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1.设计实验,认真阅读相关试剂说明书。
2.将离心管置于冰上,按照如下体系加入样品。
加样顺序为:
ddH2O→Buffer/dNTP/引物/模板。
TaqDNA聚合酶反应体系(25μL)
试剂
用量(μL)
ddH2O
18.375μL
Buffer(Mg2+,10×
)
2.5μL
dNTP(2.5mM)
2μL
引物(正向和反向,10μM)
各0.5μL
模板DNA
102~105copies
TaqDNA聚合酶*
0.125μL
*注意:
加酶之前将酶拿出放冰上,使用完立即放回冰箱。
3.在离心管盖上写好每个样品的编号,瞬离。
4.设置好PCR程序,待反应温度达到实验需要时,将样品放入PCR仪,尽量放在中央的孔。
5.将试剂放回原处,移液器调回最大量程,整理实验台。
6.反应结束后,及时停止PCR程序(不要停在4℃太久),取出样品,关好PCR仪。
四、其它注意事项:
1.正确使用移液器、离心机和PCR仪;
2.手或移液器不要接触反应管或试剂瓶、管的内壁、盖内侧;
3.不使用枪头时,盖好枪头盒盖;
4.枪头只能使用一次;
5.合理设计实验,使用适当的阴性对照很重要,如:
使用不加DNA的材料进行PCR扩增,以证明缓冲液或其他试剂中是否存在任何可影响PCR的污染物;
6.如果一次实验需做多管样品,尽量先配制mix,由于存在液体混合后的体积变化和挂液,计算mix用量要比实际管数多一些;
7.反应在PCR仪进行期间,最好能检查一下程序是否在正常运行,及时发现异常。
3.2移液器的使用方法
1.调节量程:
轻轻旋转量程调节圈,注意不要超过量程。
建议从高到低调节量程,必要时,可旋转量程调节圈稍超过所需数值,再向回旋转,移液可以更准确。
2.装配枪头:
轻轻按压,将枪头盒上的枪头装配到移液器。
3.吸液:
按下操作键至一档(设定体积),将枪头垂直浸入液体约4mm;
让操作键慢慢复位,此过程中保持枪头浸入深度,防止吸入空气;
将枪头慢慢移出液面,并确保枪头外壁无残留液体。
(建议每个新枪头先经过一到三次的吸液和放液来润湿,有助于提高移液准确度。
吸取大体积液体时,将枪头保持浸入状态约3秒钟,再移液。
A
B
图3.2.1移液器的吸液(A)和放液(B)
4.放液:
将枪头倾斜地紧贴管壁,将操作键慢慢按向一档(设定体积),等待,直到不再有液体流出;
将操作键按向二档(吹液),将枪头完全排空;
仍然按住操作键,在管壁上擦拭枪头;
在管外,慢慢让操作键复位;
按下脱卸键卸掉枪头。
5.其它注意事项:
(1)轻拿轻放,使用后调回最大量程;
(2)保持移液器洁净。
(3)与水有很大物理性差异的溶液,或在移液器枪头和液体间存在很大温差的溶液,可能会导致移液不准,要注意检查移液体积。
3.3PCR反应原理及过程
3.3.1反应原理
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物,是利用DNA在体外摄氏95°
高温时变性会变成单链,低温(经常是60°
C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合,再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°
C左右),DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'
-3'
)的方向合成互补链(图3.3.1)。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备,能在变性温度,复性温度,延伸温度之间很好地进行控制。
3.5.2反应过程
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成(图3.3.2):
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至95℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
图3.3.1PCR反应原理
图3.3.2PCR的基本步骤
3.4几种常用PCR方法
3.4.1标准PCR(StandardPCR)
该方法适用于扩增小于3000bp的DNA序列。
建议体系:
ReactionVolume100μL
TaqPolymerase2-2.5U
Primers0.1-1.0μMeach
dNTP0.2mMeach
Salt6-50mMKClor(NH4)2SO4
Mg2+1.5-5.0mMMgCl2orMgSO4
BufferTris-HCl10-50mM,pH7.5-9.0
Template102-105copies
3.4.2长范围PCR(LongandAccuratePCR,LAPCR)
使用混合的聚合酶(含有一种能校对的聚合酶)能够增加可扩增产物的大小(5kb~40kb),因为能去掉错误掺入的核苷酸,而不引起链的终止。
ReactionVolume33μL
PolymeraseKlentaq1(a)plus1/16Pfuor1/50DeepVent(byvolume;
1/160or1/500byunits)
Salt16mM(NH4)2SO4,noKCl
Mg2+3.5mMMgCl2
pH9.2
Buffer50mMTris
Template2nglambdaDNA
Cycles20
ExtensionTemp68℃
ExtensionTime11-24min(longeratlatercycles)
3.4.3热启动PCR(HotStartPCR)
热启动PCR是提高产量和特异性的一种简单方法,但也可能会造成重复性和污染等问题。
室温下加样,可能会导致引物和模板的非特异性结合。
在PCR的最初几个循环里,通过变性可以防止这些非特异性结合产物的延伸。
热启动PCR则通过控制一种PCR成分的加样时间,来提高扩增的特异性。
通常,直到反应温度到达引物最适退火温度以上时,再加入这种关键成分,如引物、酶、Mg2+或dNTP。
热启动温度随推迟反应的方式而改变。
推迟PCR反应有几种方式。
最简单的一种是,在反应管达到第一个循环的DNA熔解温度之前,不要将DNA聚合酶加到反应管内。
当处理少量样品时,这种方法可以得到令人满意的效果;
但当处理大量样品时,则效果不佳。
一种更方便的方法是,使一种组分在达到一个适当的温度之前处于无效状态。
例如,把聚合酶或镁盐掺入到蜡珠内便可做到这一点,这些珠子在适当的温度熔化,能够使反应开始。
另一种方法是,在开始时,用一种抗体与聚合酶形成复合物,使聚合酶灭活,在高温下抗体变性,能够使聚合酶发挥功能。
如果在热启动PCR中使用修饰过的酶,则需要向典型的PCR反应中加一预热步骤,预热温度可以在92-100℃之间,时间为2-20分钟,有助于消除在较低温度时引物和模板结合形成的非特异产物。
热启动PCR可以与其它PCR方法(如touchdownPCR)结合使用。
3.4.4温度递降PCR(TouchdownPCR)
TouchdownPCR最初用来简化确定最适退火温度的过程。
最初使用一个高的退火温度(在此温度下,即使正确的结合可能也无法进行),在随后几轮,降低退火温度,当降到某一个温度点时,只有正确匹配的引物-模板能够退火,而不正确的匹配则不能够退火,因此DNA合成能够开始。
尽管后来的循环可能会在不是最严谨的条件下进行,但早期的循环已在最严谨的条件下进行,想要的目标产物将是最丰富的。
通常,第一个循环的退火温度设置为高于理论Tm15℃,在接下来的循环里,每循环降低1-2℃,直到低于Tm5℃左右。
3.4.5嵌套PCR(巢式PCR,NestedPCR)
在这种PCR中,进行两次连续的PCR。
第一次PCR使用常规的模板,然后用第一次PCR反应的产物(通常要稀释适当倍数)作为第二次PCR的模板,将第二次PCR的引物设计成能够与第一次PCR目标产物的序列退火。
虽然第一次PCR除了能产生目标产物外,可能还会产生一些非特异性的产物,但非特异性的产物几乎不可能也包含第二次PCR所用引物的两个位点。
因此,只有第一次PCR的目标产物才可能是第二次PCR的合适模板。
3.5PCR可变因素
PCR的各种因素相互影响,相互制约,很难同时提高PCR的特异性、产量和保真度。
3.5.1引物(Primers)
标准用量:
0.1-1.0μM。
多数情况下,0.2-0.5μM就能满足需要。
提高特异性:
1、降低引物和dNTP的浓度可以显著提高特异性。
高浓度会导致非特异结合、引物二聚体的形成。
2、在适当范围内,降低引物/模板的比例。
提高产量:
提高引物/模板的比例。
如果有过剩的引物,需要降低引物浓度。
3.5.2聚合酶(Polymerases)
1-5Units/μL。
(不同供货商对“Unit”的定义会有差别。
在适当范围内,降低聚合酶浓度。
聚合酶浓度是决定PCR严格度的一个关键因素。
高浓度的聚合酶不仅会降低特异性,还会造成不必要的浪费。
提高保真度:
使用高保真聚合酶。
3.5.3模板(Templates)
102-105个拷贝。
反应中的模板量应当用目的序列的拷贝数来衡量。
一般,降低DNA模板浓度,也应该降低聚合酶浓度(在合适范围内)。
1、增加模板量。
2、降低引物/模板的比例。
1、增加引物/模板比例。
2、扩增较小片段的模板DNA,更易获得较高产量。
3.5.4dNTP(DeoxynucleosideTriphosphates)
20-200μM。
四种dNTP的浓度应当相同,并且要高于每种dNTP的估算Km(10μM-15μM)。
降低dNTP浓度。
需要注意的是,Mg2+的浓度也要等摩尔比例地降低。
对于较长的模板序列,要适当增加dNTP。
3.5.5镁离子(Magnesiumions)
Mg2+浓度应当比总dNTP浓度多0.5-3.0mM。
降低浓度。
注意如果Mg2+浓度不正确会降低产量。
提高浓度。
然而,Mg2+浓度过高易导致非特异性结合和电泳smear。
3.5.6预温育的温度和时间(PreincubationTemperaturesandTimes)
标准范围:
92-96℃,30sec-10min。
预温育能降低样品中有害蛋白酶和核酸酶的活性,还能保证基因组DNA中复杂模板完全变性。
3.5.7解链温度和时间(MeltingTemperaturesandTimes)
68-75℃,30-120sec。
通常将加热变性使50%的双链DNA解链的温度称为DNA的解链温度或熔解温度,用Tm表示。
影响解链温度的因素是样品的总质量和浓度。
有一些方法可以计算解链温度,但只是估计,实验所需的最优温度还需要结合经验来尝试。
时间方面则需要考虑PCR仪的升温降温过程,以及PCR仪是根据样品温度来计算时间,还是仅根据仪器孔的温度来计算时间。
对于<
=20bp的引物,Tm=[4℃(G+C)+2℃(A+T)];
对于>
20bp的引物,Tm=62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length。
3.5.8退火(Annealing/Hybridization)
37-65℃(一般是比Tm低5℃),10-120sec。
LAPCR的退火时间可以估算为:
60sec+(2.5sec/100bp)。
1、提高退火温度(2-5℃)可以降低非特异匹配的几率。
2、缩短退火时间,因为过长的退火时间通常不会提高产量,反而会增加错误匹配的几率。
3.5.9延伸(Extension/Polymerization)
72℃,60-120sec。
通常使用的DNA聚合酶的延伸速率是每秒50个核苷酸,因此如果PCR产物不超过400bp,最好将延伸时间控制在15秒以内。
较长的PCR产物需要相应较长的延伸时间。
LAPCR延伸时间可以估算为:
3.5.10循环数(Cycles)
25-50个循环。
通常,每个PCR循环包括变性、退火和延伸三步。
但根据聚合酶和PCR仪的不同,三步有时可以减至两步。
在一定循环数内,PCR产量与循环数成指数关系,但由于平台效应的存在,增加循环数不一定会提高产量和特异性。
1、减少循环数,2、缩短循环长度。
对于较大片段(>
1kb),增加每步的持续时间。
3.5.11反应体积(ReactionVolumes)
20-100μL(对于0.5mL离心管)。
5μL的体系也可以成功反应。
大体系不易有效地加热或冷却,小体系虽然可以迅速变温,但产量太低。
反应管的形状、管壁厚度以及在PCR仪中的摆放位置都会影响达到预定温度所需的时间。
另外,有的PCR仪以仪器孔的温度为准,还有的PCR仪以样品温度为准。
如果是后者,最好配合使用薄壁的、较小的反应管。
增加反应体系。
如果使用较大体系,可以添加油盖来减少蒸发和内部的冷凝,一般PCR仪的热盖可以发挥这样的作用。
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