肉品发酵剂的菌种筛选及在发酵香肠中的应用Word格式文档下载.docx
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3.3实验处理8
3.4结果与分析9
3.4.1不同发酵剂发酵香肠主要微生物的变化情况9
3.4.2不同发酵剂发酵香肠部分理化指标变化情况9
3.4.3不同发酵剂发酵香肠色泽和质地变化情况10
结论与展望11
参考文献12
致谢13
1.绪论
1.1选题目的及研究意义
在我国,传统的火腿和腊肠等自然发酵肉制品已经有几千年的历史,但其生产大都存在着加工周期长、劳动强度大、产品质量稳定性难以控制、不适应大规模现代化生产的问题,解决这些问题的核心是开展肉制品发酵微生物菌种的筛选,通过优良肉制品发酵微生物的应用,来抑制病原微生物的生长、防止氧化变色、改善组织与风味、延长食品的货架期。
因此,通过对我国丰富的肉制品微生物资源进行深入研究,从中分离选育出优良的微生物菌种是发酵肉制品加工的关键。
目前,国内的肉制品发酵剂的研究属于一个新兴的研究领域。
肉品发酵剂有利于提高肉品的食用安全性、增强风味、提高质量和延长肉品的货架期;
同时随着肉品生产规模的扩大以及对高质量肉品的需求,肉品发酵剂的研究兴趣日益浓厚。
近年来,国外对肉制品发酵剂的研究日益增多,如在欧美国家,乳酸菌被广泛用作肉制品的发酵剂。
因此一我们应借鉴国外经验,加快肉制品发酵剂的研究应用工作,对我国传统发酵肉制品的发展也具有重要意义。
1.2发酵肉制品的概述及特点
1.2.1发酵肉制品的概述
发酵肉制品是指在自然或人工控制条件下,利用微生物发酵作用,产生具有特殊风味、色泽和质地,且具有较长保存期的肉制品。
因肉制品在加工过程中经过了生物发酵,由特殊细菌或酵母,将糖转化为各种酸和(或)醇,使肉制品的pH值降低,并经低温脱水使Aw下降,因此,准确地讲应称其为发酵干燥肉制品。
发酵肉制品因其较低的pH值和较低的Aw使其得以保藏。
在发酵、干燥过程中产生的酸、醇、非蛋白态含氮化合物、脂及酸使发酵肉制品具有独特的风味。
1.2.2发酵肉制品的特点
1.2.2.1微生物安全性
一般认为发酵肉制品是安全的,因低Aw值和低pH值抑制了肉中病原微生物的增殖,延长了肉品的稳定期。
在贮藏期间,成品中的有害菌会因酸性环境而死亡。
近年来美国肉类工业开发了较好的发酵干香肠和半干香肠的加工技术,特别注重了质量控制。
他们认为一旦香肠的pH值小于5.3,就能有效地控制金黄色葡萄球菌的繁殖。
但在pH值降至5.3的过程中,必须控制香肠肉馅放置在15.6℃以上温度的时间。
1.2.2.2货架期
发酵肉制品由于降低了水分含量和pH值,货架期一般较长。
美式香肠的水分/蛋白质比率在3.1以下,pH5.0以下,故不需冷藏。
货架期稳定的肉制品主要有两类:
一类是pH值在5.2以下,水分活性在0.95以下;
另一类是pH值低于5.0,水分活性低于0.91。
这些产品在货架期间一般不发生细菌性变质,但可能发生化学或物理性变质。
微生物培养物因有稳定的可控酸化作用,使肉制品的货架期延长。
酸抑制了其他微生物的生长并促进脱水。
特制的微生物培养物通过过氧化氢酶系统减少形成过氧化物而加强腌制肉颜色的稳定并防止发生酸败。
1.2.2.3营养特性
研究发现摄食乳酸杆菌和含活乳酸菌的食品会使乳酸菌定植到人的大肠内,继续发挥作用,从而形成不利于有害菌增殖的环境,有利于协调人体肠道内微生物菌群的平衡。
乳酸杆菌能降低致癌物质前体或/和降低由转化前体生成致癌物质的酶活性。
因此,可以减少致癌物质的危害,对鼠注射或饲喂乳酸杆菌,植入的瘤被抑制,这是由于免疫系统被激活和加强的缘故。
发酵过程中,肌肉蛋白质被分解成肽和游离氨基酸,因此消化率增加。
1.3肉品发酵剂的种类及性质
从发酵和腌制肉品中分离的微生物区系来看,主要有:
乳杆菌属、片球菌属、链球菌属、微球菌属和青霉菌属等。
这些微生物对肉品的色泽、风味的形成以及品质卫生起着极其重要的作用。
1.4肉品发酵剂的菌种筛选标准
作为发酵剂的微生物应具有以下特征:
(1)食盐耐受性,能耐受6%的食盐溶液,具有优良的稳定性;
(2)能耐受亚硝酸盐,在80~100ppm浓度条件下仍能生长;
(3)能在27~43℃范围内生长,最适温度为32℃;
(4)同型发酵;
(5)发酵副产物不产生异味;
(6)无致病性、安全性;
(7)在57~60℃范围内灭活。
1.5发酵剂在肉制品生产中的应用
在我国,肉制品发酵剂的研究只是近几年的事,但是,传统的中式肉制香肠、腊肉、火腿等都少不了程度不等的自然发酵,尤其金华火腿生产中微生物发酵作用更加必不可少。
研究证明,有益菌可以提高发酵肉制品的营养、风味和卫生安全性;
反之,有害菌可导致发酵过程的失败.引起肉制品腐败变质.产生有毒有害物质,因此加快发酵肉制品发酵剂的研究对于提高发酵肉制品的质量,实现其现代化和规模化生产至关重要。
(一)通过降低pH值,减少腐败
原料肉在接种乳酸菌后,乳酸菌利用碳水化合物如葡萄糖发酵产生乳酸,从而使肉品pH值降至4.8~5.2,肌肉蛋白在酸性条件下变性形成胶状组织,从而增加了肉块间的结着力以及提高了肉品的硬度与弹性,此外乳酸菌还可赋于香肠特殊的风味。
由于pH值接近于肌肉蛋白等电点(pH=5.2),肌肉蛋白保水力减弱,可加快香肠干燥速度,降低水分活度,而且在酸性条件下病原菌及腐败菌的生长得以抑制。
(二)促进发色
肉制品的色泽是决定其品质的重要指标之一。
肉品在发酵成熟过程中,微球菌可以将NO3-还原为NO2-,而乳酸菌在发酵成熟时利用碳水化合物产生乳酸,降低了pH值,有利于NO2-分解为NO。
NO与肌红蛋白结合生成亚硝基肌红蛋白,从而最终使肉品呈腌制特有色泽。
(三)防止氧化变色
肉在腌制或发酵成熟期间,由于污染的异型发酵的乳酸菌会产生H202,与肌红蛋白形成胆绿肌红蛋白,而发生变绿现象。
因此在肉制品中接种发酵剂,可利用优势菌抑制杂菌的生长或将其产生的H202还原为H20和02,防止氧化变色。
(四)减少亚硝胺的生成
亚硝胺为致癌物已得到公认。
腌制肉中的亚硝胺由残留的NO2-与二级胺反应生成的。
如果在肉中加入乳酸菌,其产生乳酸降低pH值,促使亚硝酸盐分解,则可减少残留的NO2-与二级胺作用生成亚硝胺。
因此在肉中添加发酵剂可以提高肉制品的安全性。
(五)抑制病原微生物的生长及其产生的毒素
发酵香肠在制作中不经过加热,因此在自然发酵过程中如条件控制不当,则极易造成香肠发生腐败或因病原微生物的生长而导致食物中毒。
许多研究结果表明,发酵作用可以控制发酵肉制品中的病原菌,如沙门氏菌(Sa1monella)。
金黄葡萄球菌(Staphy1ococcusaureus)、肉毒杆菌(Clostridiumbotulinmm)的生长和产毒。
2.肉品发酵剂中乳酸菌的特性及筛选
2.1引言
我国传统发酵食品中具有很多优良的菌种资源,本试验从发酵食品中分离、纯化乳酸菌,对它们的主要发酵特性进行了研究,并以生产干发酵香肠为前提,从中筛选优良的乳酸菌发酵剂。
2.2材料
2.2.1分离样品
各种来源的发酵制品如腊肉、腊肠、金华火腿、泡菜、乳制品等20多种样品。
2.2.2培养基
(1)MRS培养基
蛋白胨10g,牛肉膏10g。
酵母提取物5g,K2HPO42g,柠檬酸二铵2g,乙酸钠5g,葡萄糖20g,MnSO4·
7H2O0.5g,MnSO40.25g,蒸馏水1000ml.pH值6.2-6.4,121℃灭菌20min。
固体培养基在液体培养基的基础上添加1.8%的琼脂。
(2)耐盐性试验培养基
MRS液体培养基添加2%、4%、6%的NaCl。
(3)耐硝性试验培养基
MRS液体培养基添加50、100、150mg/kg的NaNo2。
(4)葡萄糖产气培养基
MRS液体培养基,以硫酸铵替代柠檬酸铵,加入倒置的杜氏小管。
121℃灭菌20min。
(5)产H2S培养基(醋酸铅纸条法)
蛋白胨10g,牛肉膏10g,氯化钠5g,半胱氨酸0.5g,蒸馏水1000ml。
pH7.O-7.4,112℃灭菌20—30min。
(6)H2O2产生检测培养基
基础培养基:
牛肉膏0.5g,酵母膏0.5g,MnSO4·
4H2O0.01g。
琼脂1.5g,pH6.5,121℃15min。
单独灭菌的无菌糖1%,倾倒平板。
上层倾倒一薄层(1~2ml)同样培养基。
加入4%MnO2。
(7)模拟肉汤培养基
牛肉膏2%,蛋白胨2%,葡萄糖1%。
盐3%,NaN020.015%,pH6.5。
115℃灭菌20min。
2.2.3主要仪器设备和试剂
DHP-9082型电热恒温培养箱,pHS一25型pH计,752型紫外可见分光光度计,TGL一16C高速离心机,GC-TAG型气谱仪,生化鉴定管。
2.3试验方法
2.3.1乳酸菌的分离、纯化
取20g样品于180g无菌蛋白胨水震荡混匀,系列稀释,取上清液以MRS+3%CaCO3作培养基倾倒平板,挑取产生溶钙圈的单菌落,划线分离纯化,纯菌进行革兰氏染色,选取革兰氏阳性和触酶阴性菌,用MRS液体培养基加20%甘油(w/v)-20℃保存。
2.3.2乳酸菌的主要发酵特性试验
(1)产粘液:
挑取菌落直接观察。
(2)耐盐性:
把菌接种于添加6%NaCl的液体培养基,600nm测定OD值,比较其生长情况,以MRS培养基作空白对照。
(3)耐硝性:
把菌接种于添加150mg/kgNaNo2的MRS液体培养基,600nm测定OD值,比较其生长情况,以MRS培养基作空白对照。
(4)H2O2产生:
新鲜培养物于H2O2产生检测培养基划线,培养5天。
观察菌落周围,变澄清者为H2O2阳性。
(5)抑菌实验:
20ml不加乙酸钠的MRS固体培养基融化后冷却到45℃左右,与指示菌(大肠杆菌和金黄色葡萄球菌)新鲜培养物100µ
l混匀后倒平板,凝固后用直径为7㎜的无菌打孔器在平板上打孔,准确量取40µ
l的乳酸菌培养液加入小孔中,平板置于4℃冰箱扩散,然后放置30℃恒温培养24h,观察小孔周围抑菌圈。
2.3.3乳酸菌优良菌株的筛选及其生长特性
2.3.3.1优良菌株的筛选结果
(1)菌株生长曲线和pH值的测定
筛选出的四株乳酸菌接种于MRS液体培养基。
30℃培养24h,以MRS为空白对照,每2h用紫外分光光度计于600nm测定OD值,用酸度计测定pH值。
(2)菌株在不同温度下的生长情况
分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃培养18h,于600nm测定OD值。
(3)菌种的生化鉴定
对筛选得到的菌株分别用生化鉴定管进行糖醇发酵试验。
18~72h后观察并记录有关情况。
2.3.3.2乳酸菌混合发酵剂的筛选
(1)菌株间的拮抗反应(滤纸片法)
取lml菌液和冷却至45℃的15mlMRS培养基混匀后倒平板,作为指示菌;
取直径6mm的灭菌(121℃,20min)滤纸片,另外一种乳酸菌的新鲜培养液10µ
l加在滤纸片上,平放在上述含菌平板上,3O℃培养48h,观察并记录滤纸片周围的抑菌圈。
为排除酸的作用,取用85%的乳酸调节至pH3.9的MRS培养基10µ
l做同样处理。
(2)单菌株和混合菌株的产酸情况
选择在滤纸片法中观察有较强拮抗作用的R17和J33,没有拈抗作用的R17和P20两组,分别单独和混合后接种于模拟肉汤培养基中,30℃培养24h,每6h测定pH值。
2.3.4结果和分析
2.3.4.1分离乳酸菌的主要发酵特性
表2.3.4.1筛选的乳酸菌的主要发酵特性
菌株特性
R17
P20
P30
J33
来源
腊肉
形态特征
杆,0.5x1.0µ
m
球,四联或成对排列,直径﹤1µ
球,四联或成对排列,直径1µ
短杆,0.6x1.2µ
24h酸度
(MRS)
4.5
4.05
4.07
3.95
活菌数
(10cfu/m1)
1.5
2
2.5
4
产粘液
-
耐盐性/6%
+
耐硝性
(150rag/kg)
产气
H2S
氨基酸脱羧酶
精氨酸产氨
抑制大肠杆菌
抑制金黄色
葡萄球菌
产H2O2
气谱分析
乳酸
2.3.4.2乳酸菌的生长曲线表
从表2.3.4.2a可以看出,4种乳酸菌培养8~12h后进入稳定生长期,4种乳酸菌的生长速度差异极著。
J33的生长速度最快,R17的生长速度最慢。
由表2.3.4.2b可以看出,这4条曲线有共同的变化趋势:
在培养初期pH值下降最为迅速。
随着时间的延长,这种下降趋势逐渐变缓,与菌株的生长曲线大体一致。
4种乳酸菌在24h内的产酸能力差异极显著。
J33的pH值下降最迅速,在24h内由最初的6.1下降到3.9。
R17的pH值下降最慢,24h时pH值为4.1。
2.3.4.3不同温度菌株的生长情况.
由图2.3.4.3可以看出,不同温度对菌株影响不同,4株菌最适生长温度都为3O℃。
菌株在不同温度下的生长速度差异显著,温度从15℃上升至3O℃的过程中,生长速度随温度的上升加快,温度继续上升,生长速度反而下降。
15℃条件下4株菌生长速度都受到极显著影响(P<
0.01)。
表2.3.4.2a不同乳酸菌24h的菌体密度变化
时间/h
OD值/600nm
0.5
0.8
1.2
1.0
8
1.3
1.6
1.7
12
1.4
1.8
16
2.0
20
24
1.9
2.2
表2.3.4.2b不同乳酸菌24h的PH变化
时间\pH值
6.1
5.5
5.7
5.3
4.9
4.4
4.2
4.3
4.1
4.0
3.9
表2.3.4.3不同温度下菌株的生长情况
温度℃\OD值600nm
15
0.3
0.9
1.1
25
30
35
2.1
2.4结论
(1)一般发酵剂的菌种是从相应的自然发酵的产品中分离出来的,由于原料配方和生产条件不同,分离出来的微生物也不相同。
无论哪种菌种,在肉品发酵条件(pH、Aw、温度、腌制剂)下,发酵剂在经历尽可能短的停滞期后,应该能够以适当的速度发挥它们理想的活性。
因此,从发酵食品中分离、纯化的132株乳酸菌。
以生产干发酵香肠为筛选条件,优选出了4株乳酸菌R17、P20、P30和J33。
(2)四株乳酸菌的生长速度和产酸能力差异极显著,J33的生长速度最快,R17的生长速度最慢。
J33的pH值下降最快,R17的pH值下降最慢。
四株菌最适生长温度均为30℃,菌株在不同温度下的生长速度差异显著。
(3)根据四株乳酸菌表型特征和生理生化特征.经初步鉴定,R17为戊糖乳杆菌,P20和P30为戊糖片球菌,J33为米酒乳杆菌。
3.优选菌株在发酵香肠中的应用
3.1引言
发酵香肠在发酵和成熟过程中,发生了一系列复杂的变化,从而将新鲜的原料肉转变成风味独特且货架期长的发酵肉制品。
其中发酵剂是实现对发酵过程有效控制的保证,优良发酵剂的筛选是完成从传统的自然发酵向微生物接种发酵的工业化生产的转变的关键,但只有使用得当,确定好优良的发酵工艺才可以提高制品的卫生安全性、风味和感官质量,延长货架寿命。
反之,则可能导致发酵过程的失败,并可能产生一些有毒物质。
用筛选出的菌株作为干发酵香肠的发酵剂,并测定在发酵和成熟过程中产品的主要微生物变化、pH值和Aw值的变化等对产品进行综合评价,确定合适的发酵剂。
3.2材料和方法
3.2.1菌株
戊糖乳杆菌R17、戊糖片球菌P20和P30、米酒乳杆菌J33。
3.2.2制作工艺
配方:
猪后腿瘦肉80%,猪背脊20%。
其他调料按肉重,盐2.5%,NaN020.015%,KN030.02%,蔗糖0.5%,葡萄糖0.5%,抗坏血酸0.06%,胡椒粉0.3%。
工艺流程:
切肉→斩拌→加入腌制剂和发酵剂→灌肠→发酵(22—25℃,RH90—95%,3天)→成熟(15一18℃,RH70—80%)
3.2.3主要仪器和设备
DSX一280AI型手提式灭菌器上海申安医疗器械厂
SPX一250B-Z型生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂
pHS一3C数显酸度计上海虹益仪器仪表有限公司
Acculab电子天平北京赛多利斯仪器系统有限公司
PHs一25型PH计上海精科雷磁
722分光光度计上海精密仪器有限公司
ws(j—S测色色差计上海精密科学仪器有限公司物理光学仪器厂
QTS一25质构仪英国Stevens公司
绞肉机、斩拌机、搅拌机、灌肠机德国mainca公司
3.3实验处理
实验分为四组,添加不同的发酵剂(接入量为107cfu/g),分别以菌种编号和对照cK表示。
加工后l、3、7、14和28天取样测定。
3.3.1测定理化指标和感官评价
3.3.1.1理化指标
(1)pH值的测定:
按照GB9695.5-88规定的方法测定。
将样品绞碎后,准确称取10.OOg,加入90mL蒸馏水,搅拌30分钟后用pHS一3C数显酸度计测定其pH值。
(2)水分活度的测定:
按照GB/T9695.12-88测定。
(3)水分含量的测定:
采用GB/T9695.12-1988中的康维氏皿扩散法。
(4)挥发性盐基态氮(TVB-N):
半微量凯氏定氮法,按GB5009.7-85测定。
(5)丙二醛TBA测定[83,84]:
萃取法.
(6)亚硝残留量的测定:
格里斯试剂比色法,按GB/T5009.33-96测定。
(7)细菌总数、乳酸菌数的测定:
测定方法按照GB/T4789-94的方法,分别采用PCA和MRS平板计数法计数。
(8)致病菌的检测:
检测在发酵香肠成品中最可能出现的四种致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠菌群、沙门氏菌、李斯特氏杆菌)的存在情况。
其检测方法分别采用的是GBT4789.10-2003、GBT4789.32—2002、GB/T4789.4.94、GB/T4789.30.94。
3.3.1.2感官分析
(1)质地剖面分析(TPA)
对发酵香肠成熟样品进行质地剖面分析。
测定时取发酵香肠中心部位,切成l×
l×
l㎝的小方块。
用P50探头,压缩比60%,测试速度2mm/s。
测定项目:
硬度Hardness(g)咀嚼性Chewines8(g×
mm)、胶粘性Gumminess(g)。
(2)感官评价
由10位有食品感官品尝经验的人员组成感官评定小组,评定小组主要针对发酵香肠的外观、组织状态和风味(气味和滋味)这三方面属性进行打分。
3.4结果与分析
3.4.1不同发酵剂发酵香肠主要微生物的变化情况
表3.4.1添加不同发酵剂的发酵香肠总菌数的变化
时间(d)\总菌数
CK
R17+P20
5
7.5
8.9
8.7
10
7.0
8.5
7.1
8.
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