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有机物主要是由糖、蛋白质、核酸、脂、维生素以及它们的降解产物与代谢产物组成。
无机物参与有机物组成,或单独存在于细胞原生质内的无机盐等。
表,微生物细胞中几种主要元素的相对含量(%干重)
元素
细菌
酵母菌
霉菌
碳
氮
氢
氧
磷
硫
50
15
8
20
3
1
49.8
7.5
6.7
31.1
1.5
0.3
47.9
5.2
40.2
1.2
0.2
2.微生物的营养要素
组成微生物细胞的化学元素分别来自微生物生长所需要的营养物质。
反过来讲,微生物生长所需要的营养物质应该包含组成微生物细胞的各种化学元素。
常将微生物需求量相对较大、对细胞结构和代谢起重要作用的营养物质称为大量营养物质,这包括蛋白质、碳水化合物以及其他含有C、H和O原子的分子;
而微量营养物质或痕量元素,则指的是像Mn、Zn、Ni等细胞需求量极少,但在酶的功能和蛋白质结构的维持方面起作用的物质。
微生物生长所需要的营养物质概括起来主要有碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水等6类。
2.1碳源:
凡可被微生物用来构成细胞物质或代谢产物中碳架来源的营养物通称碳源。
碳源的作用:
碳素化合物是构成机体中有机物分子的骨架;
碳素化合物是大多数微生物的能源;
构成微生物代谢产物的分子骨架。
微生物的碳源:
凡必需利用有机碳源的微生物,称为异养微生物(对于利用有机碳源的异养型微生物来说,其碳源往往同时又是能源。
此时,可认为碳源是一种具有双功能的营养物);
凡能利用无机碳源的微生物,则是自养微生物(以CO2为主要碳源)。
纵观整个微生物界,微生物所能利用的碳源种类远远超过动植物。
至今人类已发现的能被微生物利用的含碳有机物有700多万种,可见,微生物的碳源谱极其宽广。
微生物能利用的碳源的种类及形式极其广泛多样,既有简单的无机含碳化合物如CO2和碳酸盐等,也有复杂的天然有机化合物,如糖与糖的衍生物、醇类、有机酸、脂类、烃类、芳香族化合物以及各种含氮的有机化合物。
其中糖类通常是许多微生物最广泛利用的碳源与能源物质;
其次是醇类、有机酸类和脂类等。
微生物对糖类的利用,单糖优于双糖和多糖,己糖胜于戊糖,葡萄糖、果糖胜于甘露糖、半乳糖;
在多糖中,淀粉明显地优于纤维素或几丁质等多糖,纯多糖则优于琼脂等杂多糖和其他聚合物(如木质素)等。
微生物对碳源的利用因种不同而异,可利用的种类差异很为悬殊。
有的微生物能广泛利用各种不同类型的含碳物质,如假单胞菌属(Pseudomonas)中的某些种可利用90种以上不同的碳源。
有的微生物利用碳源的能力却有限,只能利用少数几种碳源,如某些甲基营养型细菌只能利用甲醇或甲烷等一碳化合物。
又如某些产甲烷细菌、自养型细菌仅可利用CO2为主要碳源或唯一碳源。
工业发酵生产中所供给的碳源,大多数来自植物体,如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠、糖蜜等,其成分以碳源为主,但也包含其他营养成分。
实验室中,常用于微生物培养基的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、甘油和有机酸等。
2.2氮源:
能被微生物用来构成微生物细胞组成成分或代谢产物中氮素来源的营养物通称为氮源。
氮源的作用:
氮源是构成微生物细胞物质或代谢产物中的氮素来源;
氮素一般不提供能源,只有少数例外。
微生物利用的氮源:
有机(大多寄生性微生物和一部分腐生需要有机氮化合物如简单的蛋白质、氨基酸、嘌呤等作为氮源)与无机含氮化合物(如氨基、硝基和简单有机氮化合物如尿素,多数微生物都能利用)及分子态氮(少数微生物能直接利用N2,被称为固氮微生物,如固氮菌、根瘤菌),均可被相应的微生物用作氮源。
(各包括那些物质)
有机含氮化合物包括尿素、胺、酰胺、嘌呤、嘧啶、蛋白质及其降解产物——多肽与氨基酸等,均可被不同微生物所利用。
其中蛋白质水解产物是许多微生物的良好氮源。
仅有某些微生物可以利用嘌呤与嘧啶,如尿酸发酵梭菌(Clostridiumacidiurici)和柱孢梭菌(C.cylindrosporum)只能利用嘌呤与嘧啶为氮源、碳源和能源,而不利用萄葡糖、蛋白胨或氨基酸。
工业发酵中利用的有机含氮化合物,主要来源于动物、植物及微生物体,例如鱼粉、黄豆饼粉、花生饼粉、麸皮、玉米浆、酵母膏、酵母粉、发酵废液及废物中的菌体等。
大多数微生物能利用无机含氮化合物,如铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐等,但仅有固氮微生物可利用分子态氮作氮源。
蛋白胨和肉汤中含有的肽、多种氨基酸和少量的铵盐及硝酸盐,一般能满足各类细菌生长的需要。
因此,铵盐、硝酸盐、蛋白胨和肉汤等是实验室培养微生物常用的氮源。
2.3无机盐
无机盐是微生物生长所必不可少的一类营养物质。
无机盐的生理功能:
构成微生物细胞的组成部分;
作为酶的组成部分(参与酶的形成、激活并维持酶的最大活性);
维持酶的活性;
调节并维持细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位;
有些元素作为某些微生物生长的能源物质等。
根据微生物生长繁殖对无机盐(mineralsalts)需要量的大小,可分为大量元素和微量元素两大类。
凡是生长所需浓度在10-3~10-4mol/L范围内的元素,可称为大量元素,例如S、P、K、Na、Ca、Mg、Fe等。
凡所需浓度在10-6~10-8mol/L范围内的元素,则称为微量元素,如Cu、Zn、Mn、Mo、Co、Ni、Sn、Se等。
Fe实际上是介于大量元素与微量元素之间,故置于两处均可。
在配制微生物培养基时,对于大量元素,可以加入有关化学试剂,常用K2HPO4及MgSO4。
因为它们可提供4种需要量最大的元素。
对于微量元素,由于水、化学试剂、玻璃器皿或其他天然成分的杂质中已含有可满足微生物生长需要的各种微量元素,因此在配制普通培养基时一般不再另行添加。
但如果要配制研究营养代谢等的精细培养基,所用的玻璃器皿应是硬质的,试剂是高纯度的,此时就须根据需要加入必要的微量元素。
2.4生长因子
为某些微生物生长所必需、其自身又不能合成、需要外源提供但需要量又很小的有机物质通称为生长因子。
狭义的生长因子一般仅指维生素。
广义的生长因子除了维生素外,还包括氨基酸类、嘌呤和嘧啶类以及脂肪酸和其他膜成分等。
由于遗传上或代销机制上的原因而缺乏合成生长因素能力的微生物被称为营养缺陷型微生物。
实验室和工业生产上常常通过物理或化学诱变的方法来获得营养缺陷型菌种。
生长因子的主要功能:
提供微生物细胞重要化学物质、辅因子的组分和参与代谢。
实际上,所有微生物色生长都需要生长因素,所不同的是,一般的微生物能通过自身代谢合成这些必需的有机营养物来满足生长的需要,而有些微生物在其中某些物质的自身合成上存在缺陷,因此必须通过外源提供才能正常生长。
例如,所有的微生物都需要20种不同的氨基酸来继续蛋白质的合成,但有些微生物无法自身合成所有这20种氨基酸。
常由于对某些微生物生长所需的生长因子要求不了解,因此常在培养这些微生物的培养基里加入酵母膏、牛肉膏、玉米浆、肝浸液、麦芽汁或其他新鲜的动植物组织浸出液等物质以满足它们对生长因子的需要。
2.5水
水对微生物的生存起重要作用。
水在细胞中的生理功能主要有:
微生物细胞的组成成分(占生活细胞总量的90%);
是细胞营养物质和代谢产物的溶剂;
是细胞中各种生化反应的良好介质;
水还能维持微生物细胞的膨压;
水具有较高的比热,稳定细胞内环境温度。
2.6能源:
为微生物的生命活动提供最初能量来源的物质称为能源。
微生物能利用的能源种类因种不同而异,主要是一些无机物、有机物或光。
能作为化能自养微生物能源的物质都是一些还原态的无机物质,例如NH4+,NO2-,S,H2S,H2和Fe2+等,这些化能自养型的细菌包括硝化细菌、硫化细菌、氢细菌和铁细菌等。
许多营养物具有一种以上的营养功能。
例如,还原态无机营养物常是双功能的(如NH4+既是硝化细菌的能源,又是其氮源),有机物常起着双功能或三功能的营养作用,例如以N,C,H,O类元素组成的营养物常是异养型微生物的能源、碳源兼氮源。
而光是光合微生物所利用的单功能能源。
3.微生物的营养类型
微生物对各种营养物质的利用,就其总体而言,几乎没有一种物质不被它们利用。
但就某一类或某一种微生物来说,它们所能利用的物质都有一定的范围,即某一种或某一类微生物只能利用某些形式的营养物质。
据微生物生长所需要的碳源物质的性质,可将微生物分成自养型(autotroph)与异养型(heterotroph)两大类。
又可以微生物生长所需能量来源的不同进行分类,可分成化能营养型(chemotroph)与光能营养型(phototroph)。
还可根据其生长时能量代谢过程中供氢体性质的不同来分,将微生物分成有机营养型(organotroph)与无机营养型(lithotroph)。
综合起来,可将微生物营养类型划分为四种基本类型,即化能有机异养型、化能无机自养型、光能无机自养型与光能有机异养型等。
①化能有机营养型:
以适宜的有机碳化合物为基本碳源,以有机物氧化过程中释放的化学能为能源,以有机物为供氢体进行生长的微生物通称为化能有机营养型。
化能有机营养型又称为化能异养型。
它们的特点是不能以CO2这样的无机碳源作为其生长的主要碳源或唯一碳源,它们所能利用的基本碳源、能源物质、能量代谢中的供氢体均为有机物。
这类微生物生长所需要的碳源如淀粉、糖类、纤维素、有机酸等,主要是一些有机含碳化合物。
对于化能有机营养型微生物来说,有机物通常既是它们生长的碳原物质又是能源物质和供氢体。
绝大多数细菌与全部真核微生物都属于化能有机营养型。
②化能无机营养型:
又称化能自养型,这是一类能氧化某种还原态的无机物质,利用所释放的化学能还原CO2,合成有机物质,进行生长、繁殖的微生物。
该类微生物的特点是能以CO2作为生长的主要碳源或唯一碳源,不需要有机养料;
其所能利用的能源物质与供氢体均是无机性质的。
例如硝酸细菌、氢细菌、硫化细菌、硫化细菌、铁细菌等均属于化能无机营养型微生物。
③光能无机营养型:
又称为光能自养型,这是一类含有光合色素、能以CO2作为唯一或主要碳源并利用光能进行生长的微生物。
它们能以无机物如硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机硫化物,以及水作为供氢体,使CO2还原成细胞物质。
藻类、蓝细菌、绿硫细菌和紫硫细菌就属于这类微生物。
例如藻类和蓝细菌具有与高等植物相同的光合作用,它们从日光捕获光能,从水中获得所需的氢,还原二氧化碳,放出氧。
绿硫细菌和紫硫细菌也能行光合作用,它们以H2S为供氢体,还原CO2,但不产氧气。
④光能有机营养型:
又可称为光能异养型,有少数含有光合色素的微生物种类,能利用光能为能源,还原CO2合成细胞物质,同时又必须以某种有机物质作为光合作用中的供氢体,因而被称为光能有机营养型。
例如红螺菌属(Rhodospirillum)中的一些细菌,它们能利用异丙醇作为供氢体,使CO2还原成细胞物质,同时积累丙酮。
光能异养型细菌在生长时大多数需要外源的生长因。
4.培养基
为研究和利用微生物,首先要培养微生物,人为地创造适宜的环境培养微生物。
要培养微生物,就得给微生物提供各式各样的食品。
这种由人工配制的用于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质,在微生物学中称培养基。
4.1培养基配制应遵循的原则
微生物的种类,迄今为止已有10万种以上,营养要求也千差万别。
那么如何设计和配置出适合我们所需要的微生物生长要求的培养基?
我们感到,遵循“投其所好”的设计培养基的原则,就能到达预期的目的。
培养基的配制应遵循以下几个原则:
(1)选用合适的营养物质
(2)根据培养为的目的选择合适的营养物质
(3)注意各种营养物质的浓度与配比
(4)注意控制培养基的pH
(5)注意控制培养基的渗透压
4.2培养基的类型
培养基种类很多,可根据构成培养基的成分、物理状态、用途将培养基分成若干类型。
4.2.1根据营养成分的来源
根据构成培养基的化学成分的了解程度,可将培养基分成合成培养基、半合成培养基和天然培养基三大类。
(1)合成培养基:
组合培养基,它是由化学成分完全了解的物质(已知成分和数量的化学物质)配制而成的培养基。
优点:
成分已知、精确、重复性好。
缺点:
价格较贵、配制较烦,培养的微生物生长较慢。
不宜于大规模生产,一般用于实验室中使用,研究微生物的营养特性、代谢机理、遗传变异、分离鉴定等时常使用合成培养基。
例如用于分离培养放线菌的高氏1号培养基,其组成分均为明确已知的化学成分。
(2)半合成培养基:
又称为半组合培养基,是指一类主要用已知化学成分的试剂配制,同时又添加某些未知成分的天然物质制备而成的培养基。
半合成培养基得营养成分更加全面、均衡,可充分满足微生物的营养需求,是实验室和发酵工业中用得最多的一类培养基。
如一般用于培养霉菌的马铃薯蔗糖培养基则为半合成培养基。
特点:
是配制方便,成本低,微生物生长良好。
(3)天然培养基:
是指用化学成分并不十分清楚或化学成分不恒定的天然有机物质配制而成培养基。
常用的有机物有牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、麦芽汁、豆芽汁、玉米粉、麸皮、牛奶、血清等,它们含有丰富的营养成分,能满足营养需求复杂的微生物的需求,适合培养许多异养型微生物。
这些天然成分大多来自于动植物或酵母提取物,包括细胞、组织或分泌物。
如实验室常用于培养细菌的牛肉膏蛋白胨培养基,及培养酵母菌的麦芽汁培养基等就属于此类培养基。
此外,一些具有独特风味的发酵食品入蒜泥、饮料酒、腐乳、酱类等也都是以天然原料的基质,培养特定的微生物,使其生长、繁殖、积累代谢产物等。
取材方便、营养丰富、种类繁多、配制方便;
确切营养成分不明确、不稳定。
4.2.2根据物理状态划分
培养基还可根据其物理状态分成液体培养基、固体培养基与半固体培养基等类型。
(1)液体培养基:
指呈液体状态的培养基。
无论在实验室还是生产实践中,液体培养基被广泛应用。
尤其是工业生产上,液体培养基被用于培养微生物细胞或获得代谢产物,如用于制面包的酵母的生产、食用调味剂味精(谷氨酸钠)的生产、大多数抗生素的生产均采用大规模的液体培养基进行发酵。
(2)固体培养基:
即指呈固化状态的培养基。
根据固态性状,又可分为以下几种类型:
固化培养基(solidifiedmedia)也称固体培养基,是由液体培养基中加入凝固剂(gellingagent)而成。
琼脂是最为优良与应用最为广泛的凝固剂,明胶曾被广泛使用,但由于琼脂理化特性远胜于明胶,现已很少采用明胶作培养基凝固剂。
通常在液体培养基中加入1%~2%的琼脂(agar)配制固体培养基。
在特殊用途时也加入5%~12%明胶(gelatin)做凝固剂,如用来检验某些微生物分解蛋白质的生理生化特性等。
表4-5为琼脂与明胶的理化特性比较。
表,琼脂与明胶生物与理化性能比较
比较项目
化学组成
营养价值
分解性
融化温度
凝固温度
常用浓度
耐高温灭菌
琼脂
聚半乳糖的硫酸酯
无
罕见
~96℃
~40℃
1.5~2.5%
强
明胶
蛋白质
可作氮源
较易
~25℃
~20℃
5~12%
弱
不可逆固体培养基:
这类培养基一旦凝固就不能再被融化,故称之为不可逆固体培养基。
如医药微生物分离培养中常用的血清培养基及用于化能自养细菌的分离、纯化与培养的硅胶(silicagel)培养基等。
天然固体培养基:
指由天然固态营养基质制备而成的固体培养基。
常用的天然固态营养基质有麦麸、米糠、木屑、植物桔杆纤维粉、马铃薯片、胡萝卜条、大豆、大米、麦粒等。
如固体发酵生产纤维素酶常用麦麸为主要原料的天然固体培养基,又如食用菌生产常用植物秸杆纤维粉为主要原料的天然固体培养基。
(3)半固体培养基(semi-solidmedia)是指在液体培养基中加入少量凝固剂而制成的坚硬度较低的固体培养基。
一般常用的琼脂浓度为0.2%~0.7%。
这种培养基常分装于试管中灭菌后用于穿刺接种观察被培养微生物的运动性、趋化性研究、厌氧菌培养、菌种保藏等。
4.2.3根据用途划分
根据培养基的用途,又将培养基分成以下四种类型。
(1)基础培养基(minimummedia)含有一般微生物生长繁殖所需基本营养成分的培养基称为基础培养基。
牛肉膏蛋白胨培养基就是基础与应用研究中常用的基础培养基。
在基础培养基中加入某些特殊需要的营养成分,可构成不同用途的其它培养基,以达到更有利于某些微生物生长繁殖的目的。
(2)加富培养基(enrichmentmedia)指在基础培养基中加入某些特殊需要的营养成分配制而成的营养更为丰富的培养基。
加富培养基一般用于培养对营养要求比较苛刻的微生物。
在研究致病微生物时常采用加富培养基。
如培养某些致病菌常需要在基础培养基中加入血液、血清或动物与植物的组织液等。
在含有多种微生物的样品中分离某种微生物时,常需要根据欲分离的微生物的营养嗜好,在基础培养基中添加特定的营养成分,使更加有利于欲分离的目标微生物的生长繁殖。
如用液体培养基培养,可使微生物群体中欲要分离的目标微生物随培养时间的延长在数量逐步占据优势,以利于下一步分离;
如是用固体平板培养基培养,可使微生物群体中欲要分离的微生物较早形成菌落而利于分离。
(3)选择性培养基(selectivemedia)用于从混杂的微生物群落中选择性地分离某种或某类微生物而配制的培养基称为选择性培养基。
选择性培养基配制时可根据不同的用途选择特殊的营养成分或添加特定的抑制剂,以达到分离特定微生物的目的。
在实践中有两种方式,一种是正选择,另一种是反选择。
所谓正选择是添加某种特定成分为培养基主要或唯一的营养物,以分离能利用该种营养物的微生物。
如从混杂的微生物群落中选择性地分离能利用纤维素的微生物时,则把纤维素作为选择培养基的唯一碳源,把混杂的微生物群落样品涂布于此种培养基上,凡能在该培养基上生长繁殖的微生物即为能利用纤维素的微生物。
以此类推,可以分离利用各种各样营养物的微生物。
反选择是在培养基中加入某种或某些微生物生长抑制剂,以抑制所不希望出现的微生物,从而从混杂的微生物群体中分离不被抑制和所需要的目标微生物。
如在选择培养基中加入青霉素、链霉素以抑制细菌,从而分离霉菌与酵母菌;
在选择培养基中加入一定量10%的酚试剂以抑制细菌与霉菌,分离放线菌;
在基因工程中,也常用加入抗生素的选择培养基来筛选带有抗生素标记基因的基因工程菌株或转化子。
(4)鉴别培养基(differentialmedia)用于鉴别不同微生物类型微生物的培养基称为鉴别培养基。
鉴别培养基主要用于微生物的分类鉴定和分离或筛选产生某种或某些代谢产物的微生物菌株。
如要了解某种微生物利用葡萄糖时是否产酸,就在葡萄糖为唯一碳源的培养基中加入一定量的1%溴麝香草酚蓝酒精溶液,溴麝香草酚蓝是一种在pH6.8左右时呈浅草青色,pH低于6.6时变黄,pH高于7.0时变蓝的指示剂。
当培养的细菌能利用葡萄糖产酸,则使培养基呈酸性而变黄色,从而利用葡萄糖产酸这一生理生化特性得以被鉴定。
在微生物学研究与应用实践中,还常配制一些结合两种甚至多种功能与类型的综合性培养基。
如在医学微生物研究中用于分离与鉴定白喉杆菌的血液碲盐琼脂培养基,以100mL3%的肉浸液琼脂为基本营养成分外,还添加2mL1%亚碲酸钾水溶液、2mL0.5%胱氨酸水溶液和5mL兔血。
待分离样品中如含有白喉杆菌,则白喉杆菌能使亚碲酸钾还原为碲,从而使形成的菌落呈黑色而被鉴别。
如以该功能分类,此培养基应为鉴别培养基;
但亚碲酸钾又具有抑制样品中革兰氏阴性细菌、葡萄球菌与链球菌的生长,有利于白喉杆菌的检出,如以该功能分类,此培养基应为选择性培养基;
该培养基中还加有胱氨酸与兔血,可促进白喉杆菌生长,如以该功能分类,这一培养基应为加富培养基。
由此可见,上述各种分类是相对的。
第二讲(3学时)
掌握营养物质进入微生物细胞的方式,理解微生物的代谢类型及其能量代谢、分解代谢和合成代谢
营养物质进入微生物细胞的途径,微生物的能量代谢类型
四种营养物质进入微生物细胞的方式的异同
微生物获得“食物”有哪些方式?
微生物吸收营养物质的四种方式,微生物的能量代谢与微生物的呼吸作用,化能异养菌的生物氧化和产能自养菌的生物氧化与产能,
3.微生物对营养物质的吸收
微生物不能像动物那样具有专门的摄食器官,也不像植物那样就具有根系吸收营养和水分,它们对营养物质的吸收是借助生物膜的半透性及其结构特点以几种不同的方式来吸收营养物质和水分的。
细胞膜是双层磷脂分子与蛋白质构成的液态镶嵌型结构,这种结构上有许多微孔,具有这
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