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是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。
可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。
3.按照微生物的种类分培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。
常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基;
常用的放线菌培养基为高氏1号培养基;
常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基;
常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖(或蔗糖)琼脂培养基和察氏培养基等。
4.按照培养基用途分
培养基按其特殊用途可分为加富培养基、选择性培养基和鉴别培养基。
(1)加富培养基。
是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液,用以培养要求比较苛刻的某些微生物。
(2)选择性培养基。
是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。
利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。
(3)鉴别培养基。
是在培养基中加入某种试剂或化学药品,使培养后会发生某种变化,从而区别不同类型的微生物。
3发酵过称的参数及其检测分析。
参数可分为四类:
物理参数、化学参数、生物参数和间接参数。
物理参数检测
物理参数:
主要有温度、生物热、搅拌速度和搅拌功率、通气量、罐压、发酵液粘度、消沫剂和发酵液计量等。
1、温度测量
温度除了影响微生物的生长繁殖、生物合成外,还直接影响溶解氧浓度。
因此必须控制发酵温度。
热量测量的意义:
给出有关菌体复杂代谢作用过程的线索;
并可用热力学原理来观察生物热的变化,得出生长周期中不同时期这些因素的规律。
化学参数检测
化学参数主要包括:
pH值、溶解氧浓度、二氧化碳浓度、细胞浓度、基质浓度、产物浓度等。
1.pH的测量
微生物的生命活动对环境pH的影响主要有两种方式:
其一是酸性或碱性代谢物的形成使培养液的pH发生变化;
其二是菌体对培养基质中生理酸性和生理碱性物质的利用使pH发生变化。
对于因菌体代谢所引起的pH变化,如果不加控制的话,必然要干扰微生物反应的正常进行,所以pH的测量与控制在发酵过程中是很重要的
4影响离子交换选择性的因素。
影响离子交换选择性的因素:
⑴水合离子半径:
半径越小,亲和力越大;
⑵离子化合价:
高价离子易于被吸附;
⑶溶液PH:
影响交换基团和交换离子的解离程度,但不影响交换容量;
⑷离子强度:
越低越好;
⑸有机溶剂:
不利于吸附;
⑹交联度、膨胀度、分子筛:
交联度大,膨胀度小,筛分能力增大;
交联度小,膨胀度大,吸附量减少;
⑺树脂与粒子间的辅助力:
除静电力以外,还有氢键和范德华力等辅助力。
5解释直接沉淀和间接沉淀法。
直接沉淀法是制备超细微粒广泛采用的一种方法,其原理是在金属盐溶液中加入沉淀剂,在一定条件下生成沉淀析出,沉淀经洗涤、热分解等处理工艺后得到超细产物。
不同的沉淀剂可以得到不同的沉淀产物,常见的沉淀剂为:
NH3•H2O、NaOH、(NH4)2CO3、Na2CO3、(NH4)2C2O4等。
沉淀法是利用抗生素在一定的PH条件下,与某些金属离子或其他化合物的整个分子结合成难易溶解的盐或复盐沉淀出来,以达到浓缩和提纯的目的。
利用某些抗生素具有两极化合物的性质,使其在等电点时从水溶液中游离而沉淀出来,直接得到成品。
6空消
空罐灭菌又称空消,是指将饱和蒸汽通入未知培养基的发酵罐或种子罐内,进行罐体湿热灭菌的过程。
7次级代谢产物
是微生物代谢产生的,而与菌体生长、繁殖无明确关系的代谢产物,它们的生物合成有种的特异性。
8在工业发酵生产中,一般都选在生命力最旺盛的(),菌体量尚未达到最高峰时移种。
对数生长期
9培养基按生产用途来划分,可以分为3种:
()、()、()。
孢子培养基;
种子培养基;
发酵培养基
10简述温度对于发酵有哪些主要影响。
1、影响反应速率
2、影响发酵方向
3、另外,温度也会影响发酵液的物理性质,通过影响浓度、溶解氧量、氧的传递速率等间接影响微生物代谢产物合成。
温度是把双刃剑,这样来说,提高温度,菌体代谢加快,培养时间缩短。
但是菌体的糖代谢和氮代谢的各种酶类对温度的敏感性是不同的。
温度如果提高到不合适的程度,反而会使菌体易老化,提前透支生命力,这显然对长远的发展是不可行的。
必须严格控制孢子斜面的培养温度,培养温度控制低一些,有利于孢子的形成。
11抗生素的分类。
一、根据微生物来源分类:
1.放线菌产生的抗生素;
2.真菌产生的抗生素;
3.细菌产生的抗生素;
4.动植物产生的抗生素。
二、根据抗生素的作用分类:
1.抗革兰氏阳性菌抗生素;
2.抗革兰氏阴性菌抗生素;
3.抗真菌类抗生素;
4.抗结合分枝杆菌类抗生素;
5.抗癌细胞类抗生素;
6.抗病毒和噬菌体类抗生素;
7.抗原虫类抗生素。
三、根据抗生素的作用机制分类:
1.抑制细胞壁合成的抗生素;
2.影响细胞膜功能的抗生素;
3.抑制核酸合成的抗生素;
4.抑制蛋白质合成的抗生素;
5.抑制生物能作用的抗生素。
12碳氮源种类的确定原则。
快速利用碳氮源、慢速利用碳氮源的种类配比要满足不同微生物,不同生长阶段和生产阶段的需要。
13保证源副材料质量的稳定性原则。
定点采购、定点加工、稳定加工工艺、恒定的贮存条件、再配合预试验来保证大工艺的稳定。
14简述发酵的异常处理。
1.发酵液较稀:
(染噬菌体除外)菌丝溶解快于生长,可补天然丰富氮源,减少油、消泡剂、前体等的补加。
(补种)
2.发酵液过浓:
补水(同时要注意渗透压等变化对生长和生产的影响)。
3.糖耗过慢:
补P,补N源,升温,补种等。
4.pH异常:
污染、补生理酸碱性物质。
15培养基配置与pH之关系原则。
酸性抗生素发酵环境一般呈酸性(低于pH7),中性及碱性抗生素发酵环境一般呈中碱性(pH>
=7)。
因此在配置培养基时,生理酸碱性原料应合理搭配。
16碳氮源比例的确定原则。
斜面便于长孢子,种子利于长菌丝;
发酵前期利于长菌丝,中后期利于合成和积累目标产物。
此外C/N比等应与环境因素结合考虑,为对溶氧条件较好的设备,对通气较足的配置可采用菌丝较浓的C/N比。
对溶氧较差、通气不足的设备可采用菌丝较稀的C/N比。
17碳源
提供微生物生长繁殖所需的能源和构成细胞的碳骨架。
18简述菌种的保藏方法。
1.定期移植保存法
2.液体石蜡封藏法
3.真空冷冻干燥保藏法
4.液氮超低温保藏法
5.沙土管保藏法
6.麦皮保藏法
19医用抗生素应具备的条件。
1.“差异毒力”大;
2.不易产生耐药性;
3.副作用小(如不产生过敏反应);
4.具有较好的理化性能,便于提取、精制、贮藏;
5.在人体内应发挥其抗生效能,并不立即遭体内破坏。
6.给药(注射,口服等)后,很快吸收,并分布到被感染的器官或组织。
20如何正确使用抗生素?
滥用有何影响?
合理使用抗生素。
在有明确指征下选用适宜的抗生素,采用适当的剂量和疗程,达到杀灭致病菌和(或)控制感染的目的。
正确使用抗生素的原则是:
1.用药指征明确。
及早明确病原菌,然后选择合适的抗生素。
2.针对性要强,最好选用一种药物。
3.剂量要足、疗程要够。
这样既保证疗效,也可防治病菌产生耐药或病情反复。
4.掌握既往用药反应。
主要了解以往有无对药物的过敏史。
5.选择适宜的给药方法。
一般的感染性疾病以口服为主,较重者宜肌肉注射给药,严重者可静脉输液。
6.按医嘱用药。
不能随意增量或减量,更不能随便改药或加药。
7.有肝肾功能损坏者用药宜慎重。
有肾功能损害时要慎用氨基糖苷类、多肽类、万古霉毒等药物。
有肝功能损害时应慎用氯霉素、四环素、大环内酯类、利福平、两性霉素B等药物。
8.有下列情况时不宜用抗生素:
①病毒感染;
②发热原因不明;
③对休克、昏迷、心衰或外科手术前后预防感染。
21菌种选育的标准是什么?
遗传性状稳定,易于基因操作,安全性高,发酵周期短且产量高,对所用培养基要求低,代谢产物便于分离的微生物才能做为菌种使用。
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22培养基按来划分,可以分为2种:
()、()。
选择培养基;
鉴别培养基
23培养基按状态来划分,可以分为3种:
固体培养基;
液体培养基;
半固体培养基
24培养基按组分来划分,可以分为两种:
()和()。
合成培养基;
天然培养基
25微生物工程下游加工过程的特点有哪些?
第一个特点:
即起始浓度较低而杂质又较多,最后成品要求达到纯度又较高,因此常需多步纯化操作。
一个包含6步操作的纯化过程,即使每步作都较完善,收率达到90%,总收率也只有53%。
可见,尽量减少提取步骤是相当重要的。
第二个特点:
是欲提取的生物物质通常很不稳定,遇热、极端pH值、有机溶剂会引起失活或分解,特别是蛋白质的生物活性与一些辅因子(cofactor)、金属离子的存在和分子的空间构型有关。
一般认为剪切力(shear)会影响空间构型和使分子降解,对蛋白质的活性影响很大。
最近的研究则表明,当蛋白质分子处于气液交界面上或与膜结合的蛋白质均对剪切力较敏感,而溶解的蛋白质则受影响较小。
第三个特点:
是发酵或培养都是分批操作,且微生物总有一定的变异性,故各批发酵液不尽相同,这就要求下游加工有一定的弹性,特别是对染菌的批号,也要求能处理。
26种子的异常往往表现为:
()、()、()这三方面。
菌种生长发育缓慢或过快;
菌丝结团;
菌丝黏壁
27接种量
移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例称为接种量。
28反胶团
表面活性剂分散于连续有机相中一种自发形成的纳米尺度的聚集体。
29初级代谢产物
是微生物生长繁殖所必须的代谢产物,它们的生源和生物合成过程在各种微生物体内基本相同。
30实消
实罐灭菌又称分批灭菌,是将饱和蒸汽直接通入装有配制好的培养基的发酵设备中进行灭菌的一种方法,简称实消。
31自然选育
自然选育是在生产过程中利用微生物自然突变而进行优良品种的选育。
诱变育种:
诱变育种是指利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群,使其突变率大幅度提高,然后采用简便快速和高效的筛选方法,从中挑选少数符合育种目的的突变株。
32抗生素提取和精制过程中无菌处理的方法。
1、热力灭菌法
2、干热灭菌法
3、湿热灭菌法
4、辐射杀菌法
5、紫外线
6、电离辐射微波
7、滤过除菌法
8、超声波杀菌法
9、干燥与低温抑菌法
10、化学消毒灭菌法
11、环氧乙烷灭菌
菌种→孢子制各→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取及精制→成品包装
33抗生素精制处理过程及方法。
吸附、沉淀、萃取、离子交换、膜法
下面对抗生素精制中可选用的步骤分述如下:
A、脱色和去热原质
脱色和去热原质是精制注射用抗生素中不可缺少的一步。
它关系到成品的色级及热原试验等质量指标。
色素往往是在发酵过程中所产生的代谢产物,它与菌种和发酵条件有关。
热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。
各种杂菌所产生的热原反应有所不同。
革兰氏阴性菌产生的热原反应一般比革兰氏阳性菌的为强。
热原注入体内引起恶寒高热,严重的引起休克。
它是多糖磷类脂质和蛋白质的结合体,为大分子有机物质,能溶于水。
在280℃加热4h它能被破坏90%;
180—200℃加热半小时或150℃加热2h能被彻底破坏。
它亦能被强酸、强碱、氧化剂(如高锰酸酸钾)等破坏。
它能通过一般滤器,但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。
生产中常用活性炭脱色去除热原,但须注意脱色时pH,温度、炭用量及脱色时间等因素,还应考虑它对抗生素的吸附问题,否则能影此外,也可用脱色树脂去除色素(如酚醛树指,即122树脂)。
对某些产品可用超微过滤办法去除热源,此外还应加强在生产过程中的环境卫生以防止热原。
响收率。
B、结品和重结晶
抗生素精制常用此法来制得高纯度成品。
常用的几种结晶方法如下:
(1)改变温度结晶利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度变化而显著变化的这一特性来进行结晶。
例如制霉菌素的浓缩液在5℃条件下保持4—6h后即结晶完全。
分离掉母液、洗涤、干燥、磨粉后即得到制霉菌素成品。
(2)利用等电点结晶当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时,它在水溶液中溶解度最小,则沉淀析出。
如6—氨基青霉烷酸(6—APA.水溶液当PH调至等电点(4.3)时,6-APA即从水溶液中沉淀析出。
(3)加成盐剂结晶在抗生素溶液中加成盐剂(酸、碱或盐类)使抗生素以盐的形式从溶液中沉淀结品。
例如在青霉素G或头孢菌素C的浓缩浓中加入醋酸钾、即生成钾盐析出。
(4)加入不同溶剂结晶利用抗生素在不同溶剂中溶解度大小的不同,在抗生素某一溶剂的溶液中加入另一溶剂使抗生素析出。
如巴龙霉素具有易溶于水而不溶于乙醇的性质。
在其浓缩液中加入10—12倍体积的95%乙醇,并调PH至7.2—7.3使其结晶析出。
重结晶是进一步精制以获高纯度抗生素的有效方法.
C、其他精制方法包括:
(1)共沸蒸馏法如青霉素可用丁醇或醋酸丁酯以共沸蒸馏进行精制。
(2)柱层析法如丝裂霉素A、B、C三种组分可以通过氧化铝层析来分离。
(3)盐析法如在头孢噻吩水溶液中加入氯化钠使其饱和,其粗晶即被析出后进一步精制。
(4)中间盐转移法如四环素碱与尿素能形成复盐沉淀后再将其分解,使四环素碱析出。
用此独以除去4-差向四环素等异物,以提高四环素质量和纯度,又如红霉素能与草酸或乳酸盐或复盐沉淀等。
(5)分子筛如青霉素粗品中常含聚合物等高分子杂质,可用葡聚糖凝胶G—25(粒度20—80μm)将杂质分离掉。
此法仅用于小试验。
34形成过饱和溶液的方法。
(1)热饱和溶液冷却(等溶剂结晶)适用于溶解度随温度升高而增加的体系;
同时,溶解度随温度变化的幅度要适中;
(2)部分溶剂蒸发法(等温结晶法)适用于溶解度随温度降低变化不大的体系,或随温度升高溶解度降低的体系;
(3)真空蒸发冷却法使溶剂在真空下迅速蒸发,并结合绝热冷却,是结合冷却和部分溶剂蒸发两种方法的一种结晶方法。
(4)化学反应结晶加入反应剂产生新物质,当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时,即有晶体析出
35离子交换树脂方法的原理优缺点。
离子交换树脂可分为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂和两性离子交换树脂。
优点:
1、无机离子的去除能力优良;
2、具再生能力;
3、装置简单。
缺点:
1、纯化(交换)容量有一定的限制,水质会发生起伏;
2、树脂会造成有机物的溶出;
3、树脂表面会有微生物的增殖;
4、树脂的崩解碎片会造成水中微粒的增加;
5、树脂的再生过程比较麻烦;
6、树脂再生时会产生药品(强酸、强碱)的废液污染离子交换树脂的工作原理在离子交换过程中,水中的阳离子(如Na+、Ca2+、K+、Mg2+、Fe3+等)与阳离子交换树脂上的H+进行交换,水中阳离子被转移到树脂上,而树脂上的H+交换到水中。
水中的阴离子(如Cl-、HCO3-等)与阴离子交换树脂上的OH-进行交换,水中阴离子被转移到树脂上,而树脂上的OH-交换到水中。
而H+与OH-相结合生成水,从而达到脱盐的目的
36微生物的初级与次级代谢产物的调节方法。
微生物在长期的进化过程中,形成了一整套完善的代谢调节系统,以保证各种代谢活动经济而高效地进行。
微生物的代谢调节主要有两种方式:
酶合成的调节和酶活性的调节。
酶合成的调节:
微生物细胞内的酶可以分为组成酶和诱导酶两类。
组成酶时微生物细胞内一直存在的酶,它们的合成只受遗传物质的控制,而诱导酶则时在环境中存在某种物质的情况下才能够合成的酶。
例如,在用葡萄糖和乳糖作碳源的培养基本上培养大肠杆菌,开始时,大肠杆菌只能利用葡萄糖而不能利用乳糖,只有当葡萄糖被消耗完毕以后,大肠杆菌才开始利用乳糖。
酶活性的调节:
微生物还能够通过改变已有酶的催化活性来调节代谢的速率。
酶活性发生主要原因时,代谢过程中产生的物质与酶结合,致使酶的结构产生变化。
这种调节现象在核苷酸、维生素的合成代谢中十分普遍。
总结上述两种调节方式时同时存在,并且密切配合、协调作用的。
通过对代谢的调节,微生物细胞内一般不会累积大量的代谢产物。
但在工业生产中,人们总希望微生物能够最大限度地积累对人类有用的代谢产物,这就需要对微生物代谢的调节进行人工控制。
37抗生素工艺中的四种发酵类型
微生物发酵培养过程方法主要有分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。
1、分批发酵
营养物和菌种一次加入进行培养直到结束放罐中间除了空气进入和尾气排出与外部没有物料交换。
2、连续发酵
是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基同时以相同的速度流出培养液从而使发酵罐内的液量维持恒定微生物在稳定状态下生长。
可以有效地延长分批培养中的对数期。
3、补料分批发酵又称半连续发酵
是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术是指在微生物分批发酵中以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。
可以使培养液中的营养物浓度较长时间地保持在一定范围内既保证微生物的生长需要又不造成不利影响从而达到提高产率的目的。
38发酵过程的种类。
发酵的种类很多。
根据培养基的物理状态,可分为固体发酵和液体发酵;
根据所生成的产物,可分为抗生素发酵、维生素发酵和氨基酸发酵等;
根据发酵过程对氧的需求情况,可分为厌氧发酵(如酒精发酵、乳酸发酵)和需氧发酵(如抗生素发酵、氨基酸发酵)。
39简述发酵染菌的原因及防治措施。
造成发酵染菌的原因有很多,且常因工厂不同而有所不同,但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。
一、种子带菌及其防治:
1、保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌、种子培养所涉及的设备和装置染菌。
2、严格控制无菌室的污染,根据生产工艺的要求和特点,建立相应的无菌室,交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理;
在制备种子时对砂土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理,防止杂菌的进入而受到污染。
为了防止染菌,种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度,且有一定的长度,保存温度尽量保持相对稳定,不宜有太大变化;
对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查,确保任何一级种子均未受杂菌污染后才能使用;
对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理,保证在利用灭菌锅进行灭菌前,先完全排除锅内的空气,以免造成假压,使灭菌的温度达不到预定值,造成灭菌不彻底而使种子染菌。
二、空气带菌及其防治
要杜绝无菌空气带菌,就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
1、加强生产环境的卫生管理,减少生产环境中空气的含菌量,正确选择采气口,如提高采气口的位置或前置粗过滤器,加强空气压缩前的预处理,如提高空压机进口空气的洁净度。
2、设计合理的空气预处理工艺,尽可能减少生产环境中空气带油、水量,提高进入过滤器的空气温度,降低空气的相对湿度,保持过滤介质的干燥状态,防止空气冷却器漏水,防止冷却水进入空气系统等。
3、设计和安装合理的空气过滤器,防止过滤器失效。
选用除菌效率高的过滤介质,在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路,避免过滤介质烤焦或着火,防止过滤介质的装填不均而使空气走短路,保证一定的介质充填密度。
当突然停止进空气时,要防止发酵液倒流入空气过滤器,在操作中要防止空气压力的剧变和流速的急增。
三、操作失误导致染菌及其防治
1、通常对于淀粉质培养基地灭菌采用实罐灭菌较好,一般在升温前先通过搅拌混合均匀,并加入一定量的淀粉酶进行液化;
有大颗粒存在时应先经过筛除去,再行灭菌;
对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基,采用罐外预先配料,再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。
2、在灭菌升温时,要打开排气阀门,使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气,一般可避免“假压”造成染菌。
3、要严防泡沫升顶,尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。
4、避免蒸汽压力的波动过
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