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文章编号:
0439-8114(2012)24-5553-06
Diversity,MicrobialEcologyandIsolatedMethodsofPlantGrowth-PromotingRhizobacteria(PGPR)
KANGYi-jun,SHENMin,WANGHuan-li,ZHAOQing-xin
(SchoolofLifeScienceandTechnology,YanchengTeachersUniversity,Yancheng224002,Jiangsu,China)
Abstract:
Rhizosphereisconsideredthelargestecosystemallovertheworldandthusplaysthevitalroleinfunctionsofbiosphere,thecomplicatedinteractionbetweenplantandmicroorganisminrhizoshperecanaffectplantgrowthdirectlyorindirectly.Itisnecessarytounderstandindepththerelationsforraisingtheoutput-to-inputratioandscreeningformoreefficientPGPRs.Thediversity,microbialecologyandisolatedmethodsofPGPRwerereviewed,inaddition,somequestionswereaddressedfromthepaststudiesandsomeexpectationswerealsodiscussed.
Keywords:
plantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR);
microbialcommunity;
rhizosphereecosystem;
diversity;
screening
1904年,德国农学家Hiltner发现豆科植物根附近区域的土壤微生物,由于受到根系分泌有机物质对其产生的“效应”,表现出相对更高活性的现象,并首次提出“根际”(Rhizosphere)这一概念[1]。
现在我们知道,这种“效应”其实是根际微生态系统中的根际效应。
单棵植物根际范围虽小,但放眼看,根际却是地球上最大的生态系统,其能量流也极其巨大,因而,根际在生物圈功能中的作用非常显著。
曾有研究人员估算,植物20%~50%的光合产物是通过根部释放出来的[2,3]。
根际土壤中存在大量的宏观生物和微生物,如细菌、真菌、原生动物和藻类生物等,细菌是该群体中数量最多的一类微生物。
微生物和植物在根际环境中形成的复杂网络式关系会直接和间接地影响植物生长;
反过来,植物通过分泌有机物,构建起一个有选择性的环境条件,以利于对其生长有益的细菌,导致根际细菌多样性偏低[4,5]。
植物根际促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)在根际微生物群体中研究最为热门,也是对农业生产最具有应用价值的一类微生物。
由于PGPR数量众多,且在根际定殖时具有竞争力,加之其作用机制的多样性,因此能在很大程度上影响植物生长。
然而,人们在使用PGPR或相关制剂时,普遍发现大田应用效果远不及盆栽或温室条件下的效果理想,主要原因是PGPR对“陌生”环境的不适应。
根际微生物是野外环境中的主要“陌生”因素,因此,了解与某些基本生态过程,如复杂性、自然选择、种间关系(共生、寄生、共栖和竞争)、演替或扰动效应有密切关系的根际微生物群落结构和多样性,可以帮助人们更好地理解根际生态系统,并为PGPR的筛选和高效利用提供理论依据。
基于此,本文主要从根际微生物群落多样性、PGPR生态和遗传多样性以及PGPR的筛选策略等3个方面进行综述。
1根际微生物群落多样性
微生物多样性包括物种、遗传与变异以及功能多样性[6]。
在根际系统中,细菌群落的功能多样性是基于其遗传变异以及和其他原核、真核生物(如植物)的互作关系。
直至现在,根际微生物多样性与根际微生物功能之间的关系仍不十分清楚。
根际微生物多样性信息的缺乏,其原因一是其种类繁多,二是绝大多数微生物的不可培养性。
1.1根际微生物群落结构的研究方法
研究微生物群落结构,就必须了解各类群微生物群体的种类及数量。
传统技术是通过从根际土壤中提取、分离微生物,实验室条件下对其进行形态学、生化和遗传学检验。
由于细菌往往和土壤基质以及其他细胞紧密附着,因此在细菌提取中常用到分散剂,即用物理或化学方法将细胞和基质区分开,之后才能对分离细菌生物量进行测定。
微生物生物量的测定常用方法有:
显微镜下直接计数(如吖啶橙染料染色)[7]、微生物呼吸量测定(如基质诱导呼吸量,Substrateinducedrespiration,SIR)[8]、ATP含量测定[9]、最大或然法(Mostprobablenumber,MPN)计数[10],使用脂类生物标志物[11]以及氯仿土壤熏蒸法[12]等。
但是,土壤中可培养微生物比例毕竟极低。
有研究者曾估算这一比例只有不足1.0%(0.2%~0.8%)[13]。
正因为如此,基于平板培养法研究土壤微生物多样性存在重大缺陷,免培养技术顺应而生。
所涉及的技术包括磷脂脂肪酸(Phospholipidfattyacidanalysis,PLFA)分析法[14-16]、DNA/RNA杂交[17]、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)、核糖体RNA测序[18]、(G+C)含量[19]、温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)和变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、限制片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)[20,21]、DNA微阵列(DNAmicroarray)[22]技术(又称“DNA阵列”或“DNA芯片”)、克隆文库分析等方法。
过去20多年间,人们利用这些技术手段揭示了很多有关土壤微生物群落的信息[23]。
这些方法各有优缺点,正确选择合适的方法进行研究,有助于更准确地了解根际土壤微生物群落结构特征。
1.2根际微生物活性和功能多样性的研究方法及根际PGPR活性
研究根际微生物活性的经典方法,是将细菌进行培养、分离并作理化试验。
另一个方法是利用细菌在不同培养基上的生长速率来表征该菌在环境中的生理特性、养分利用特点和自适应策略[24]。
目前,人们广泛采用某一关键酶活性的测定来表征某类群微生物的多样性和代谢活性。
此外,Biolog体系也是应用较为广泛的方法之一[16,25]。
另外,通过克隆构建大片段DNA文库(如BAClibrary),有助于更准确地揭示土壤中可培养和不可培养微生物,以及土壤微生物生态系统的相关信息[22]。
未来土壤微生物群落结构的研究无疑会大量运用DNA微阵列技术[22],因为该技术可以利用其高特异性特点,将不同活性微生物区分开,并有助于解释同一菌株在不同环境土壤样本中的生态位的异同。
当然,基因转录、蛋白质组学等技术也是未来微生物学研究中不可或缺的辅助手段[22,26]。
根际微生物多样性反映了微生物群落的代谢活跃程度。
在土壤中接种PGPR,只要能存活,无论是否改变微生物群落结构,都会在一定程度上影响群落的代谢活性[15]。
因此,接种PGPR是否能在土壤中存活并竞争是一个十分关键的问题,受物理的(质地、温度和湿度等)、化学的(pH、养分的可利用性、有机质含量等)以及和根际其他微生物之间的互作关系等因素的影响。
其中,PGPR与根际土著微生物的互作关系是一个十分重要的影响因子,因为接种PGPR需要在根际形成新的生态位,并在根际定殖,且能竞争足够的养分。
总之,接种PGPR后,要能以有限的群体发挥应有的生物效应。
目前,人们可借助多种技术研究根际土壤微生物活性,比如前面介绍过的同位素(3H、14C)标记DNA的胸腺嘧啶核苷或蛋白质的亮氨酸组分,来估算群落代谢活性和生长状况[7,27]。
此外,还可以用SIR技术定量测定根际微生物活性[8]。
2PGPR生态及遗传多样性
近些年来,由于人们愈加深刻地认识到根际生态系统的重要性,加之PGPR作用机制研究的不断深入[28],越来越多的PGPR被筛选出来并加以鉴定。
从结果看,很多属都有PGPR的分布。
下面以目前PGPR相对集中的几个属来阐述其生态特征和多样性。
2.1固氮PGPR(DiazotrophicPGPR)
自生固氮菌大概是首个被发现具有促生作用的根际微生物。
自20世纪70年代,固氮螺菌属(Azospirillumsp.)的菌株就已被分离出并应用于实践[29]。
其他还有能起促生作用且能自生固氮的属种主要有固氮弓菌属(Azoarcus,Azonexus,Azospira)[30]、布克氏菌属(Burkholderiasp.)、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)、草螺菌属(Herbaspirillumsp.)、固氮菌属(Azotobactersp.)和多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)等[31]。
上述这些细菌可以从许多种类植物,包括水稻、甘蔗、玉米、高粱以及其他谷物,甚至菠萝、咖啡豆的根际分离到。
最近,固氮弓菌因其遗传和代谢多样性而逐步引起研究者的关注。
该属细菌能生长在以羧酸类或乙醇为碳源的培养基上,而且最适生长温度在37~42℃。
2.2杆菌(Bacillus)
土壤中的G+杆菌有95%属于芽孢杆菌属(Bacillussp.),其余5%属于节杆菌(Arthrobacter)和弗兰克氏菌(Frankia)[32]。
许多杆菌能在逆境下形成芽孢以增强生存能力,一些杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)还具有固氮能力[33]。
杆菌类的PGPR具备多种促生能力[14,34,35]。
2.3假单胞菌(Pseudomonas)
在植物根际土壤G-细菌中,假单胞菌是数量最多的一类,该属中的PGPR也因为促生能力广泛而被人们所熟知[14,36,37]。
假单胞菌属细菌生态多样性丰富,国内外已经从许多植物根际土壤中分离出大量该属的细菌。
假单胞菌细菌往往代谢功能多样,可以产生抗生素、嗜铁素或氰类化合物等多种代谢物[38]。
这些代谢物通过抑制其他有害微生物以及帮助植物吸收土壤养分,从而影响根际生态环境。
2.4根瘤菌(Rhizobia)
这里提及的根瘤菌是指能在非豆科植物根际进行非特异性定殖,并释放促生调控因子,如嗜铁素、氰类化合物或进行溶磷等作用,提高土壤养分的可利用性[39]。
已有报道指出,在作物和一些非豆科植物轮作后,其根际微生物数量会大幅增加[40],这对随后的作物生长十分有益[41]。
3PGPR筛选策略
由于野外植物根际土壤是PGPR高密度集中地,因此该区域成为筛选PGPR的最佳来源地。
进行筛选工作时,不同土壤类型、植物种类、季节以及植物生长期都必须考虑,以保证筛选到最多的菌株。
且一般土壤根际有2%~5%的细菌属于PGPR。
由此可见,野外植物根际是筛选PGPR的最佳来源地[4,42]。
细菌成为PGPR的先决条件是,当被接种后,能在根际土壤微生物群体中表现出相当的竞争力。
筛选PGPR的第一步工作,是获得足够多的根际土壤细菌。
通常认为根际土壤是指紧密附着在植物根表(1~3mm区域)的土壤。
试验中,通常将植物根表土壤剧烈抖掉后,仍紧密附着的土壤作为根际土壤,用于筛选工作。
当然,根据研究需要,除了根际土壤细菌,也可筛选根际内生细菌,因为这部分细菌也有不少是PGPR。
也有一些研究者将植物根用自来水轻柔冲洗,仍附着的土壤被看作根际土壤而进行PGPR筛选。
根际土壤充分悬浮于无菌水、磷酸缓冲液或生理盐水。
一些化合物如焦磷酸盐可作为土壤分散剂,但也可以影响细胞膜的通透性[43]。
一些化学分散剂,如螯合剂可以用单价的阳离子(Na+)交换土壤颗粒的多价阳离子(Ca2+),从而减弱土壤颗粒对细菌细胞的离子吸附作用。
不少研究者用亚氨基二乙酸制成的离子交换树脂,如DowexA1[44]或Chelex-100[45,46]。
其他的一些分散剂有Tris缓冲液或六偏磷酸钠[47]。
由于微生物细胞被其胞外聚合物紧密附着于土壤颗粒,有时也会使用去污剂。
Macdonald[44]曾用0.1%的脱氧胆酸钠作为去污剂,同时用DowexA1作分散剂处理,土壤微生物的浸出率可提高84%。
后来,Herron等[45]将此方法作了改进,用Chelex-100替代DowexA1,同时用聚乙二醇6000(PEG6000)溶解并分散土壤微生物。
还有人在用吖啶橙染色计数土壤细菌数量时,用0.2%的六偏磷酸钠作为溶剂[10]。
此外,柠檬酸盐缓冲剂作土壤溶剂研究微生物细胞膜磷脂特性[48],Winogradsky溶液用于分子生物学手段(ARDRA、DGGE或REP-PCR等)研究微生物多样性。
化学浸出法一般要结合物理法,可分为3类:
摇荡法、混合法(均质或研磨)和超声波法。
摇荡法是这3种方法中效率最低但却适用于一些敏感型的细菌或噬菌体。
均质化处理会破坏一些细胞结构,特别是G-细菌,导致浸出液具有选择性。
轻微均质化处理结合化学分散剂的使用往往具有更高的效率[49]。
超声波处理是这3种方法中效率最高的方法,但对一些黏性土壤,需要对样品进行预处理[50]。
然而,很多如G-的敏感型细菌会在处理过程中遭到不同程度的破坏,当然,选择较小频率的超声波处理可以避免这一情况的发生。
当获得足够多的根际细菌后,有如下两个策略可以筛选到所需的PGPR:
①根据前文介绍的PGPR一般比较集中的几个属,通过选择性培养基和培养方法筛选目标PGPR。
例如,Founoune等[51]用选择性培养基将荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)从刺槐根际筛选出来;
②将所得到的根际细菌进行体外促生能力测定,保留具有促生潜力的菌株。
然后对所得菌株进行遗传学试验,剔除同一属里相似的一些菌株,尽可能获得多个属里不同功能的有益菌[42,52,53]。
上述的体外促生能力试验包括:
①测定促进植物生长的一些激素(如茁长素、赤霉素、细胞分裂素和生长素等);
②1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶,1-Aminocyclopropanecarboxylicacid)活性检测,该酶能降解乙烯前体ACC,从而降低植株体内乙烯的水平,促进根系发育[54];
③溶磷能力测试,细菌的溶磷能力有助于植物吸收磷素[55];
④产嗜铁素能力测定,能帮助植物吸收铁质[56];
⑤固氮能力测定[31];
⑥测定细菌产生某些能降解病原真菌细胞壁的酶(如几丁质酶或β-1,3-葡聚糖酶)[52]。
通过体外促生能力筛选PGPR是一条可行途径,但也存在一定局限性。
一些菌株的生化途径是诱导型的,也就是说,一些功能在某一环境条件下是表达的,但换个环境或改变某个培养条件就不表达了。
因此,试验中往往会出现一些PGPR菌株在实验室条件下是有效的,但在根际条件下却失去这种作用。
比如,一些与土壤磷素或铁质等养分相关的PGPR,往往在土壤磷素或铁质含量丰富的情况下作用不明显。
还有一个问题值得关注,一些具有抗病能力的细菌在传代过程中,由于该菌产生的特异性转化酶(Site-specificinvertase)容易使其发生“相位变异”(Phasevariation),当发生这种情况后,细菌的某些表型会发生重大变化。
这也是一些细菌在实验室条件下表现出PGPR特性,但一段时间后,促生能力却消失的原因之一[57]。
筛选工作之后,对体外试验获得成功的PGPR菌株还应该在实际植物生长过程中起到相同的作用。
值得注意的是,PGPR往往对不同的植物所起作用不同[58],但具体原因至今仍不清楚,此外PGPR在根际的竞争机制也不十分明了。
接种PGPR可能会改变根际微生物群落,这有可能对植物间接促生[59]。
当然,接种PGPR也不一定会改变根际微生物群落,也有可能只建立自身的群落,但并不改变根际微生物群落[59]。
最近的一些关于PGPR筛选的报道,都遵循上述策略。
Kumar等[60]从生长在贫瘠土壤的番茄根际分离出细菌,再通过解磷、产IAA、产HCN、产嗜铁素、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性测定,确定多株细菌具有促生潜力,并在随后的芝麻种植中进一步试验,确立1株细菌(PseudomonasaeruginosaLES4)具有明显促生能力;
Jha等[61]采集低氮土壤的水稻根际土壤,用不同碳源和不同pH的无氮介质进行富集培养,从中筛选出多株固氮细菌;
Ahmad等[62]则采用3种选择性培养基(Jensen’smedium,King’sBmedium,Nutrientagar)分别将不同植物根际土壤的固氮菌、假单胞菌和芽孢杆菌分离出来,再通过上述常用的促生指标逐一进行鉴定,从而分离出目标PGPR。
4展望
研究者对微生物生态学的研究逐渐趋热,反映了微生物在生态系统中的重要性。
土壤微生物是生物圈中物质能量循环的重要组成成分,在植物根际,这一功能尤为显著。
植物通过根际分泌有机物质,高选择性地选择适合其健康生长的细菌,导致根际细菌多样性减少,但却为筛选植物根际促生菌提供了可靠来源。
接种PGPR可能会对根际微生物群落产生影响,由于这种影响关系到PGPR的作用效果,因而需要对此详加研究。
另外值得关注的是,由于关系到PGPR和植物的互作关系,PGPR和其他微生物的“对话机制”(如群体感应等)值得进一步研究。
今后需要进一步加强根际微生物生态学研究,这有助于获得一些不同功能的微生物,并帮助人们解决不同的环境问题。
未来PGPR生态学研究会越来越多地应用一些先进技术,如DNA/RNA微阵列技术,更好地揭示PGPR结构及功能多样性。
此外,为提高PGPR的应用效果,细菌群体感应等机制还有待进一步研究。
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