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在卵子激动时(精子或人工刺激下),皮层颗粒首先于接触(或刺激)之点发生破裂,然后波及整个卵子的皮层。
颗粒内含物(粘多糖)被排出,一部分与卵外的卵黄膜一起形成受精膜;
另一部分留在卵子和受精膜之间的卵周隙中,吸收水分,结果使受精膜逐渐与卵子分开而举起(这是卵子受精一个重要指标)—皮层反应。
皮层反应的作用:
a组成受精膜,防止后到的精子进入(正常的多精受精的卵除外)卵子。
b皮层颗粒排出的粘多糖会形成有粘性的透明膜物质,与卵表面紧密相连,作用是保持随后的分裂球聚集在一起。
5.早期胚胎发育经历了哪些阶段?
受精卵→卵裂→桑椹胚→囊胚→原肠胚→组织、器官、系统的分化与形成
a卵裂:
受精卵经过多次重复分裂,形成由很多细胞组成的分裂球的过程。
卵裂的特点:
卵裂与普通细胞分裂不同,卵裂细胞不生长而是连续分裂。
在合子卵裂期,细胞间期相当短,生长期几乎没有。
经过卵裂,细胞质、核体积之比逐渐减小,接近于正常的体细胞。
b囊胚:
在完全卵裂的胚胎中,经数次卵裂后形成实心细胞团。
此时胚胎的外形类似桑椹被称为桑椹胚。
桑椹胚随着卵裂出现充满液体的腔—囊胚腔.囊胚腔的体积逐渐增加,围绕囊胚腔的细胞组成上皮层—囊胚层此期的胚胎称为囊胚。
c原肠胚:
囊胚继续发育、分化,形成双胚层或三胚层的原肠胚。
囊胚的一部分细胞通过不同方式迁移到囊胚内部,形成原肠。
留在外面的称为外胚层,迁移到里面的称内胚层、中胚层,这种细胞迁移过程,称为原肠形成或原肠作用。
在这个时期,细胞继续分裂但略慢,略有生长,代谢旺盛,新的蛋白质开始合成,分化成不同形态和不同机能的细胞,形成各胚层和器官原基。
d组织、器官、系统的分化与形成:
细胞分化:
同一来源的细胞,通过细胞分裂在细胞间产生形态结构、生化特征和生理功能有稳定性差异的过程。
细胞分化是发育生物学的中心问题.
时间上的分化:
一个细胞在不同的发育阶段有不同的形态结构、生化特征和生理功能,如骨髓内血细胞的发生过程
空间上的分化:
同一种细胞的子代细胞所处的环境位置不同,其形态结构、生化特征和生理功能也不一样,如外胚层来源的细胞可发育成表皮细胞、神经细胞等。
6.受精作用及其生物学意义。
受精:
雌雄生殖细胞经过增殖、生长和成熟的发生过程以后,从各自的性腺中排出,成熟的精、卵相遇,融合而成为合子,这个过程称为受精。
受精的生物学意义:
a受精是使配子的单倍体恢复成为合子的双倍体,其中包括父本特征的遗传和遗传重组。
受精后,合子产生一系列的按一定时、空秩序,有条不紊地进行发育,最终形成一个新的个体。
b受精过程不仅完成了种属的延续,与遗传密切相联;
同时在个体发生的整个过程中产生的变异,通过生殖细胞将此变异遗传下去,而导致与生物的进化密切相关。
7.胚胎移植的目的是什么?
胚胎工程又称胚胎技术,是以胚胎移植为基础,以转基因动物为中心,通过人工操作胚胎,定向改变动物性状使之为人类造福的一系列生物技术的总称。
包括胚胎移植、体外生产胚胎、性别鉴定、转基因技术。
胚胎移植的目的:
a发挥优良母畜的繁殖潜力b促进家畜改良速度
c作为胚胎操作的基础d长期保存冷冻胚胎,便于运输和保存遗传资源
8.请说明哺乳动物正常排卵过程中激素的调节作用。
答:
对卵巢产生作用并能引起卵的成熟和排出的激素有:
孕酮、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促性腺激素释放激素(LH-RH)、雌二醇(E2)。
9.说明超数排卵的设计思路。
影响超数排卵的因素有哪些?
思路:
应用刺激卵泡的化合物以增高内源性FSH的水平,促进较多的卵泡发育。
几天后,再结合使用LH或相似的激素刺激卵泡的最后成熟与排卵。
FSH在动物体内的半衰期比较短,必须每日注射1~2次,连续应用5天。
改用半衰期较长的PMSG后,注射一次即可。
影响超数排卵效果的因素:
供体母牛的年龄;
供体品种的差异;
激素处理的剂量;
卵巢的状况。
影响超数排卵的因素还有营养、季节、地域、药物质量等。
因此,在某一养殖场进行胚胎移植工作时,不论是哪一种家畜,都应尽可能地参考相关文献,并进行分组实验,取得较好的效果后,再进行推广的工作,这一个环节是十分必要的。
IFSH+其它激素:
结果:
共注射32头牛,平均排卵21枚(范围4~55),回收用于胚胎移植的卵为53%。
采集胚胎7644枚,平均每头12.85枚,可用胚胎达65.7%,头均8.4枚。
FSH总量一定时,采用连续四天肌肉注射,每日2次,逐日递减的方法最为合理,总量以经产牛45~59mg、未经产牛20~28mg为宜,第三天注射PG,发情后12~14小时受精2次,一般可获得可靠、稳定的结果。
IIPMSG+其它激素:
PGSM与PG结合使用使牛的超数排卵方法有了很大改进,在性周期的第8~12天注射PMSG,2天后再注射PG促使黄体溶解。
一般在PG注射48小时后,母牛就排卵。
平均每头获卵10.4头。
共处理30头牛,头均获卵4.92枚,可用胚胎为62%。
PGSM与PG结合使用使牛的超数排卵方法有了很大改进,在性周期的第8~12天注射PMSG,2天后再注射PG促使黄体溶解。
优点:
对供体刺激小,费用低,使用方便。
缺点:
PMSG半衰期较长(118~123小时),常使一些未排的大卵泡残留卵巢而分泌雌激素,从而影响回收胚胎的质量,延长了卵巢恢复时间和重复超排间隙。
通常PMSG的剂量在1500~3000IU时,效果比较稳定。
10.为什么在胚胎移植前要对胚胎进行必要的检查?
第一,受精卵本身质量问题,受精前卵或精子的质量存在遗传缺陷。
第二,用药物促使多个卵泡的成熟和同时排卵,可能使某些卵并未发育到完全成熟的程度即被排出,这种卵或者不能受精,或者停止于早期发育阶段。
第三,在采集时胚胎可能受到损伤。
胚胎的检查:
条件:
无菌、37度,实体镜下观察。
正常胚胎:
外观饱满、透明带完整,卵间隙小、卵裂球大小均匀、界限清晰、细胞质均匀,无明显颗粒状物质。
不正常胚胎:
外观不圆满、透明带变形,卵间隙大、卵裂球不清,细胞质浑浊、有破碎的块状物。
11.试管动物技术包括哪些主要环节?
试管动物技术包括:
a精子的采集与体外获能处理:
无论是体内还是体外受精,精子和卵子都必须是成熟的。
所谓成熟,就是指在精、卵相遇时能完成受精和进行正常的胚胎发育。
可使精子体外获能的体液:
卵泡液、输卵管分泌物、血清、房水等。
可使精子体外获能的培养条件:
pH、Ca2+等。
目前认为:
Na+有助于去除去能因子;
Ca2+可诱发顶体反应;
氨基葡聚糖可促使顶体酶原转变为顶体酶并诱发顶体反应;
肝素可激活顶体酶并调节一磷酸腺苷活性
b卵子的回收及成熟培养:
I卵细胞的采集方法:
A回收体内成熟的卵B从屠宰的家畜卵巢中采集
C用腹腔镜取卵D超声波监视穿刺法取卵
B、C、D法从卵巢中采集的卵母细胞都是未成熟的,不能直接用于受精。
因此,首先要解决的问题是未成熟卵母细胞的体外成熟培养。
II卵母细胞的体外成熟培养:
从卵巢中采集到的卵母细胞,外面有多层卵丘细胞包围,故称为卵丘-卵母细胞复合体(COC)。
采集到的COC大约只有1/3可以使用。
细胞体外发育率最低,而来自6~8mm卵泡中的卵母细胞体外发育率最高。
III卵母细胞体外成熟的方法:
不论哪种动物,COC的初期质量是决定卵母细胞成熟能力和以后受精能力的重要因素。
因此,应从足够大的卵泡中收集COC,在形态上应为卵质均匀、透明带不变形、有多层致密而完整的卵丘细胞包裹。
卵母细胞培养液:
BMOC-3、PBI、Ham`s-F10、Ham`s-F12、TCM-199、Tyrod`s液等。
培养液主要成分包括:
氨基酸、水溶性纤维素、无机离子、大分子营养物质、激素、能量物质。
血清是主要的大分子物质的来源,所以一般培养液中加入血清是必不可少的,可用同种也可以用异种血清。
血清中提供了各种生长因子和细胞因子、激素和其它的未知成分。
c体外受精:
成熟的卵母细胞和获能的精子需要在一个合适的体外环境下共同培养一段时间,才能完成受精。
目前受精成功的标志至少是看受精卵是否可以发育至囊胚阶段。
提供受精条件的基础培养液通常有:
TCN-199、TALP、BO、BMOC-3等。
加入:
牛血清(FCS)(载体蛋白)、葡萄糖或丙酮酸(能量),也有加入氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱、维生素以及血清或血清白蛋白组成复合培养液。
提高体外受精的辅助技术:
透明带技术;
透明带下受精技术;
卵内注射精子技术
d受精卵的体外发育
e试管胚胎的移植:
通常移植的最适宜时期是发育到8-细胞以上的胚胎,可直接移植到子宫角前端。
用非手术法移植时期用晚期桑椹胚或早期囊胚的较多。
试管动物的产生过程:
12.发育阻滞的原因及克服阻滞现象的方法?
发育阻滞的原因:
发育阻滞可能是因为胚胎基因激活时引起细胞内过氧化氢以及其它自由基水平升高,造成有丝分裂不能正常进行。
在体外培养条件下,如果培养环境中不能消除累计的活性氧,则可能通过对类脂物和蛋白质的过度氧化反应而危害细胞,导致发育阻断。
克服阻滞现象的方法:
a改进培养液成分和改善培养条件b利用体细胞或体细胞条件液共同培养,以提供发育所需的物质条件。
13.什么是组织培养,它有哪些突出的优点和局限?
细胞培养是指离体细胞在无菌条件下分裂、生长,在整个培养过程中不出现分化,不再形成组织。
组织培养的突出优点:
便于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律;
便于应用各种不同的技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化;
可长期研究和观察细胞遗传行为的改变;
可同时提供大量生物形状相同的细胞作为研究对象。
组织培养的局限性:
组织和细胞离体以后,独立生存在培养环境中,其细胞生物学性质必然会发生某些改变。
因此在利用培养细胞做研究对象时,应力戒与体内细胞等同起来,或作出轻率的判断。
14.无菌操作室的设计原则有哪些?
无菌操作室在设计时应注意:
a防止室内温度过高b天花板高度不要超过2米c室内要防止空气流动
d内墙壁要光滑无死角e空气恒温恒湿调节器
15.绘出细胞培养室设计图并标注名称。
16.细胞培养室有哪些常用的仪器设备?
(一)实验室:
满足离体细胞生存所必须的条件和不受外界微生物污染的环境。
通常包括准备室、无菌室、研究室三个主要部分。
(二)常备装置
无菌条件:
净化工作室,风淋室,传递窗,高效过滤器,洁净层流罩,生物安全柜,超净工作台,紫外灯,电热干燥箱,滤器,高压灭菌器,抗生素
细胞生长条件:
纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,培养瓶,CO2培养箱(CO2培养箱设定的条件为37℃,100%湿度,5%CO2。
使用CO2培养),培养基,血清
细胞检测条件:
倒置显微镜,酶标仪,微孔板震荡器,高速离心机,移液器
细胞保存条件:
液氮罐
箱培养细胞时应注意的问题:
①用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。
定期消毒(90℃,14h)。
③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水,以保持箱内湿度,避免培养液蒸发。
17.动物细胞培养时为何要通入5%二氧化碳?
稳定住细胞生存环境中的CO2含量,即可维持培养基的氢离子浓度。
用密闭瓶口的培养方法,培养基的pH值随CO2的增加会不断降低。
自动控制的CO2恒温箱向箱内稳定地供5%的CO2,细胞可培养在开放的瓶皿中,培养环境能保持恒定的氢离子浓度,有利于细胞的生长。
18.细胞融合概念。
细胞融合的方法有哪些?
说出每种方法的优缺点。
细胞融合:
又称为细胞杂交,指真核生物体细胞在体外培养条件下,用人工的方法,使两个或两个以上的细胞融合成一个双核或多核细胞的过程。
同核融合细胞—相同细胞形成的融合细胞;
异核融合细胞—不同细胞形成的融合细胞。
细胞融合技术的原理
(1)制备具有遗传标记的细胞;
(2)用促融合剂或电场诱导细胞融合;
(3)杂种细胞的选择性培养;
(4)杂种细胞的鉴定。
在诱导物质的作用下,两个相互接触的体外培养细胞在细胞膜上发生一系列变化,首先使两个细胞的细胞质发生融合,经过有丝分裂过程两个细胞核合二为一。
目前常用的细胞融合方法有:
①病毒诱导细胞融合:
可用于诱导融合的病毒有:
仙台病毒、疱疹、麻疹、流感等十余种病毒。
优点:
①对人和细胞毒性小。
②容易灭活。
③融合效率比较高。
④许多培养细胞对其敏感。
缺点:
①需经过病毒培养制备的繁琐过程。
②批间差异大,重复性差。
③难以标准化和大规模使用。
②化学诱导细胞融合:
可用于细胞融合的化学融合剂主要有:
①高级脂肪酸衍生物。
②磷脂集合体。
③Ga离子络合物。
④特殊结构的水溶性高分子化合物(聚乙二醇PEG)
•PEG可与细胞膜糖蛋白羟基之间构成氢键和疏水性作用力,以引起膜蛋白质凝集和膜脂质流动性改变。
•PEG具有高度亲水性,可与水分子之间形成氢键,溶液中自由水消失,导致细胞脱水而发生膜结构的变化以促进膜融合。
①操作简便②条件容易控制③易于推广。
①对细胞毒性较大②融合效率低
③电场诱导细胞融合:
该技术主要有两部分组成:
①利用低强度非均匀交流电场,使两个或两个以上的细胞紧密排列,形成稳定的膜连续。
根据细胞大小,电场强度一般设定在10―100v/cm。
②瞬时施加高强度电脉冲,引起接触区域膜结构可逆性电击穿,随之发生接触膜的互融。
膜可逆性电击穿所需电场强度高达0.5―10kv/cm,脉冲时间根据细胞种类不同在3―50s。
*膜可逆性电击穿不同于膜的力学破裂,其效果是可逆的。
当撤去电场后,膜迅速恢复到原来的高电阻率和低渗透性状态。
①空间定向,时间同步。
②融合效率高,操作简便迅速。
③对细胞无毒性。
①击穿电压、时间因细胞大小、种类而异。
②脉冲缓冲液和恢复条件难于掌握。
③融合后,细胞存活率低。
19.杂种细胞筛选的原理及筛选过程。
杂种细胞的选择就是将真正发生异核融合的细胞筛选出来的过程
常用的选择方法有:
aHAT(次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷)系统bAA(亚硝基羟基丙氨酸―腺嘌呤)系统c细胞行为特征的选择
HAT系统:
根据核酸代谢过程中嘌呤和嘧啶的生物合成途径,设计的选择杂种细胞的培养液系统。
H—次黄嘌呤、A—氨基蝶呤、T—胸腺嘧啶
正常核酸合成途径:
核酸合成的补救途径:
次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT):
具有将次黄嘌呤转化为嘌呤核苷酸的功能。
胸腺嘧啶核苷酸激酶(TK):
具有将胸腺嘧啶核苷转化为嘧啶核苷酸的功能。
原理:
在核酸代谢过程中,氨基蝶呤(A)会阻断嘌呤和嘧啶的主要生物合成途径。
但当存在HGPRT时,细胞可以利用外源的次黄嘌呤(H)合成嘌呤核苷酸。
当存在TK时,可以利用外源的胸腺嘧啶(T)合成嘧啶核苷酸,这条“补救途径”能够保证具有HGPRT和TK酶的细胞在培养基中同时存在A、H和T时的细胞生长。
20.归纳总结单克隆抗体的原理。
要制备单克隆抗体需先获得能合成专一性抗体的单克隆B淋巴细胞,但这种B淋巴细胞不能在体外生长。
而实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖,应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一,得到杂种的骨髓瘤细胞。
这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性,它既具有B淋巴细胞合成专一抗体的特性,也有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性,用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群,可制备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。
单克隆抗体的应用:
①用于医学诊断②用于治疗疾病③制备各种生物活性物质④是重要的基础研究工具
21.杂交瘤技术流程说明。
22.染色体工程。
染色体工程是人们按照一定的设计,有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术。
广义上讲,它还包括染色体内部的部分遗传操作。
多倍体的意义:
a控制过度繁殖,增加生长速度以及延长寿命。
b部分多倍体在肉质及抗性方面优于二倍体。
c部分多倍体的耐受性超过二倍体。
染色体工程的应用意义:
a建立近交系b性别控制,繁育单性种群c提高生长率和出肉率d提高成活率和抗逆性
23.人工诱导多倍体有哪些方法?
通过哪些方法可以鉴别一个生物个体的倍性?
多倍体的意义?
多倍体是由于细胞内染色体加倍而形成的,既通过抑制受精卵第二极体的排出产生三倍体或抑制第一卵裂产生四倍体。
(一)目前广泛应用的诱导方法有:
生物学、物理学和化学方法。
(1)生物学方法:
主要是通过杂交尤其是通过种间杂交的方法获得种间杂交导致受精卵发育过程中第二极体不排出,产生多倍体。
(2)物理学方法
(3)化学方法:
利用化学物质来阻止第二极体的排出或第一次卵裂产生多倍体的方法。
(二)多倍体倍性的鉴别方法:
(1)核体积测量:
组成多倍体有机体的细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。
但多倍体的器官或身体并不一定都比二倍体大。
在鱼类,通常用测量红血球的方法来鉴定多倍体的倍性,其中核体积之比最为常用。
除红血球外,脑细胞、上皮细胞、肝细胞、及肾细胞的核体积之比都可用于鉴定染色体的倍性。
(2)生化分析:
丙酮酸激酶活性:
2n:
3n=1:
1.68磷酸果糖激酶:
3n=1:
1.35
(3)染色体计数:
利用胚胎或淋巴细胞制备的染色体标本,直接计数染色体数目。
(4)DNA含量测定:
流式细胞仪准确测定细胞核DNA含量。
多倍体的意义:
①控制过度繁殖,增加生长速度以及延长寿命。
②部分多倍体在肉质及抗性方面优于二倍体。
③部分多倍体的耐受性超过二倍体。
24.雌核发育及雄核发育。
人工诱导雌核发育要解决哪些关键问题?
雌核发育:
是指用经过紫外线、X或γ射线等处理后的失活精子来“受精”,再在适当时间施以冷、热、高压等物理处理,以抑制第二极体的排出,使受精卵发育成为正常的二倍体动物。
技术关键:
只有在适当的辐射剂量下,才能导致精子染色体完全失活,届时精子具有进入卵子的能力,却只能起到激活卵球启动发育的作用。
雄核发育:
是指卵子经过射线处理,使其遗传物质失活,与正常精子受精,再施以温度或高压处理,抑制第一次卵裂,使精子的染色体加倍为二倍体而发育成完全表现父本遗传性状的纯合个体。
25.通过哪些方法可以实现人类对动物性别的控制?
性别控制:
指通过人为地干预或操作,使动物按人们的愿望繁殖出所需性别的后代的技术。
性别控制的意义:
a提高畜牧业的经济效益b防止性连锁疾病的发生
c加快珍稀动物的繁殖、保种过程d提供遗传基础理论研究的途径
性别控制的方法:
(1)分离异性型精子:
按照性染色体决定性别的理论,在XX-XY性别决定的动物中,雌雄性别取决于入卵时精子所带的性染色体是X染色体还是Y染色体。
A电泳法B液柱分离法C免疫法D沉降法
(2)分离异型卵子:
在ZW-ZZ性别决定的动物中,雌雄性别取决于卵子所带的性染色体是Z染色体还是W染色体。
A性别自动鉴别品系B伴性平衡致死系C体色限性遗传品系
(3)性反转法:
外源激素作用:
激素处理的性反转鱼不能遗传,因此每代都要用激素处理。
(4)雌核发育和性反转
(5)早期胚胎性别鉴定
A细胞遗传学分析方法:
通过核型分析对胚胎进行性别鉴定。
准确率高,费时,费力,对胚胎浪费大。
B生化分析法:
通过测定与X染色体相关联的酶的活性来鉴定雌性胚胎的方法。
准确率高,时间难以掌握。
C免疫学方法:
利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体检测胚胎上是否存在雄性特异性H-Y抗原,进行胚胎性别鉴定的方法。
DDNA探针检测法:
利用Y染色体上的特异探针,通过与胚胎细胞DNA的杂交,检测雄性胚胎的方法。
(6)控制早期胚胎发育的条件:
部分鱼类、两栖类、爬行类动物的性别受其胚胎早期发育条件的影响较大,可通过控制发育条件来实现性别控制。
(7)控制受精条件:
pH升高Y型精子快,X型精子慢——雄性
(8)种间杂交法:
尼罗罗非鱼性别决定为XY型——♀(XX),♂(XY)
奥利亚罗非鱼性别决定为ZW型——♀(ZW),♂(ZZ)
26.血清的使用。
(1)血清质量好坏是实验成败的关键。
常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等,其中以胎牛血清质量最好。
(2)优质血清的标准:
透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染。
(3)血清的灭活(消除补体活性):
56℃,30分钟。
血清的消毒:
过滤除菌。
27.现对哺乳动物的克隆方法分为几种方法?
克隆羊成功的根本原因,在于他们解决了哪些重大技术问题?
克隆羊成功的生物学意义。
对哺乳动物的克隆方法:
(1)胚胎细胞的克隆:
1980年,Willadsen将从绵羊八细胞胚胎中分离的胚胎细胞,移入已去核的同种绵羊的卵细胞中,经培养获得胚胎,再将胚胎植入代理母羊体内,首次获得了胚胎细胞克隆羊。
(2)已分化的体细胞克隆:
1997年Wilmut等用高度分化的乳腺上皮细胞克隆出“多利”绵羊。
克隆羊产生的过程:
克隆羊解决了供体细胞与受体细胞同步化问题。
克隆动物经历了同种胚
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