甘油含量测定Word格式.docx
- 文档编号:17810316
- 上传时间:2022-12-10
- 格式:DOCX
- 页数:17
- 大小:30.97KB
甘油含量测定Word格式.docx
《甘油含量测定Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《甘油含量测定Word格式.docx(17页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
414
433)
30次检测
1.
简介
酶法分析试剂盒(紫外分光光度法)此法适用于检测食品(啤酒、葡萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒)、化妆品、药品(溶液、栓剂)、纸板、烟草及生物制品中的甘油。
2.
原理
甘油在甘油激酶的催化下可被ATP磷酸化为3-磷酸甘油酯,ATP转化为ADP;
反应式为
GK
Glycerol﹢ATP
L-glycerol-3-phosphate﹢ADP
上式中形成的ADP在丙酮酸激酶的催化下可与PEP作用下生成ATP及丙酮酸酯;
PK
ADP﹢PEP
ATP﹢Pyruvate
丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯,NADH被氧化为NAD;
L-LDH
Pyruvate﹢NADH﹢H﹢
L-lactate﹢NAD﹢
被氧化的NADH的量取决于甘油的量,NADH的吸光度值可在334,340及365nm下测量。
3.
试剂盒内容物
----瓶1共有3瓶,每瓶约有2g辅酶及缓冲液的混和物,包括:
甘氨酰甘氨酸缓冲液,
PH约7.4;
NADH约7mg;
ATP约22mg;
PEP-CHA约11mg;
硫酸镁
----瓶2约0.4ml悬浮物,包括:
丙酮酸激酶,约240U;
L-乳酸酯脱氢酶,约220U
----瓶3约0.4ml甘油激酶悬浮物,约34U
----瓶4为甘油检测对照溶液(甘油检测对照溶液可不需要计算结果),此溶液使用时不需稀释。
(效期见标签)
4.
检测溶液的制备
(10次)
----取出1瓶瓶1,
用11ml重蒸水溶解,使用时此溶液需在20-25℃持续回温约10分钟
----瓶
2不需稀释
3不需稀释
5.
操作者应该注意之事项
使用前请仔细阅读,中文翻译件仅供参考
----瓶1约含500mg碳酸钠,应避免接触皮肤和呼吸器官,其他用于甘油检测的试剂不具有危险性
----实验之后,用过的试剂可作为实验室废料处理,但必须在当地法规允许的前提下
6.
储存条件
1在2-8℃下保存(见标签),溶液1在2-8℃下可保存4天,溶液1使用前需回温至20-25℃
----瓶2及3在2-8℃下保存(见标签)
7.
样品处理
----直接取用无色,透明,中性的溶液或按稀释表格稀释后进行检测,体积为2.000ml
----过滤混浊溶液
----除去样品溶液中的二氧化碳气体
----加入氢氧化钠或氢氧化钾来调节酸溶液的PH值约为8
----对于深颜色的样品溶液可不需稀释或者用PVPP或酰胺配成较高浓度的溶液如:
1g/100ml
----粉碎或均质固体和半固体样品,用水抽提或溶解,而后过滤,通过Carrez澄清液可脱去其中的混浊物或色素
----用Carrez试剂可脱去样品中的蛋白质
----用热水抽提样品中的脂肪(抽提温度需在脂肪的溶解度之上),冷却后可分离出脂肪,将余下物质转移至容量瓶中并加水至刻度,冰浴15分钟而后过滤,热水抽提后用Carrez溶液澄清
8.
过程
波长:
340nm,Hg365nm或Hg334nm
比色杯:
光径1.0cm
温度:
20-25℃
最终体积:
3.020ml
对照空气(光路上无比色杯)或对照水读取读数
样品溶液:
1-40ug甘油/检测(体积为0.100-2.000ml样品体积)
具体操作见如下表格
移液空白(ml)样品(ml)
溶液1
样品溶液
重蒸水
悬浮物21.000
-
2.000
0.0101.000
0.100
1.900
0.010
混和,直至前反应完全反应后,约5-7分钟,读取吸光度值A1,而后加入下列物质:
悬浮物30.0100.010
混和,等反应进行完全后(约5-10分钟),立即读取样品和空白的吸光度值A2
如果在15分钟后反应尚未停止,则在2分钟的间隔内继续读取读数,直至此值不再变化。
分别测样品与空白的吸光度值差,而后用样品吸光度值差减去空白吸光度值差可以得到如下公式
△A=(A1
―A2)Sample―(A1
―A2)blank
若想得到一个足够精确的结果,则测得的吸光度的单位至少为0.100单位。
如果吸光度值差△A在334及340nm下测得的值高于1.000或在365nm下测得的值高于0.500,如此则表明样品溶液中甘油的浓度较高。
需根据稀释表格进行样品的稀释
9.
计算
根据以下公式计算浓度
V×
MW
C=-----------------------×
△A(g/l)
ε×
d×
v×
1000
V=最终体积(ml)
V=样品体积(ml)
MW=被检测物质的摩尔质量
D=光径(cm)
ε=NADH的消光系数
340nm=6.3(1×
mmol-1×
cm-1)
Hg365nm=3.4(1×
Hg334nm=6.18(1×
甘油含量计算遵循如下公式
3.020×
92.1
C=----------------------------×
△A
1.00×
0.100×
2.781
=----------------×
△A(g甘油/l样品溶液)
ε
如果样品溶液是稀释使用的,在计算结果时需乘以稀释系数F。
当分析固体或半固体时,测量前需称一定重量配制样品溶液,其结果需按下式计算
C
甘油(g/l样品溶液)
C甘油
=--------------------------×
100(g/100g)
W
甘油(在样品溶液中)
10.
检测操作说明
被检样品中甘油含量在1ug至40ug之间。
为了得到一个足够的吸光度值差,样品溶液的浓度最好稀释在0.04g/L至0.4g/L之间。
稀释表格
每升样品溶液中甘油估计量用水稀释稀释倍数
﹤0.4g
0.4-4g
4.0-40g
﹥40g-
1﹢9
1﹢99
1﹢9991
10
100
如果测得的吸光度值△A较低,例如低于0.100,则样品溶液需重新配制,可由下列几种解决方法
可多称出些样品或不要过分稀释。
加入到比色杯中的溶液体积可增加至2.000ml,当然为了得到相同的最终体积(样品和空白),加入的水的体积就要相应减少。
所加入的新溶液的体积在计算时是要考虑进去的。
11.
技术信息
加入悬浮物2(PK/L-LDH)后等待前反应进行完全后是非常必要的。
12.
特性
此法特异性适于甘油的检测。
13.
灵敏度和检测限
最小的吸光分辨率为0.005个吸光单位,相应的最大样品体积为2.000ml,340nm下测量,则样品的甘油浓度为0.1mg/L;
若样品体积为0.100ml,则样品的甘油浓度为2mg/L。
340nm下,吸光度值差为0.020可导出检测限为0.4mg/L,相应的最大体积为2.000ml。
14.
线性
从1ug甘油/检品(0.4mg甘油
/L样品溶液,样品溶液V=2.000ml)到40ug甘油/检品(0.4g甘油/L样品溶液,样品V=0.100ml)
15.
精确性
用同一样品溶液做平行测定时,其吸光度值差会有0.005至0.010的差异,样品体积为0.100ml,340nm下测量,相应的甘油浓度约为2-5mg/L;
若样品是经过稀释的,则在计算结果时需乘以稀释倍数。
16.
干扰\\信息来源
ATP和PEP的缓慢水解同NADH的缓慢氧化均可导致缓慢的蠕变反应;
空白和样品的吸光度值可不必逐一立即检测。
17.
检测过程中的干扰
根据过程中所给定的时间甘油若能转化完全,则可断定没有干扰发生。
反应结束后,可加入一些甘油重新检测(定性或定量):
如果加入标准物质后,吸光度值会随之改变,则可断定没有干扰发生。
操作过程中的错误和干扰可通过两个样品体积的平行实验测得(如0.100ml和0.200ml):
测得的吸光度值差应与样品体积成比例关系。
当测定固体样品时,可称取不同质量(如1g和2g)于同一100ml容量瓶中,测得的吸光度值差及样品的质量应与样品的体积成比例关系。
样品所含物质带来的可能干扰可通过加入内标来控制:
除去样品、空白及标准的检测外,样品加检测对照溶液也要检测的,测得的吸光度值差可计算干扰。
通过回收试验可测定可能的损失:
分别测定加入标准与不加入标准的样品,在误差范围之内可定量测定附加物。
18.
Carrez试剂的澄清作用
----移取液体样品于盛有60ml重蒸水的100ml容量瓶中或称取足够重量的样品于100ml容量瓶中
----加入60ml重蒸水
----仔细加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液(85mM,3.60gK4Fe(CN)6*3H2O/100ml)和5ml
Carrez-Ⅱ-溶液(250mM,7.20gZNSO4*7H2O/100ml)
----用氢氧化钠调节溶液PH于7.5-8.5,加入每一溶液后需充分混和,加水至容量瓶刻度,混和并过滤
19.
应用举例
1.果汁中甘油的检测
----稀释样品其浓度约在0.4g/L以下(见稀释表格)
----过滤混浊果汁,取用透明或淡色溶液用于检测
当分析深色果汁时(如:
草莓汁和红葡萄汁)需要先脱色
具体操作
----在10ml果汁中加入0.1g酰胺粉末或PVPP
----搅拌1分钟后过滤
----取透明溶液用于检测,该溶液可带有轻微颜色
2.酒中甘油的检测
----根据稀释表格将样品进行稀释
----实际上红酒不需脱色也可进行检测
3.啤酒中甘油的检测
----取5-10ml啤酒用玻璃棒搅拌约1分钟,除去其中的二氧化碳气体
----根据稀释表格稀释脱去二氧化碳气体后的样品
4.烟草制品中甘油的检测
----充分混合并绞碎样品
----精确称取1g样品于100ml容量瓶中
----加入约70mL水磁力搅拌约1小时20-25℃下,而后加水至刻度,混和并过滤
----移取25ml滤液于50ml容量瓶中
----加入5mlCarrez-Ⅰ-溶液,5ml
Carrez-Ⅱ-溶液及10ml氢氧化钠溶液,在加入每一溶液后均需充人混和
----加水至刻度混和并过滤,取滤液用于检(0.100ml-0.500ml)
5.化妆品中甘油的检测
6.发酵产品及生物培养基中甘油的检测
----置样品(可先经过离心)于80℃水浴中15分钟以停止酶的反应
----离心并取上层溶液(可根据稀释表格稀释)用于检测
----另外可用高氯酸或Carrez溶液脱除蛋白质
琼脂培养基需先均质,而后按以上方法进行操作。
名称:
甘油检测试剂盒
编号:
EK-GCROL
货号:
100001001
CasNo:
70
购买:
GlycerolAssayKit
(70次测定)
简介:
甘油是一种非常重要的物质,广泛的应用于工业生产中,在食品工业中,常被作为保湿剂、增香剂和增色剂等使用,以改良食品的质量。
甘油是酿酒酵母发酵过程中的副产物,也是灰质葡萄孢新陈代谢过程中的一个重要产物,甘油是高品质果酒的一个成分,高品质的葡萄汁中不含有(或只含有痕量或微量)甘油,浓度大约为1%(v/v),若葡萄汁中含有甘油则意味着产品中使用了品质不好的原料。
甘油也常常作为润滑剂用在洗涤液、乳酪和牙膏中,在制烟工业中,通过通常是预先向烟叶上喷洒甘油以保障不会粉碎的目的。
原理:
甘油在甘油激酶(GK)的作用下被磷酸化,消耗ATP转化成L-3磷酸甘油(L-glycerol-3-phosphate)。
(1)Glycerol+ATP(GK)L-glycerol-3-phosphate+ADP
上式中形成的ADP在丙酮酸激酶(PK)的催化下可与PEP作用,生成ATP及丙酮酸酯
(2)ADP+PEP(PK)ATP+pyruvate
丙酮酸酯在L-乳酸酯脱氢酶(L-LDH)的作用下可被NADH还原为L-乳酸酯,NADH被氧化为NAD
(3)Pyruvate+NADH+H+(L-LDH)L-lactate+NAD+
被氧化的NADH的量取决于甘油的量,NADH的吸光度值可在340下测量。
特异性,灵敏度,测量范围和精确度:
该实验方法是专门用于测定甘油含量的,对于纯甘油(水中的游离甘油)几乎可以100%检测到。
最小可调吸光光度为0.010个吸光单位,样品体积为2.00mL,若在340nm下检测,此时的甘油浓度为0.171mg/L。
如果最小可调吸光光度为0.020吸光光度,样品体积为2.00mL,在340nm下检测,此时的甘油检测线为0.342mg/L。
该实验的测量范围为0.8ug-35ug甘油,同一样品分别进行两次测定,其吸光度值会有0.005-0.010吸光单位的变化,对于样品体积为2.00mL,此时的甘油浓度大约在0.086-0.171mg/L之间,如果样品是经过稀释的,在计算结果时候需要乘以相应的稀释系数(F),如果在样品制备阶段,样品的重量是被称量的,如:
10g/L,0.02-0.05g/100g的细微差别能够被分辨。
干扰:
如果甘油在试验规定的时间内(大约5分钟)完成转化过程,通常认为没有干扰发生,然而,通过向已完成反应的试管中添加甘油(0.1mL中添加20ug),进一步的实验表明,吸光度值还会进一步降低。
利用附带的内部的标准质控可以对干扰物质进行鉴定。
定量回收试验:
通过向样品中添加标准质控,计算样品在处理和提取时的损失。
如:
在最初的提取步骤时添加一定量的甘油。
安全性:
甘油测定所使用的试剂没有有毒物质。
然而浓缩缓冲液中含有作为防腐剂用的叠氮化钠(0.02%w/v),需要按照实验室安全操作规程进行试验。
试剂盒:
Megazyme甘油含量测定试剂盒可以进行70次的测定试验,并提供有全部的试验方法:
瓶1:
Tris/HCl缓冲液(30mL,1.0M,pH7.4)+氯化镁(30mM)+叠氮化钠(0.02%w/v)
稳定性&
gt;
2年,4°
C保存。
瓶2:
药片(14个)含有NADH+ATP+PEP
瓶3:
丙酮酸激酶(600U/mL)+L-乳酸酯脱氢酶(550U/mL)悬浮液1.5mL
瓶4:
甘油激酶悬浮液(1.5mL,85U/mL)
瓶5:
甘油质控标准液(5mL,0.20mg/mL)+0.02%(w/v)叠氮化钠
试剂制备:
1.使用瓶1作为稀释液。
2.1.1mLTris/HCl缓冲液溶解瓶2中1片药片,大约1-2分钟,足够进行5次试验。
一旦药片溶解,NADH吸光度会随着时间的延长而降低,不过溶解的药片保存在4°
C下大约可以使用4天,或保存于-20°
C下大约可以使用4周的时间。
注意:
在打开瓶子前,首先需要将瓶子中的药片恢复到室温,避免潮气可能吸附到药片上,而影响药片的稳定性。
3&
4.准备瓶3和瓶4种的溶液,第一次打开前,需要充分晃动瓶子,不要让酶吸附在橡皮塞上,然后垂直存放好瓶子。
每次使用前还需要充分混合其中的内溶物。
5.准备瓶5溶液。
当您怀疑分光光度计的准确性或怀疑样品中的物质抑制了试验,再使用甘油标准质控溶液进行测定,通过测量NADH的消光系数而计算甘油的浓度。
实验需要的设备:
1.容量瓶(50mL,100mL和500mL).
2.比色杯(1cm,3.0mL).
3.微量移液器
4.连续分配器
5.分析天平
6.分光光度计340nm.
7.漩涡混合器
8.定时钟
9.WhatmanNo.1(9cm)滤纸
操作步骤:
波长:
340nm
比色杯:
1cmlightpath(玻璃或塑料)
温度:
25°
C
最终体积:
2.34mL
样品溶液:
每个比色杯中含有0.8-35ug甘油(存在于0.10-2.0mL样品溶液中)
空白调0:
相对于空气或者水
溶液空白管样品管
蒸馏水(~25°
C)
样品
溶液2(NADH/ATP/PEP/Tris/HCl)
悬浮液3(PK/L-LDH)2.10mL
—
0.20mL
0.02mL2.00mL
0.10mL
0.02mL
混合*,在反应大约4分钟后读取溶液(A1)的吸光度值(前反应完成**),在添加下列试剂后继续进行试验
悬浮液4(GK)0.02mL0.02mL
混合*,在停止反应后(大约5分钟)读取溶液(A2)的吸光度值,如果反应没停止,在间隔2分钟后,再次测量,直到最终的吸光度值不再变化。
*用塑料棒搅拌或用试管塞封闭严实后轻轻颠倒
**必须在等到前反应完成后再添加悬浮液3(PK/L-LDH)
计算:
分别对空白管和样品管两次测得的吸光度值进行相减(A1-A2),这样就获得了ΔAglycerol,按照常规ΔAglycerol的数值至少要在0.100个吸光单位,才能获得满意的试验结果。
甘油的含量可以依照下列公式计算:
C=VxMWx&
#61508;
ΔAglycerol[g/L]
εxdxv
注释:
V=最终体积[mL]
MW=甘油分子量[g/mol]
ε=NADH在340nm下的消光系数
=6300[lxmol-1xcm-1]
d=比色管管径[cm]
v=样品体积[mL]
简化公式:
C=2.34x92.1x&
6300x1x0.10
=0.3421x&
如果样品在制备过程中被稀释了,计算结果还必须乘以稀释系数F。
当被分析的物质为固体或半固体时,甘油含量(g/100g)依照下列公式计算:
甘油含量
=C甘油[g/L样品溶液]x100[g/100g]
样品重量[g/L样品溶液]
使用Mega-CalcTM,该计算方法可以被简化。
制备样品:
1.稀释样品.
比色杯中(如:
分析0.1mL的样品)的甘油总含量必须在0.8-25ug之间,因此样品溶液必须被充分的稀释到浓度在0.008-0.35g/L之间。
估计浓度(g/L)蒸馏水稀释稀释系数F
&
lt;
0.35
0.35-3.5
3.5-35
35不用稀释
1+9
1+99
1+9991
如果ΔAglycerol的数值太低(如&
0.100),可以增加称量的样品量或不要进行过分稀释,也可以增加比色管中的样品量到2.00mL,只要确保样品和蒸馏水的总量在2.10mL即可。
2.净化样品.
a.溶液:
CarrezI溶液:
溶解3.60g亚铁氰化钾{K4[Fe(CN)6].3H2O}(Sigmacat.no.P-9387)到100mL的蒸馏水中,室温保存。
CarrezII溶液:
溶解7.20g硫酸锌(ZnSO4.7H2O)(Sigmacat.no.Z-4750)到100mL的蒸馏水中,室温保存。
氢氧化钠(NaOH,100mM):
溶解4gNaOH到1mL的蒸馏水中,室温保存。
b.步骤:
吸取液体样品到含有大约60mL蒸馏水的100mL容量瓶中,或称取足够量的样品到含有大约60mL蒸馏水的100mL容量瓶中,缓慢的加入5mLCarrezI溶液和10mLNaOH溶液(100mM),然后充分混合,补液至刻度线,混合并过滤。
3.总则.
(a)液体样品:
清澈的或稍有些颜色的,pH大约为中性的液体样品可以直接检测。
(b)酸性样品:
如果样品为&
0.1mL的未被稀释的酸性样品(如葡萄酒或果汁),必须用2MNaOH调节pH到大约7.4,然后在室温中孵育30分钟。
(c)含二氧化碳样品:
样品中含有大量的二氧化碳,如:
啤酒,必须用2MNaOH调节pH到大约7.4,并缓慢的用玻璃棒搅拌。
(d)有颜色的样品:
测试中附加样品空白,如:
样品中不含有GK,在这种情况下,样品必须附加样品空白。
(e)重颜色的样品:
如果未经稀释的样品颜色非常深,需要向每10mL的样品中加入0.2g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP),充分混合5分钟,然后用WhatmanNo.1滤纸过滤。
(f)固体样品:
均质或粉碎固体样品,然后加入到蒸馏水中,并过滤。
(g)样品含有脂肪:
需要用超过脂肪沸点的水进行提取,如:
将100mL容量瓶加热到60°
C,然后恢复至室温,并补液至刻度线,放置冷藏箱中15-30分钟,过滤,弃去最初的几mL滤液,选择澄清的或稍有些乳白色的悬浮液进行测试。
也可以选择使用Carrez溶液进行澄清。
(h)样品中含有蛋白:
使用Carrez溶液去除样品中的蛋白。
样品处理事例:
(a)测定葡萄酒中的甘油.
通常情况下,测定白/红葡萄酒中的甘油含量都不需要对样品进行处理,只需要依照稀释表格进行稀释即可。
按照1:
20倍稀释0.1mL的样品。
(b)
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 甘油 含量 测定