开题报告se对发育期大鼠学习记忆胆碱能系统影响及丹参干预的实验研究大学毕设论文Word格式文档下载.docx
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一、学位论文开题报告
论文题目
SE对发育期大鼠学习记忆、胆碱能系统影响及丹参干预的实验研究
研究
方向
神经心理
题目来源
国家
部委
省
市
厂、矿
自选
有无合同
经费数
备注
题目
类型
理论
研究
应用
工程
技术
跨学科
其他
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年月日
开题报告内容
一.立题依据
癫痫是由多种原因引起的脑功能障碍综合征,是脑细胞群异常超同步化放电引起的突发性、暂时性、发作性脑功能紊乱。
世界上癫痫患者超过5‰。
癫痫的起病与年龄密切相关,儿童期是癫痫高发年龄段,我国的调查表明:
1岁以内起病患儿占小儿癫痫总数的29.0%,7岁以内起病患儿占总数的82.2%,说明小儿癫痫多发生于学龄前期,即使成年癫痫,起病年龄15岁以下者也接近50%。
学习记忆是中枢高级神经精神活动的重要功能之一,是人及动物赖以生存的最基本的神经精神活动。
影响癫痫患儿学习记忆功能的主要因素为:
癫痫基础病因、临床发作类型、癫痫发病年龄、癫痫发作频率及持续时间、癫痫控制情况及抗癫痫药本身对认知功能的影响。
大量研究证实,癫痫发作尤以癫痫持续状态(statusepilepticus,SE),不仅可引起暂时性脑功能障碍,且可致严重的器质性脑损伤,进而引起学习记忆及行为异常等严重后果。
动物实验研究认为,SE对大鼠的情感记忆有近期影响[1],SE可使大鼠学习记忆功能受损[2],但机制仍无法完全阐明。
SE致学习记忆受损己成为神经领域关注的热点问题。
SE导致脑损伤主要表现为海马CA3区、齿状回神经元线粒体体积缩小,基质浓缩,嵴模糊不清.并出现空泡、畸形,同时可见高尔基复合体轻-中度扩张等形态学改变,最终出现神经元丢失、胶质细胞浸入病变神经元周围;
以及细胞凋亡的形态学变化[3]。
近来有研究证实SE后鼠脑海马区树突的分枝和密度降低[4],齿状回可见苔鲜样纤维发芽[5]。
SE发作后脑神经元的损伤有一动态变化过程[6]。
发作后4h,SE动物即有部分神经元变性,继之出现神经元坏死的病理学特征,于发作后2-3天达高峰。
发作后7天,变性坏死减轻,主要见神经元丢失后遗留的“空穴”,胶质细胞浸入病变神经元周围和神经元脱失区,而锥体层神经元减少。
长期以来人们一直认为SE过程中伴有的缺氧缺血是选择性神经元损伤的主要原因[7]。
然而近年动物实验研究证实,选择性损伤神经元的分布与癫痫活动的传播密切相关。
Holmes等[8]证实SE发作后的神经元丢失是过度兴奋的结果。
发作导致神经元的大量去极化而致谷氨酸过度释放,进而引起一系列的生化级联反应导致神经元损伤或死亡。
同时仅有痫性放电但无惊厥行为发作的动物及患者,同样发生惊厥性脑损伤[9-10]。
这些现象均证实SE中的神经元损伤,除与脑缺氧缺血有关外,主要还与皮层细胞过度兴奋和放电有关[8]。
尚有研究者认为苔鲜纤维发芽导致“苔鲜纤维-颗粒细胞树突”兴奋性突触环路的形成[5],然而目前对苔鲜纤维发芽的机制尚不完全清楚,其也有可能是代偿性的和有利的。
未成熟脑惊厥阈值低,对惊厥刺激敏感性高。
以相当于婴儿期和成年期Wistar大鼠为对象,发现在相同致惊剂量下,在成年鼠多诱发局限性惊厥或短暂全身发作,而在幼龄鼠则引发全身痉挛性SE发作,与临床小儿时期更易出现癫痫持续状态发作等特征相同[11]。
未成熟脑的这种敏感性与多种生理因素有关,特别是与其皮层神经元功能发育不全,较弱刺激也能在大脑引起强烈兴奋与扩散,致使神经细胞容易大量异常放电,同时神经髓鞘发育也不成熟、冲动易于泛化有关[12]。
然而未成熟脑对SE致脑损伤具有更强的耐受性。
未成熟脑在相同条件下所出现的脑损伤程度远较成熟脑轻,同时未成熟脑似乎比成熟脑更能抵抗谷氨酸的兴奋毒性[13]。
经历相同时间相同类型的痫样发作,发育期脑苔鲜纤维发芽比成年脑较不突出[14]。
但幼鼠的这种抵抗力是不完全的[15]。
这种相对抵抗力被认为是与活化突触的低密度、低能量消耗和导致细胞死亡的生化级联反应相对不成熟有关[16]。
有研究[17]发现幼鼠脑内凋亡抑制基因bc1-2和具有细胞保护功能的热休克蛋白(HSP70)明显增高,而成年鼠脑内却有凋亡诱导基因P53的持续高表达,表明幼龄鼠脑内确实存在一个主动的神经元保护机制,但究竟在SE中,幼年机体通过何种分子调控手段来实现这种神经元保护作用,还有待进一步深入研究。
癫痫引发记忆障碍的具体机制目前仍不甚清楚。
与记忆相关的脑结构的损伤可能是原因之一。
然而,并非所有伴有记忆损害的癫痫患者都有脑组织的形态学改变。
而且这些结构性损害的严重程度与记忆损害之间缺乏直接联系的证据。
因此其他因素,如神经化学改变,可能在癫痫发作后记忆功能损害方面具重要作用。
乙酰胆碱(Ach)是一种研究较早的中枢神经递质,对中枢神经系统(CNS)似乎有兴奋和抑制双重作用,以兴奋为主。
神经末梢胞浆中的胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰化酶(AchT)的作用下生成Ach,并进入囊泡贮存。
AchT是Ach合成的限速酶。
在钙离子的参与下,囊泡与突触前膜相融合,释放Ach至突触间隙。
然后Ach作用于突出后膜的Ach受体,介导信息的传递,并参与多种生理功能的完成。
当和受体分开后,就迅速被突触间隙内的乙酰胆碱酯酶(AchE)降解为胆碱和乙酸。
徐格林等证实在大鼠发育期诱导癫痫发作可损害大鼠的空间认知能力,而出生前后胆碱补充可以减轻这种损害[18]。
Serram等报道PTZ点燃使自由活动的大鼠海马中乙酰胆碱含量下降至对照组的52%,并维持这水平达4周,至停止PTZ注射后30天恢复至对照组水平[19]。
丹参系唇形科鼠尾草属植物丹参(SalviamiltiorrhizaBge)的根及茎,经现代工艺提取的丹参化学成分包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱa、丹参酮Ⅱb,隐丹参酮及原儿茶醛、丹参素、丹参酸乙等。
现代药理研究证实丹参具有改善缺血再灌注损伤,调节免疫,降低血液粘稠度,改善微循环的作用,改善脑损伤造成的远期认知功能障碍,本课题旨在从组织、细胞水平探讨丹参对SE诱发的发育期幼鼠记忆损伤是否具有保护作用,以便为临床探索一种有效治疗SE致记忆损伤提供理论依据。
总之,本研究以戊四氮(PTZ)诱导发作的SE发育期大鼠模型为研究对象,探讨了SE对发育期大鼠学习、记忆等认知功能的影响;
采用Y迷宫和旷野试验对大鼠癫痫发作后情感和认知功能进行评定;
采用免疫组织化学法探讨大脑海马中ChAT、AChE水平在癫痫发作后认知功能损害过程中可能发挥的作用;
采用比色法对癫痫发作后脑内ChAT、AChE的活性进行测定,分析SE发作后认知功能损害与这两种酶活性的关系;
探讨了发育阶段SE对脑内胆碱能系统的影响及其与认知功能的相关关系;
从预防和治疗的角度出发,评估丹参对SE发作和对认知功能可能具有的良性作用,并对其神经化学机制进行了初步分析。
【参考文献】
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(1):
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二、研究方法与技术路线:
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
研究内容:
1采用国内外公认的经典建模药物PTZ建立SE模型,丹参对SE大鼠进行干预;
2观察各组大鼠的行为学,予拒俘反应性、开场实验检测大鼠情感,利用水迷宫、Y迷宫检测学习记忆能力,脑电图检测脑神经元放电;
3利用HE染色比较各组大鼠脑海马组织病理变化;
4利用免疫组织化学法检测脑海马组织各区ChAT、AChE的表达的改变,比色法检测ChAT、AchE活性;
5探讨丹参对SE发作及学习记忆的干预效果及对胆碱能系统的影响。
研究目标:
本研究拟采用PTZ建立SE大鼠模型,探讨SE对发育期大鼠情感、学习记忆、脑神经元放电的影响及其与胆碱能系统的关系,并探讨丹参改善胆碱能系统功能及治疗SE、改善情感学习的神经保护机制,从多层面探索,为临床药物治疗SE致记忆损伤提供理论依据。
拟解决的关键问题:
1.建立大鼠SE模型,利用丹参对SE模型进行干预,测定在疾病模型状态下发育期大鼠行为、情感、学习记忆的改变,以及脑电活动的改变。
2.利用病理学实验方法检测大鼠海马组织病理变化。
3.利用免疫组织化学技术结合比色法对海马组织中ChAT、AChE的表达进行定性及半定量分析。
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
技术路线与实验方案
1.实验动物选取及分组:
6周龄清洁级雄性SD大鼠,90只,随机分为生理盐水对照组(18只)和造模组(72只)
2.建立动物模型:
PTZ(Sigma公司)溶于生理盐水,形成浓度为1%(10mg/ml)的溶液,用前2小时新鲜配制,应用PTZ40mg/kg对SD大鼠腹腔注射,10min后注射20mg/kg,然后每10min注射10mg/kg,直至达到足够强度和SE持续发作。
生理盐水对照组(NG组)大鼠腹腔注射同等容量相同次数的生理盐水。
SE标准:
按Simialowski6级评定法评定惊厥发作,即:
0级,无惊厥发作;
Ⅰ级,点头,眨眼,颈动或湿狗样颤抖;
Ⅱ级,节律性点头;
Ⅲ级,头部抽搐加前肢颤抖;
Ⅳ级,第Ⅲ级加后肢站立;
Ⅴ级,惊厥致跌倒,全身强直性抽搐。
Ⅳ,Ⅴ级发作即为全身性惊厥大发作,持续30分钟及以上者为本组惊厥持续状态(全身痉挛性癫痫持续状态)模型。
模型组分亚组:
A组:
SE组(36只)。
B组:
丹参干预组(36只)。
惊厥终止发作后半小时丹参干预组腹腔注射复方丹参注射液10g/kg,每隔24h重复给等量药一次。
其余两组按同样方法给予等量生理盐水,各组动物混合饲养,每日测量体重调整注射剂量,直至不同时间(惊厥后即刻,10d,30d)随机分批进行情感学习检测后处死。
3.情感学习记忆的检测:
拒俘反应性:
以动物从未接触过的手套轻抓癫痫大鼠,观察其反应。
记分标准:
很容易抓取动物0分;
尖叫或回避1分;
尖叫并回避2分;
逃脱3分;
逃脱并尖叫4分;
咬或试图撕咬手套5分;
主动跃起攻击6分。
开场实验:
开场实验箱为75cm×
75cm×
50cm的正方形无盖的箱子,内壁漆黑,在底部有白线划分的15cm×
15cm大小的格子,共25个格,在开场箱的上方用一个100W的日光灯照明。
动物放在这个箱底的最中央的一个小方格中,用10cm×
10cm×
10cm大小的不透光的暗黑色盒子盖住大鼠,待30秒后,将盒子轻轻移开。
采用双盲法,由两位观察者,分别观察大鼠2分钟内方格穿行格数(三爪以上跨入邻格的次数)、中央格内停留时间、竖立次数(两前肢离地1cm以上)、理毛次数和粪便粒数。
每只动物每次实验结束后要用浸有酒精的布将地面擦拭干净。
Morris水迷宫:
本次Morris水迷宫实验的程序包括:
(1)定位航行实验(placenavigationtask):
用于测量大鼠对水迷宫学习和记忆的能力。
实验历时5天,每天分上、下午2个时段,共9个时段,每时段训练4次。
训练时随机选择一个象限(本实验选择SW)开始,按逆时针方向,将大鼠从各象限边缘中点位置面向池壁放入水中,观察并记录在120秒内找到平台的时间(逃避潜伏期,escapelatency)。
大鼠的运动策略分为4种:
直线式、
趋向式、边缘式和随机式,观察并记录9个时段的训练期间大鼠每次寻找站台所需的潜伏期和采用的策略。
如果大鼠在120s内未能找到平台则人为引导至平台停留10秒后移开,潜伏期记为120秒;
隐匿平台逃避潜伏期反映动物空间记忆的获得情况,即空间学习记忆能力。
(2)空间搜索实验(spatialprobetest):
用于测量大鼠学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的能力。
即在第5天的第5次训练时撤除平台,然后任选一个入水点(本实验选择SW)将大鼠面向池壁放入水中,由摄像系统及电脑路径软件自动记录大鼠120秒内:
(1)动物在目标象限(原平台所在象限targetquadrant)运动时间;
(2)在站台周边区域I(与站台距离小于水池半径1/2的区域)、II(与站台距离小于水池半径的区域)、III(与站台距离大于水池半径的区域)内停留时间的长短;
(3)穿越目标(原平台位置)次数。
Y迷宫:
用于大鼠学习记忆的研究。
由3个相同的臂组成,分别称为Ⅰ区、Ⅱ区、Ⅲ区。
通常把下臂(Ⅰ臂)定为起步区,左侧(Ⅱ臂)为安全区,右侧(Ⅲ臂)为电击区,三臂相交处为隔离区(0区)。
迷宫底铺以铜棒,可以通电刺激。
三臂顶端各装有15W的信号灯。
将小鼠放入三臂等长Y迷宫的某一支臂,大鼠受电击后以起步区直接逃到有灯光的安全区为“正确反应”,逃到有灯光安全区后停止通电;
若逃到无灯光区的另一侧臂则为“错误反应”,大鼠继续遭受电击。
再以大鼠所在臂为下一次实验起点。
开始训练时,大鼠受电击逃离起步区后可能跑向非安全区,并在电击作用下最终才跑至安全区(被动回避反应),故会出现错误反应;
多次训练后,安全区灯亮,电刺激尚未开始时,大鼠立即逃往安全区,即为形成明暗辨别条件反射(主动回避反应)。
用随机不休息法,测大鼠的明暗辨别条件反射(主动回避反应),电刺激参数为:
电压50伏,延时5秒。
明暗辨别条件反射训练学习一天,记忆一天,每只大鼠记录训练10次的逃避时间和逃避达标反应次数,每次间隔时间15s,按下式计算逃避达标反应率,以反映大鼠学习能力:
逃避达标率(%)=逃避达标反应次数/训练次数(10次)×
100%。
4.行为学观察结束后灌注取材
普通病理切片取材:
左心室插管,快速灌注生理盐水100ml后用40g/l多聚甲醛400ml灌注固定,剪开颅骨,取嗅球后5mm至小脑之间的脑组织,放入40g/l多聚甲醛后固定过夜,再移入0.3g/l的蔗糖溶液中4℃过夜。
冰冻冠状切片,挑取海马组织切片做普通HE染色和ChAT、AChE免疫组织化学染色。
染色后分别对海马门区、CA1区、CA3区的ChAT、AChE免疫反应阳性细胞进行计数。
4.统计学处理:
实验数据以平均值±
标准差(x±
s)表示,数据处理采用SPSS10.0统计软件,组间差异显著性采用ANOVA单因素方差分析,相关性采用spearman等级相关分析。
[附实验流程图]
动物分组(90只)
SE模型组(SE组,72只)
空白对照组(NS组,18只)
于不同时间(惊厥后即刻、10d、30d)分批(NS组、丹参组每次随机取12只,空白组每次随机取6只)取大鼠,惊厥后即刻取大鼠直接进行下列步骤,惊厥后10d、30d取大鼠行拒俘反应性、开场实验、Morris水迷宫、Y迷宫测试后进行下列步骤
NS组、丹参组每次随机取6只,空白组每次随机取3只,予灌注,灌注后取双侧脑组织
NS组、丹参组每次随机取6只,空白组每次随机取3只,双侧海马匀浆比色法行AchE、ChAT活性测定
行免疫组织化学染色定性和半定量分析比较各组海马组织ChAT、AChE的表达情况
HE染色,光镜下观察海马组织形态变化
2.可行性分析
1.医学院图书馆馆藏资源丰富,能完成实验资料检索
2.本研究项目组已经掌握戊四氮致癫痫动物模型的建立、学习记忆能力测试、大鼠免疫组化等实验方法。
3.本院中心实验室有实验所需设
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