至20%
≤10%
允许的相对偏差
±
20%
25%
30%
50%
7.4空白试验
取空白试料,采用完全相同的步骤进行平行操作。
8结果计算与表述
单点校准:
………………………………
(1)
或标准曲线校准:
由
求得a和b,则
………………………………
(2)
试料中托曲珠利砜残留量按式(3)计算:
………………………………(3)
式中:
C——试样溶液中托曲珠利砜的浓度,ng/mL;
Cis——试样溶液中托曲珠利砜(N-甲基-d3)的浓度,ng/mL;
Cs——标准溶液中托曲珠利砜的浓度,ng/mL;
C’is——标准溶液中托曲珠利砜(N-甲基-d3)的浓度,ng/mL;
A——试样溶液中托曲珠利砜的峰面积;
Ais——试样溶液中托曲珠利砜(N-甲基-d3)的峰面积;
As——标准溶液中托曲珠利砜的峰面积;
A’is——标准溶液中托曲珠利砜(N-甲基-d3)的峰面积;
X——试料中托曲珠利砜残留量,µ
g/kg;
V——提取物的最终体积,mL;
m——组织样品的质量,g。
计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字。
9检测方法灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度
本方法在猪、牛和鸡的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪的检测限均为20μg/kg,牛和猪的肝脏、肾脏、肌肉、脂肪定量限分别为250、125、50、75µ
g/kg,鸡肝脏、肾脏、肌肉、皮肤+脂肪定量限分别为300、200、50、100µ
g/kg。
9.2准确度
本方法托曲珠利砜在牛肌肉50µ
g/kg~200µ
g/kg、牛肝脏250µ
g/kg~1000µ
g/kg、牛肾脏125µ
g/kg~500µ
g/kg、牛脂肪75µ
g/kg~300µ
猪肌肉50µ
g/kg、猪肝脏250µ
g/kg、猪肾脏125µ
g/kg、猪皮脂75µ
g/kg、鸡肌肉50µ
g/kg、鸡肝脏300µ
g/kg~1200µ
g/kg、鸡肾脏200µ
g/kg~800µ
g/kg、鸡皮脂100µ
g/kg~400µ
g/kg的添加浓度水平上,回收率均为70%~110%。
9.3精密度
本方法的批内变异系数≤20%,批间变异系数≤20%。
附录A
(资料性附录)
托曲珠利砜及托曲珠利砜(N-甲基-d3)内标对照品信息
名称
分子式
C18H14F3N3O6S
C18D3H11F3N3O6S
分子量
457.38
460.40
纯度
≥98.0%
结构式
附录B
托曲珠利砜特征离子质量色谱图
图B.1托曲珠利砜及内标托曲珠利砜-d3标准溶液特征离子质量色谱图
(上图托曲珠利砜-d3:
50μg/L;
下图托曲珠利砜:
50μg/L)
图B.2空白牛肝脏特征离子质量色谱图
图B.3牛肝脏基质添加托曲珠利砜及内标特征离子质量色谱图
100μg/L;
10μg/L)
图B.4牛肝脏中添加托曲珠利砜及内标特征离子质量色谱图
250μg/kg)
图B.5空白猪肝脏特征离子质量色谱图
图B.6猪肝脏基质添加托曲珠利砜及内标特征离子质量色谱图
图B.7猪肝脏中添加托曲珠利砜及内标特征离子质量色谱图
图B.8空白鸡肝脏特征离子质量色谱图
图B.9鸡肝脏基质添加托曲珠利砜及内标特征离子质量色谱图
15μg/L)
图B.10鸡肝脏中添加托曲珠利砜及内标特征离子质量色谱图
300μg/kg)
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