原人参二醇空心金纳米药物载体的制备及体外抗喉癌研究Word文档格式.docx
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在各种纳米药物系统中,含有高Z元素(金,银,碘,钆等)的各种纳米材料作为药物运输载体[9~11]引起研究者的广泛关注。
金纳米颗粒(AuNPs)由于其良好的生物相容性、生物惰性、高原子序数、易于合成和表面修饰等,在纳米药物系统中表现出明显的优势,是药物运输载体的优良材料[12~20]。
You等[21]将DOX负载到PEG修饰的空心金纳米颗粒上,考察该药物传递系统(DOX@PEG-HAuNS)的光热治疗-化疗的联合治疗效果,结果表明,相比于游离DOX和DOX脂质体,DOX@PEG-HAuNS具有更强的抗肿瘤活性和更低的心脏毒性。
基于空心纳米金颗粒的独特性质,本研究将空心金纳米颗粒用于小分子PPD的负载输送。
将具有空心结构、体积大、外壳薄而坚固等优点的空心金纳米颗粒和PPD结合起来,构建了一种新型PPD给药系统;
PPD经过空心金纳米颗粒的负载,提高了药物的水溶性及生物利用度,更利于肿瘤的治疗。
将PEG分子修饰到空心金纳米颗粒表面,提高了纳米材料的生物相容性;
空心金纳米颗粒负载PPD,起到了缓释作用,使得PPD的药效更加持久。
本研究还考察了其体外抗喉癌细胞的作用。
2实验部分
2.1仪器与试剂
FEITecnaiG2F20S-Twin透射电子显微镜(美国FEI公司);
X'
PertProX射线衍射仪(荷兰帕纳科公司);
VertexPerkine-Elmer580BIR傅立叶变换红外光谱仪(美国瓦里安公司);
PromineneceUFLC高效液相色谱仪(日本岛津公司);
U-3310紫外可见近红外光谱(HPLC)仪(日本日立公司);
M630多功能酶标仪(美国Hercules公司);
FACSCan流式细胞仪(美国BectonDickinson公司);
MCO-20AICCO2培养箱(中国Sanyo公司)。
氯金酸(分析纯,上海萨恩化学技术有限公司);
CoCl2?
6H2O、柠檬酸三钠和NaBH4(分析纯,北京化学有限公司);
PEG-SH(美国Nanocs公司);
Hep-2细胞株(中国科学院上海生命科学研究院);
PPD(纯度>
99%,吉林大学有机化学实验室合成);
RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司);
二甲亚砜(DMSO)、青霉素和链霉素(上海鼎国生物技术有限公司);
MTT(美?
?
Sigma公司);
TUNEL凋亡检测试剂盒(瑞士罗氏公司)。
实验用水为Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)制备的超纯水(18.2MΩ?
cm)。
2.2空心金纳米颗粒(HAuNs)的合成
参照文献[22]的方法合成空心金纳米颗粒(HAuNs)。
首先制备钴纳米颗粒,将氯化钴溶液(0.1mL,0.4mol/L)加入到含有新制备的硼氢化钠溶液(0.1mL,1mol/L)和柠檬酸钠溶液(0.4mL,0.1mol/L)中,混合溶液在氮气氛下反应60min。
将上述制备的无硼氢化钠的钴纳米颗粒溶液(30mL)注入脱氧氯金酸溶液(10mL,1μmol/L)中,在氮气氛下反应10min后,将溶液暴露于空气中至钴完全氧化。
以10000r/min离心,收集沉淀,用超纯水洗涤3次。
2.3HAuNs-PEG的合成
通过配体交换法制备HAuNs-PEG[23]。
将合成的HAuNs分散在去离子水中(1.0mg/mL),将150mgPEG-SH加入到40mL上述水溶液中,在室温下搅拌过夜。
反应结束后,用超纯水洗涤产物3次,除去未反应的PEG,产物分散在40mL乙醇中。
2.4PPD的负载和体外药物释放
将40mL1.0mg/mLPPD乙醇溶液加入到40mL1.0mg/mLHAuNs-PEG的乙醇溶液中,在37℃下搅拌24h。
离心,沉淀用乙醇洗涤3次。
合并上清液,通过检测上清液中PPD减少的重量(m)计算PPD的实际负载量,负载率LE(%)=[(初始mPPD-上清液中的mPPD)/mHAuNs-PEG]×
100%,测得PPD负载率为30%。
色谱条件:
CORTECSC18色谱柱(100mm×
4.6mm,2.7μm);
流动相A为0.1%冰醋酸,流动相B为乙腈,以A∶B=20∶80(V/V)等度洗脱;
流速0.5mL/min,室温分离;
进样量:
10μL;
线性关系考察:
精密称取PPD,用乙醇定容至10mL,用流动相分别稀释成5、10、25、40、100和200μg/mL系列浓度,4℃保存备用。
进样量10μL,测定峰面积,以PPD的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程;
待测样品的制备:
将500μL的HAuNs-PEG-PPD复合药物加入4mL的1640培养基中,置于37℃、5%(V/V)CO2培养箱中,分别于30、60、120、180和240min各取100μL上清液,于4℃保存,待测。
数据处理:
将峰面积带入回归方程,得出药物的剂量,以500μL复合药物中PPD的量为100%,计算出药物随时间变化的PDD释放率。
2.5实验分组和体外细胞培养
空白对照组、HAuNs组、PPD组、HAuNs-PEG-PPD组(药物暴露时以PPD、HAuNs-PEG-PPD浓度、以及相应负载浓度单纯HAuNs计量为统一浓度单位)Hep-2细胞,采用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清,100IU/mL青霉素,链霉素100mg/mL),在37℃、5%(V/V)CO2培养箱中培养。
2.6细胞毒性实验
将PPD溶于无水乙醇中制备成64mmol/L溶液。
将细胞接种于96孔板中(0.3×
104细胞/孔),培养过夜,然后将其暴露于不同浓度的HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD(2.30、4.61、9.21、18.43和36.87μg/mL)24h后,将20μLMTT(0.5mg/mL)加入到96孔板和细胞继续培养4h。
然后弃MTT与培养基混合液,每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,用酶标仪在490nm处测各孔吸光度。
计算细胞增殖抑制率(Inhibitoryrate,IR),IR=[1-(用?
组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×
100%。
2.7流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡
将Hep-2细胞接种于六孔板中(2×
105细胞/孔),并分别暴露于HAuNs-PEG-PPD(IC50)、HAuNs(联合组IC50所对应Au浓度)、PPD(联合组IC50所对应PPD浓度)和空白对照组。
培养24h后,收集培养液,并用不含EDTA的胰酶消化细胞后,1000r/min离心5min,弃上清液。
再用1mL在4℃预冷的PBS洗涤细胞两次。
将400μL1×
AnnexinV结合液悬浮细胞,浓度为1×
106cells/mL。
在细胞悬浮液中加入5μLAnnexinV-FITC染色液,混匀后于2~8℃避光条件下孵育5min,然后采用流式细胞仪分析。
3结果与讨论
3.1空心金纳米颗粒的结构与表征。
HAuNs和HAuNs-PEG透射电子显微镜(TEM)图如图1所示。
HAuNs的平均直径约为50nm,平均金壳厚度约为8nm(图1A),可以清楚地看出空心金纳米颗粒壳表面上的PEG层(图1B)。
Au的标准数据如图2所示,结果表明,合成的HAuNs结晶性良好。
FT-IR光谱图如图3所示。
图3A中,3424cm1处的宽带归属于样品中吸收的H2O的H振动和PEG中的OH伸缩振动,1384和1559cm1处的峰由于在制备过程中加入Cit3离子而归属于(CO)拉伸模式[24]。
在图3B中,1665和1047cm1峰分别归属于酯基中的CO伸缩振动和PEG中的CH伸缩振动。
如图3C所示,加载PPD后,可以观察到PPD在2922和2868cm1处的特征峰值,分别归属于甲基中的CH伸缩振动和亚甲基的CH伸缩振动。
上述结果表明PEG的成功修饰和PPD的加载。
3.2HPLC检测HAuNs-PEG-PPD的缓释性
药物释放体系的研究与应用对临床治疗有着重要意义。
本研究将PPD与空心金纳米颗粒共价连接,制备HAuNs-PEG-PPD,构筑了一种靶向Hep-2细胞的药物控释体系,采用高效液相色谱检测HAuNs-PEG-PPD在体外随时间的释放率。
在所建立的色谱条件下,PPD的浓度(x)在5~200μg/L之间与峰面积(y)呈良好的线性关系,线性回归方程为y=36696x-14104(R2=0.9996)。
如图4所示,初期0~0.5h,药物快速释放,释放量占总量的60%,这段区间释放出来的药物主要是吸附在纳米粒表面的药物;
0.5~4h,释放速率有所减慢,药物释放量约占40%,这是因为药物从纳米粒内部释放出来,释放速率比较缓慢。
这说明了药物负载于空心纳米粒载体时,既可分布在载体的孔道和空腔内部,也可存在于载体的外部表面区域。
同时也说明本研究所制备的HAuNs-PEG-PPD具有较好的药物缓释效果,有望作为一种优良的抗肿瘤药物。
3.3细胞体外暗场散射成像
为了验证体外细胞中HAuNs-PEG的分布和细胞对HAuNs-PEG吞噬,测量了不同时间HAuNs-PEG纳米复合材料孵育的Hep-2细胞的暗场散射图像(图5)。
如图5H所示,不添加HAuNs-PEG纳米复合材料的Hep-2细胞在暗场中呈现灰色。
用HAuNs-PEG纳米复合材料(图5E~5F)培育后,Hep-2细胞的暗场散射图像由于其在红光频率区域的强烈的纵向表面等离子体振荡而显示散射橙光[25],散射光的强度随着孵育时间的延长而增强。
这些结果提示了纳米复合材料通过非特异性内吞途径[26]而进入细胞的过程比较缓慢。
3.4HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞生长的抑制作用
研究证实,PPD对肝癌细胞HepG2有一定的细胞毒性作用[27],适量浓度的PPD对Hep-2细胞的生长有一定抑制作用[28]。
低剂量的PPD可提高细胞存活率,保护细胞,而高剂量的PPD可抑制细胞增殖[29]。
本研究采用MTT法检测不同浓度的HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞生长的抑制作用。
如图6所示,在共培养24h后,PPD、HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞的抑制作用均呈剂量依赖性,低剂量PPD(≤4.61μg/mL)对Hep-2细胞无明显抑制作用,而低剂量HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞具有明显的抑制作用。
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