利用乳酸菌制备纳米氧化锌复合物的工艺研究文档格式.docx
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2.4.2制备纳米氧化锌6
2.4.3纳米氧化锌的制备工艺6
2.4.4反应液中菌体活性测定8
2.5反应沉淀对大肠杆菌的抑菌效果测定8
2.5.1大肠杆菌抑菌圈的测定方法8
2.5.2反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响8
2.6反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响8
2.7数据处理与统计分析9
3结果与分析10
3.1不同制备条件下沉淀产物质量的得率10
3.1.1水浴温度对反应沉淀质量的影响及分析10
3.1.2水浴时间对沉淀产物质量的影响及分析10
3.1.3pH对产点产物的影响及分析11
3.2反应液菌体活性测定12
3.3反应沉淀对大肠杆菌抑菌效果测定与分析12
3.3.1反应沉淀对大肠杆菌的抑菌圈的影响12
3.3.2反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响15
3.4反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响17
3.4.1不同水浴时间制备的反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响18
3.4.2不同pH制备的反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响19
3.4.3不同水浴温度制备反应沉淀对金黄色葡萄球菌OD值的影响20
4结论22
附录A实验设备及仪器一览表23
附录B主要药品及试剂一览表24
参考文献25
致谢27
1前言
1.1概述
乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生乳酸的非病原性、革兰氏阳性细菌的通称,包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌等至少23个属。
一些乳酸菌是人和动物的胃肠道和雌性生殖道的共生菌,可以促进人和动物的健康。
此外,乳酸菌作为重要的益生菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中,被公认为是安全的食品级微生物[1]。
纳米氧化锌是一种面向21世纪的新型高功能精细无机产品,其粒径介于1~100nm,又称超微细氧化锌,是比较成熟的纳米级微量元素产品,具有一般氧化锌无法比拟的性能。
纳米氧化锌在动物体内可以通过被动扩散被吸收,降低对载体及能量消耗,提高吸收利用率,降低氧化锌在饲料中的添加量。
饲料中添加纳米氧化锌还能够提高机体抗氧化能力、增强免疫力、降低腹泻率及提高动物生产性能[2]。
1.2纳米技术的进展
目前纳米产品在动物营养领域的基础性研究甚少,如不同纳米营养素的适宜需要量,吸收时有无相互作用,对理化指标和功能基因的表达有无影响等,这些问题尚未得到充分的研究[3]。
此外,各种纳米饲料,纳米添加剂,纳米畜产品,纳米食品的安全性研究更是远远滞后于产品的开发,它们的安全性归根到底是关系到人民身体健康的丈事,必须要经过严格的评价和监控,防患于来然。
如不立刻加强这些方面的研究,不能及时给消费者一个明确可靠的说法。
纳米营养素的进一步开发将困难重重,纳米饲料、纳米功能食品的产业化就无法形成规模[4]。
1.3乳酸菌的生物学特征及其性质
乳酸菌属于原核类生物中的一类异养厌氧型或兼性厌氧型细菌,利用可发酵碳水化合物(主要是葡萄糖或乳糖)产生大量乳酸的革兰氏阳性菌的总称,广泛存在于人和禽的肠道中,能维持机体内多种微生物菌群之间的平衡,与人类的健康息息相关。
1.3.1乳酸菌的分类
从形态上分,乳酸菌可以分为球状、杆状链状、分支状三大类。
如圆形或卵圆形的和肠膜明串珠菌、分支状的双歧乳杆菌、四联状的乳酸片球菌。
现在国际上普遍采取的
是Bergey氏细菌鉴定手册中乳酸细菌的分类方法,凌代文[5]将乳酸细菌分成四大类:
革兰氏阳性无芽孢杆菌、形成内生芽孢的杆菌、革兰氏阳性兼性厌氧球菌、不规则形的专
性厌氧菌。
1.3.2细菌生物膜的特性
细菌生物膜是一种附着于细菌体表或界面由细菌群体和包裹菌体的水合性基质组成的聚合体[6],生物膜成熟后可以释放游离菌体。
与普通游离细菌相比,生物膜细菌和
生物膜释放细菌具有较强的抗逆性。
由于生物膜细菌在生理、代谢、对底物的降解或利
用和对环境的抵抗能力等方面具有独特的性质[7-9],生物膜的研究近年来备受重视。
细菌生物膜已在多个领域被广泛研究和应用,如环境修复工程和能源产业。
然而,
关于乳酸菌生物膜方面的研究和应用还相对较少,Speranza[10]等研究利用乳酸菌生物膜
来控制软质干酪中李斯特氏菌的生长,Rangaswamy[11]等研究过利用德氏乳杆菌保加利亚
亚种生物膜来连续生产乳酸。
保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌是益生菌典型代表,广泛应用于工业生产,利用其生物膜或生物膜释放菌体进行生产,既可以获取优良菌体又可以节约发酵剂,提高经济效益。
1.3.3饲用乳酸菌—微生物制剂
随着微生态学的不断发展,在饲料中添加微生物制剂在养殖业中得到了广泛的认可和使用。
乳酸菌微生态制剂是微生物制剂的一种,指将乳酸菌培养后,用适当的方法制成
带活菌的粉剂、片剂或丸剂等,具有整肠和防治肠胃疾病以及重新建立正常的肠道菌群平衡的作用。
孙笑非[12]等研究了乳酸菌在饲料中的运用,他指出微生物制剂在畜禽养殖业中,不
仅可以作为免疫增强剂加强免疫机能,也能作为生长促进剂提高质量和成活率等生产性
能。
杨琛杰[13]等总结了乳酸菌在微生态制剂上的研究,添加了微生态制剂的饲料,产生
不饱和脂肪酸和芳香酸,使饲料产生香味,刺激家禽的食欲;
微生物能产生蛋白酶、脂
肪酶和纤维素酶,促进食物中营养物质的吸收,提高了家禽对氮素的利用率。
同时微生
态制剂具有促进消化、增强免疫力、保护生态环境等特点。
因此,乳酸菌作为微生物制
剂在未来的养殖业中具有一定的经济效益和生态效益。
1.4纳米氧化锌的合成
1.4.1纳米氧化锌的无机合成
目前,纳米氧化锌的工业化生产方法很多,如沉淀法等,但这些传统方法多为高温
高耗能,对环境破坏大[14]。
而最近几年来,生物方法制备纳米材料得到了一定的发展,
如DNA分子、蛋白质、微生物、动物和植物体[15]等被用来制备纳米材料,Sangeetha等
用芦荟提取物成功合成纳米氧化锌材料[16]。
王娜等用蛋壳薄膜作为生物活性载体,设计了一种在有生物活性材料参与的条件下
室温原位合成硒化铅纳米团簇的新方法。
该方法利用蛋膜上特定周期性分布的大分子与
无机前驱体离子之间的螯合作用和电荷作用来控制硒化铅微晶的形成、聚集和分布,成
功地制备出了具有规则形状的硒化铅纳米团簇[17]。
1.4.2纳米氧化锌的生物合成
细菌生物膜无所不在。
随着人们对其认识的加深,各种针对生物膜的研究也相应展
开。
纳米材料技术就是其中之一。
然而,在各类细菌疾病盛行的今天,绝大部分的工作
者都执着于如何更有效地灭杀生物膜而忽视了生物膜自身的各种特性。
生物膜是一种具有复杂化学成分,独特生物活性以及精致微米/纳米结构的特殊材料。
细菌具有极高的比表面积,以及双向的钻附能力。
因此,纳米阵列会优在细菌的表面上生长,可以利用这一特性实现纳米阵列在复杂基底表面的固定和传导。
我们利用乳酸菌的私附能力,实现在复杂基底内壁中,致密氧化锌阵列的成核、固定与生长[18]。
1.4.3纳米氧化锌的抑菌
纳米ZnO颗粒(1~100nm)尺寸较小,比表面积较大,表现出非常高的化学活性、
小尺寸效应、量子尺寸效应、表面与界面效应和宏观量子隧道效应,在陶瓷、化工、电
子、光学、生物、医药等许多领域有重要的应用价值[19]。
由于纳米氧化锌的性能稳定
可靠、安全无毒以及无需紫外照射就能表现出良好的抑菌活力,在抗菌方面的应用更为
广泛[20],因此制备高质量的纳米ZnO非常重要。
喻兵权[21]权等人实验证明,在日光灯照射下,无论是对大肠杆菌还是金黄色葡萄球
菌,纳米氧化锌比普通氧化锌有更好的抑菌作用。
当纳米氧化锌和普通氧化锌质量分数
均为5%条件下,对大肠杆菌的抑菌率分别达到97.9%和52.9%;
对金黄色葡萄球菌抑菌
率分别达到98.8%和68.3%.研究表明,在5分钟内,纳米氧化锌对金黄色葡萄球菌的杀
菌率为98.86%,大肠杆菌为99.93%,显著高于普通氧化锌。
1.4.4纳米氧化锌在饲料中应用
纳米氧化锌不仅在光化学领域有很好的应用,在食品以及动物饲料中也发挥很大作
用[22]。
目前猪场养殖发现高锌能有效防止断奶猪仔的腹泻问题。
将纳米氧化锌替代普
通锌源,添加在动物饲养中,其高生物活性、对肠道致病菌的抗菌性[23]和吸收率可以
有效地减少腹泻,降低料肉比,而且剂量更少,对环境污染小,为人类健康造福,是目
前代替高锌最理想的饲料添加剂[24],在饲料行业的应用前景广阔。
胡文锋[25]等提供了一种利用乳酸菌生物合成纳米氧化锌的方法及纳米氧化锌复合饲料添加剂。
本发明利用乳酸菌合成纳米级氧化锌后可开发一种全新的富含纳米氧化锌的饲料添加剂。
这种添加剂应用于乳猪饲料中,添加量低于1000ppm(以氧化锌计)[26]。
因此除有效防止动物锌中毒,减少锌对环境的污染之外,还能通过乳酸菌和氧化锌的共同作用,有效防止断奶猪仔的腹泻,改善肠道健康水平,甚至可以全部或部分替代抗生素,减少抗生素残留,提高食品安全性能。
1.5本课题的要求、目的及意义
纳米氧化锌具有抗菌效应。
本研究的任务是利用益生性乳酸菌作为反应介质,以生
物方法制备纳米氧化锌。
目的是得到纳米氧化锌和乳酸菌的混合物,并进一步对该混合
物进行干燥、与载体混合,制备成为含有益生菌及纳米氧化锌复合功能成分的饲料添加
剂。
在生物技术和纳米技术之间突破新的领域。
2材料与方法
2.1实验菌种
唾液乳杆菌Lactobacillussalivarius,大肠杆菌Escherichia
coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus等均由中北大学发酵工程实验室保藏。
2.2实验仪器与药品
2.2.1实验仪器
见附录A
2.2.2实验药品
见附录B
2.3试剂配制及灭菌
2.3.1试剂及培养基配制(均是配制1000毫升所需)
MRS培养基配制:
称取蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g(固体培养基所加),加蒸馏水至1000mL,调节pH值至6.5左右。
在121℃的高温高压锅中灭菌15min。
LB培养基配制:
蛋白胨10g、酵母菌粉5g、氯化钠10g、琼脂15g(固体培养基所加),加入1000ml蒸馏水,调节pH值至7.2左右。
0.1g/mL氢氧化钠溶液配制:
称取10g固体氢氧化钠,缓慢加入到100mL蒸馏水中,并不断搅拌,充分溶解。
硫酸锌溶液配制:
称取11.27g硫酸锌固体,缓慢加入到200mL蒸馏水中,并不断搅拌,充分溶解。
2.4实验方法
2.4.1菌种活化
将实验室保藏的唾液乳杆菌按2%的接种量接种于MRS培养基中,37℃培养24小时,待菌液pH达到4.5左右,镜检,若视野范围内观察到大量紫色杆状菌株,表明其活化完成。
同理,将实验室保藏的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌按2%的接种量接种于LB培养基中,37℃培养24小时,可观察到培养基变浑浊,有菌种产生。
然后保存到冰箱中,待用。
2.4.2制备纳米氧化锌
制备纳米氧化锌工艺流程:
唾液乳酸杆菌的培养→加硫酸锌→调节pH值→水浴加热→37℃培养箱静置→纳米氧化锌产品
具体操作步骤如下:
将所需要以及灭菌完成的仪器和试剂放到超净工作台中,有烧杯、量筒、离心管、pH试纸、玻璃棒、硫酸锌溶液、氢氧化钠溶液等。
然后打开超净工作台中的紫外经行灭菌,灭菌15min。
灭菌完成后,关掉紫外,并将培养的唾液乳酸杆菌放入到超净工作台中。
用酒精对我们的手进行杀菌,点燃酒精灯。
然后用量筒量取一定的菌液转入到烧杯中,在量取等量的硫酸锌溶液缓慢加入到烧杯中,并不断搅拌,使两者充分混合。
测出混合溶液的pH,一般都小于5,加入氢氧化钠溶液,调节pH至5.5,取两支离心管,每支试管倒入10毫升混合液,并标记。
依次类推。
pH为6.5时,取28支离心管,每支试管倒入10毫升混合液,并标记。
然后对离心管水浴加热。
打开水浴锅。
当温度为45℃时,取两支装有混合物pH为6.5的离心管放入水浴加热25min,依次类推。
温度为75℃时,取装有混合物pH值不同的离心管全部水浴加热25min;
且其中10支pH为6.5的离心管,水浴加热时间分别为5、15、25、35、45min。
完成水浴加热后,将全部离心管放入到37℃的培养箱中陈化9小时。
制得反应沉淀(纳米氧化锌粗品)。
陈化完成后,得到反应液全液。
将部分反应全液在3500rpm离心20min。
分别得到反应液上清与沉淀。
将试管放到烘干箱中在100℃下烘4个小时,得到干燥的沉淀物。
并对其经行称量,测出物质的干重。
然后对其进行抑菌实验测定。
2.4.3纳米氧化锌的制备工艺
2.4.3.1不同水浴温度下纳米氧化锌的制备
在pH为6.5和水浴时间为25min的条件下,将水浴温度分为45℃、55℃、65℃、75℃、85℃五组,制备纳米氧化锌。
如表2.1所示。
表2.1不同水浴温度下纳米氧化锌的制备
组别
条件
温度/℃
培养状态
组1
菌液+硫酸锌溶液
45
静置
组2
55
组3
65
组4
75
组5
85
2.4.3.2不同水浴时间下纳米氧化锌的制备
在pH为6.5和水浴温度为75℃条件下,将水浴时间分为5min、15min2、5min、35min、45min五组,制备纳米氧化锌。
如表2.2所示。
表2.2不同水浴时间下纳米氧化锌的制备
时间/min
5
15
25
35
2.4.3.3不同pH下纳米氧化锌的制备
在水浴温度为75℃和水浴时间为25min的条件下,将pH分为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5五组,制备纳米氧化锌。
如表2.3所示。
表2.3不同pH下纳米氧化锌的制备
pH
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
2.4.4反应液中菌体活性测定
在超净工作台中,取15个无菌干燥的培养皿,用MRS进行涂板。
然后将各组的反应液用移液枪吸取100μL,分别打入培养皿的中央,然后用灭菌的玻璃棒进行涂匀,并标记。
再将涂好的培养皿放在37℃的培养箱经行培养,培养24小时候观察有无菌种生长。
2.5反应沉淀对大肠杆菌的抑菌效果测定
2.5.1大肠杆菌抑菌圈的测定方法
在超净工作台中,将灭菌完成后的LB培养基分别倒在培养皿中,等其冷却并凝固。
再将我们所培养的大肠杆菌从冷藏冰箱中取出,以无菌水稀释至合适浓度,用移液器吸取50μL打入涂满LB培养基的培养皿中,在用无菌玻璃棒涂板到LB琼脂平板上,边涂边旋转培养皿,使其充分涂匀。
再用灭菌过的打孔器在培养皿中打孔。
将步骤2.5中得到的纳米氧化锌反应沉淀用500μL无菌蒸馏水溶解,充分搅拌后混匀得沉淀重悬液,用移液枪吸取并打入到涂布了大肠杆菌平板的孔中,每个孔打入沉淀重悬液10μL。
晾干后将平板放入到37℃的培养箱中培养16个小时,测定抑菌圈的直径,按下式测定单位抑菌比。
单位抑菌比=抑菌圈直径/重悬液浓度(2-1)
2.5.2反应沉淀对大肠杆菌生长性能的影响
取16支灭菌试管,每只管装入10mL的LB培养基,以无菌方式接入20μL大肠杆菌菌液,摇匀。
然后用移液枪吸取2.6.1中的沉淀重悬液50μL,打入到其中15支试管中,摇匀并标记。
另外一支试管不加纳米氧化锌沉淀重悬液,为大肠杆菌自然生长状态的对照组。
测定各组试管中刚接种时的初始OD值,每组测三次,取平均值。
将所有试管放到37℃摇床中,培养24小时,取样测定OD值,每组测三次,取平均值。
得到各组培养前后OD值的增长值,按下式测定沉淀重悬液的抑菌率和单位抑菌率。
抑菌率=(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD值×
100%(2-2)
单位抑菌率=抑菌率/单位菌液中纳米氧化锌的量(2-3)
2.6反应沉淀对金黄色葡萄球菌生长性能的影响
取16支灭菌试管,每只管装入10mL的LB培养基,以无菌方式接入20μL金黄色葡萄球菌菌液,摇匀。
将所有试管放到37℃摇床中,培养24小时,取样测定OD值,每组测三次,取平均值。
得到各组培养前后OD值的增长值,按公式2.6中测定沉淀重悬液的抑菌率和单位抑菌率。
注:
实验完后,在倒菌液之前向其中加入有杀菌效果的试剂,比如氢氧化钠之类的,因为其易挥发,而且对人有严重的危害。
2.7数据处理与统计分析
用Excel2010进行数据处理及分析,采用t检验法进行数据间差异的多重比较,显著水平取0.05。
3结果与分析
3.1不同制备条件下沉淀产物的得率
3.1.1水浴温度对反应沉淀质量影响及分析
得率以产品离心后的反应沉淀质量来计。
取5支干燥的离心管,称其总重量为25.36g,平均每支试管质量为5.07g。
X=25.36/5=5.07g
当pH为6.5,水浴时间为25min时,不同水浴温度下得到沉淀物质量如表3.1所示。
表3.1水浴温度对反应沉淀质量的影响(单位g)
管1
5.50
5.45
5.41
5.62
5.51
管2
5.52
5.43
5.57
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- 利用 乳酸菌 制备 纳米 氧化锌 复合物 工艺 研究